一种优化的植物病毒接种方法
【专利摘要】本发明提供了一种优化的利用农杆菌接种植物病毒的方法。本方法针对能在农杆菌中复制的植物病毒侵染性克隆，其原理是将携带植物病毒的侵染性克隆转化农杆菌，利用农杆菌可以通过自然孔口和微伤口侵染植物这一特性，在普通烟四叶一心期到六叶一心期利用OD600值为0.2-0.3的农杆菌喷雾接种，形成系统侵染。本方法操作简单、成本低、效率高，适合在田间大规模应用，可用来接种植物病毒弱毒疫苗以保护植株免受病毒病的侵害，也可用来接种植物病毒载体，进而在植物体内表达外源蛋白。
【专利说明】一种优化的植物病毒接种方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物保护和植物病毒基因工程领域，提供了一种优化的植物病毒接种 方法，具体是一种利用农杆菌大规模接种病毒的方法。
【背景技术】
[0002] 通过基因工程手段，可以构建植物病毒的侵染性cDNA克隆，进而利用反向遗传学 技术明确调控病毒致病力的分子机制，由此获得的弱毒株系可作为弱毒疫苗用来保护植株 免受强毒株系的危害；也可以把病毒的侵染性cDNA克隆改造成植物表达载体，用来生产动 物疫苗、抗病毒蛋白等高附加值的外源蛋白。
[0003] 限制植物病毒弱毒疫苗和表达载体应用的一个重要瓶颈是目前没有适合在田间 大规模接种的技术。根据不同植物病毒侵染性克隆的特点，可以通过基因枪接种，摩擦接种 或是农杆菌浸润等方法接种供试植物。基因枪接种需要昂贵的实验器材，操作复杂，每批次 可接种的植株数量极少。摩擦接种和农杆菌浸润不需要复杂的仪器，但每批次可接种的植 株数量也非常有限。这些方法只适合在实验室内应用，不能满足田间大规模接种的需要。
[0004] 因此，生产中急需开发简便高效、适合植物病毒弱毒疫苗与表达载体大规模接种 的方法。
【发明内容】
[0005] 针对现有接种方法无法满足植物病毒弱毒疫苗与表达载体田间大规模接种需要 这一问题，本发明提供了 一种优化的适合田间大规模接种需要的病毒接种方法。
[0006] 本发明主要是针对能在农杆菌中复制的侵染性克隆，利用了农杆菌在自然界可以 通过自然孔口和伤口侵入植物这一现象，以接种细菌的方式来接种病毒。其包括如下步骤： 将植物病毒弱毒疫苗与植物病毒表达载体转化农杆菌，经过培养后离心收集菌体，重悬后 稀释到一定浓度，通过叶片喷雾的方式将菌体喷布到植物叶片表面。农杆菌可以通过自然 孔口（例如气孔）和微伤口侵染植物，从而将病毒基因组带入植物细胞，使病毒在植物细胞 内增殖并形成系统侵染。
[0007] 本发明实施的具体技术方案是：将待接种病毒的侵染性克隆转化农杆菌，培养后 离心收集农杆菌菌体，将其稀释到〇D 6(?值为0. 2-0. 3,通过叶面喷施农杆菌接种植物病毒。 接种烟草的最佳时期为四叶一心期至六叶一心期。
[0008] 本方法操作简单、成本低、效率高，不需要特殊的仪器设备，适合在科研温室、育苗 公司的育苗棚或大田应用，可在短时间内接种大量植株。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1采用本发明方法接种烟草脉带花叶病毒侵染性克隆pCamTVBMV-GFP15天后普 通烟的症状（A)及绿色荧光蛋白表达情况（B)
[0010] 图2利用本发明在普通烟三叶一心期喷雾结果示意图
[0011] 图中A为接种后第六天，在紫外灯下可见普通烟叶片出现零星荧光斑点；B为接种 后第七天，荧光斑点数目增加；C为接种后第八天，荧光斑点面积逐渐矿大，病毒通过叶脉 向其它部位扩展；D为接种后第十天，普通烟上部叶片布满绿色荧光。
[0012] 图3利用本发明在普通烟四叶一心期喷雾结果示意图
[0013] 图中A、B、C、D分别为接种后第六天、第七天、第八天和第十天，病毒在普通烟植株 上的扩展情况。
[0014] 图4利用本发明在普通烟六叶一心期喷雾结果示意图
[0015] 图中A、B、C、D分别为接种后第六天、第七天、第八天和第十天，病毒在普通烟植株 上的扩展情况。
[0016] 图5利用本发明接种的弱毒株系DDK对强毒株系的交叉保护效果
[0017] 图中A为先用喷雾法接种弱毒株系然后再接接种强毒株系的植株，几乎看不到症 状；B为直接接种强毒株系的植株，产生严重的花叶症状。
【具体实施方式】
[0018] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容做进一步的详细说 明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
[0019] 实施例1 :证明农杆菌喷雾可系统侵染普通烟并表达外源蛋白（以绿色荧光蛋白 GFP为例）
[0020] 1.病毒侵染性克隆转化农杆菌
[0021] 从_80°C冰箱中取出一管农杆菌GV3101的感受态细胞（100-200μ 1)，冰上解冻。 解冻后加入100_300ng病毒侵染性克隆pCamTVBMV-GFP质粒。放入液氮中冷冻l-5min，取 出后立即放入37°C水浴中5min。
[0022] 加入800 μ 1无抗生素的LB培养液，28°C摇床培养3h。5000r/min离心收集菌体， 离心管中保留约200 μ 1培养液并重新悬浮菌体。
[0023] 在超净台上将菌体均匀涂布于含抗生素（本实验中为卡那霉素、利福平霉素和四 环素）的固体培养基平板，28°C培养2天，直至出现菌落。挑取单菌落进行PCR鉴定，证明 菌落中含有病毒侵染性克隆PCamTVBMV-GFP。
[0024] 2.农杆菌的培养
[0025] 经菌落PCR验证后，挑取单菌落接种于含有50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml利福平 霉素和5 μ g/ml四环素的5ml液体LB中。28°C振荡培养24小时。
[0026] 将5ml培养后菌液加至200ml含10mmol/L2- (N-吗啉）-乙基磺酸（MES)和 20 μ mol/L乙酰丁香酮（AS)及相应抗生素（浓度与上述步骤相同）的LB液体培养基中，于 28°C振荡培养24小时。将培养好的菌液以10000r/m离心1分钟，收集菌体后悬浮于农杆 菌重悬溶液中（10mm〇l/L MgCl2，10mmol/L MES，0.15mmol/L AS)，调整浓度使其 0D6QQ 值为 0.4左右，室温静置3h。
[0027] 3.寄主植物接种及结果观察
[0028] 将携带侵染性克隆pCamTVBMV-GFP的农杆菌菌体悬浮液装入喷壶（300ml)，选取 三叶一心至四叶一心的普通烟五棵，以喷雾器喷嘴距叶片10 - 30cm处均匀喷施。处理后 植株置于25°C光照培养箱中培养（16h光照/8h黑暗交替）。十五天后在白光及紫外灯下 观察烟草发病情况及绿色荧光的有无与分布。
[0029] 结果表明，喷雾接种十五天后，所有普通烟植株均出现轻微的脉带花叶症状， 在紫外灯下可以看到强烈的绿色荧光（图1)。说明通过农杆菌喷雾把侵染性克隆 pCamTVBMV-GFP接种到普通烟上形成系统侵染，并大量表达外源的绿色荧光蛋白GFP。
[0030] 实施例2 :最佳菌液浓度以及最佳喷雾时期优化
[0031] 1.病毒侵染性克隆转化农杆菌，采取液氮冻融法。
[0032] 从-80°C冰箱中取出1管农杆菌GV3101的感受态细胞（100-200μ 1)，冰上解冻。 解冻后加入100_300ng病毒侵染性克隆pCamTVBMV-GFP质粒。放入液氮中冷冻l-5min。取 出后立即放入37°C水浴中5min。
[0033] 加入800 μ 1无抗生素的LB培养液，28°C摇床培养3h。5000r/min离心收集菌体， 离心管中保留约200 μ 1培养液并重新悬浮菌体。
[0034] 在超净台上将菌体均匀涂布于含抗生素（本实验中为卡那霉素、利福平和四环 素）的固体培养基平板，28°C培养2天，直至出现菌落。挑取单菌落进行PCR鉴定，证明菌 落中含有病毒侵染性克隆PCamTVBMV-GFP。
[0035] 2.农杆菌的培养
[0036] 经菌落PCR验证后，挑取单菌落接种于含有50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml利福霉 素和5 μ g/ml四环素的5ml液体LB中。28°C振荡培养24小时。
[0037] 将5ml培养后菌液加至200ml含10mmol/L2- (N-吗啉）-乙基磺酸（MES)和 20 μ mol/L乙酰丁香酮（AS)及相应抗生素（浓度与上述步骤相同）的LB液体培养基中，于 28°C振荡培养24小时。将培养好的菌液以10000r/m离心1分钟，收集菌体后悬浮于农杆 菌重悬溶液中（10mm〇l/L MgCl2，10mmol/L MES，0.15mmol/L AS)。将悬浮液设置为5个浓 度梯度，使其〇D6(?值分别为0. 1、0. 2、0. 3、0. 4和0. 6,室温静置3h。
[0038] 3.最佳接种浓度及时期的筛选
[0039] 将携带侵染性克隆pCamTVBMV-GFP的农杆菌悬浮液装入喷壶（300ml)，分别选取 三叶一心、四叶一心和六叶一心的普通烟各三棵，以喷雾器喷嘴距叶片10 - 30cm处均匀喷 施。处理完的植株放置25°C光照培养箱中培养（16h光照/8h黑暗交替）。第六天至第十 每天在紫外灯下观察结果，统计各处理普通烟侵染点数目。
[0040] 结果表明，在普通烟三叶一心期、四叶一心期和六叶一心期喷雾都可以成功接种 病毒（图2、图3、图4)。在农杆菌0D 6(?为0. 1 - 0. 4时，接种菌液浓度越高，产生的斑点越 多，〇D6(?值为0. 4和0. 6时侵染点数目差别不大。喷雾时烟草叶龄越大，绿色荧光斑点越 多。在普通烟四叶一心期和六叶一心期时喷雾接种，即便农杆菌〇D_为0. 1也很容易接种 成功；若在三叶一心期接种，农杆菌〇D6(?值需要达到0. 2以上。考虑到田间生产中的实际 情况，最佳接种时期为普通烟四叶一心期到六叶一心期，菌液浓度〇D_值为0. 2-0. 3。
[0041] 实施例3 :利用农杆菌喷雾接种病毒的弱毒疫苗
[0042] 1.病毒侵染性克隆转化农杆菌，采取液氮冻融法。
[0043] 从-80°C冰箱中取出一管农杆菌GV3101的感受态细胞（100-200 μ 1)，冰上解冻。 解冻后加入100-300ng烟草脉带花叶病毒弱毒株系DDK质粒。放入液氮中冷冻l-5min，取 出后立即放入37°C水浴中5min。
[0044] 加入800 μ 1无抗生素的LB培养液，28°C摇床培养3h。5000r/min离心收集菌体， 离心管中保留约200 μ 1培养液并重新悬浮菌体。
[0045] 在超净台上将菌体均匀涂布于含抗生素（本实验中为卡那霉素、利福平霉素和四 环素）的固体培养基平板，28°C培养2天，直至出现菌落。挑取单菌落进行PCR鉴定，证明 菌落中含有TVBMV弱毒株系DDK。
[0046] 2.农杆菌的培养
[0047] 经菌落PCR验证后，挑斑接种于含有50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml利福平霉素和 5 μ g/ml四环素的5ml液体LB中。28°C振荡培养24小时。
[0048] 将5ml培养后菌液加至200ml含10mmol/L2- (N-吗啉）-乙基磺酸（MES)和 20 μ mol/L乙酰丁香酮（AS)及相应抗生素（浓度与上述步骤相同）的LB液体培养基中，于 28°C振荡培养24小时。将培养好的菌液以10000r/m离心1分钟，收集菌体后悬浮于农杆 菌重悬溶液中（10mm〇l/L MgCl2，10mmol/L MES，0.15mmol/L AS)，调整浓度使其 0D6QQ 值为 0.2-0. 3,室温静置3h。
[0049] 3.接种寄主植物及交叉保护效果
[0050] 将0D6(?值为0. 2-0. 3、携带TVBMV弱毒株系DDK的农杆菌菌体悬浮液装入喷壶 (300ml)，选取五叶一心的普通烟植株，以喷雾器喷嘴距叶片10 - 30cm处均匀喷施。处理 完的植株放置25°C光照培养箱中培养（16h光照/8h黑暗交替）。15天后摩擦接种TVBMV 强毒株系，攻毒25天后观察症状。
[0051] 结果发现，接种强毒株系25天后，直接接种强毒株系的烟草叶片上表现出严重的 脉带花叶症状，而预接种弱毒株系DDK后再接种强毒株系的烟草叶片上没有明显症状，弱 毒株系对强毒株系表现出良好的交叉保护效果（图5)。说明通过农杆菌喷雾接种植物病毒 的弱毒株系用以保护植物免受强毒株系的危害是可行的。
【权利要求】
1. 一种优化的植物病毒接种方法。其特征在于：将待接种病毒的侵染性克隆转化农杆 菌，培养后离心收集农杆菌菌体，将其稀释到〇D_为0. 2-0. 3,通过叶面喷雾在烟草四叶一 心期到六叶一心期接种。
2. 如权利要求1所述方法，在利用植物弱毒疫苗保护植株免受强毒株系侵染以及利用 植物病毒载体表达外源蛋白方面的应用。
【文档编号】A01G7/06GK104152487SQ201410263717
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】李向东, 刘锦, 丛倩倩, 高瑞 申请人:山东农业大学