一种对果蝇实施低温麻醉的方法
【专利摘要】一种对果蝇实施低温麻醉的方法，属于遗传学及发育生物学【技术领域】。通过该方法可以实现对遗传学中重要模式生物果蝇的高生物安全性和环境友好性的麻醉，该麻醉操作简单，果蝇麻醉时间可控，麻醉后果蝇的寿命及繁殖能力不受影响。其是在-15摄氏度～-5摄氏度的环境温度下对果蝇进行麻醉，麻醉时间为25～35秒，然后将麻醉后的果蝇转移到0摄氏度～5摄氏度的环境温度中，20分钟内完成对果蝇的后续观测与操作；最后将果蝇转移到室温环境下，实现果蝇的苏醒、后续培养及观测。本发明通过程序化控制环境温度，在保证果蝇处于麻醉状态之余，避免果蝇体内因低温时间过长形成冰晶而损害果蝇的生理健康、寿命和繁殖能力。
【专利说明】一种对果蝇实施低温麻醉的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于遗传学及发育生物学【技术领域】，具体涉及一种对果蝇实施低温麻醉的方法，通过该方法可以实现对遗传学中重要模式生物果蝇的高生物安全性和环境友好性的麻醉，该麻醉操作简单，果蝇麻醉时间可控，麻醉后果蝇的寿命及繁殖能力不受影响。
【背景技术】
[0002]黑腹果蚬(Drosophilamelanogaster),昆虫纲，双翅目，果蚬科。是目前人类研究的最彻底的生物之一，它本身具有繁殖快、代时短、子代多等特点，基因测序已完成，是重要的遗传学研究模式生物，在遗传学实验教学及科研中具有重要的地位。以果蝇为对象的科研及教学活动中需要对果蝇进行麻醉，麻醉后的果蝇可以通过人工筛选进行多种后续实验和研究。麻醉技术需要兼顾动物从接触麻醉操作到失去运动能力的时间(麻醉时间)，动物保持麻醉状态的时间(麻醉持续时间)、动物脱离麻醉状态的时间(苏醒时间)，动物经过麻醉操作后的生存能力(存活率)。
[0003]目前国内及国际上对果蝇的麻醉方法主要有5种，乙醚麻醉、乙醇麻醉、乙酸乙酯麻醉、二氧化碳麻醉以及低温麻醉。
[0004]国内目前普遍采用乙醚麻醉技术实现果蝇的麻醉，乙醚麻醉技术较为传统和经典，但是随着科学技术的发展，乙醚麻醉的缺点及安全隐患逐渐显现，具体体现为:1)乙醚是一种麻醉剂，在使用过程中除可以麻醉果蝇之外，对操作者身体健康有一定危害，容易造成操作者头晕、恶心等中毒症状；2)乙醚是一种易挥发易燃易爆有机试剂，其密度大于空气，即使保持实验过程 中的良好通风，也不能完全避免乙醚对实验操作者的伤害和燃爆隐
[0005]国际上目前普遍采用二氧化碳麻醉技术实现果蝇的麻醉，二氧化碳是较为成熟的果蝇麻醉方法，目前有二氧化碳果蝇麻醉枪，有相关的试验设备及操作方法，但是需要的设备成本较高，而且二氧化碳比重大于空气，且属于呼吸抑制剂，操作过程中同样需要保证实验环境良好通风，并且要求实验过程中随时监控环境二氧化碳浓度，或者氧浓度，生物安全度和环境友好性不足。
[0006]乙醇麻醉时果蝇的个体差异较为明显，难于进行标准化操作和推广；乙酸乙酯麻醉与乙醚麻醉效果及局限性相似，同样存在因挥发性较大，对实验操作者身体有损伤，生物安全性及环境友好度不够的缺点。
[0007]与上述果蝇麻醉方法相比，低温麻醉具有环境友好性和安全性，有研究指出黑腹果蝇具有较好的低温抗性，研究中发现低温可以诱使黑腹果蝇出现麻醉症状，低温麻醉的黑腹果蝇可以在室温下苏醒，存活并可以产生后代。目前对果蝇进行低温麻醉时，需要先将果蝇麻醉瓶长时间放置在低温环境中，果蝇麻醉后在室温下迅速苏醒(时间小于120秒)，果蝇保持在麻醉状态时间过短，苏醒过快，不利于以果蝇为对象的科研及教学活动的进行，所以到目前为止没有果蝇的低温麻醉技术及设备投入科研及教学使用。关于果蝇的低温研究，目前主要集中在驯化果蝇适应低温，利用低温对果蝇进行保存和收藏。[0008]这种情况下，探索可适用于多数生物实验室的、安全有效的果蝇麻醉方法，消除生物实验室潜在的安全隐患，具有重要的意义。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种果蝇麻醉方法，该麻醉方法利用果蝇骤然进入低温环境时的“假死”，离开低温环境后迅速恢复活动能力的生理机制，对果蝇实现麻醉时间可控的麻醉操作，为以果蝇为对象的科研和教学工作提供生物安全的、环境友好的果蝇麻醉方法。
[0010]本发明是通过设置一种程序化的低温操作流程，实现果蝇的迅速麻醉、麻醉状态保持、以及麻醉状态解除的果蝇麻醉方法。通过程序化控制环境温度，在保证果蝇处于麻醉状态之余，避免果蝇体内因低温时间过长形成冰晶而损害果蝇的生理健康、寿命和繁殖能力。
[0011]本发明具体实现方法如下:
[0012]I)在-15摄氏度~-5摄氏度的环境温度下对果蝇进行麻醉，麻醉时间为25~35秒；
[0013]2)然后将麻醉后的果蝇转移到O摄氏度~5摄氏度的环境温度中，20分钟内完成对果蝇的后续观测与操作；
[0014]3)最后将步骤2)的果蝇转移到室温环境下，实现果蝇的苏醒、后续培养及观测。
[0015]前面方法步骤I)中所述的-15摄氏度~-5摄氏度的环境温度以及步骤2)中所述的O摄氏度~5摄氏度的 环境温度可以通过压缩机制冷或半导体制冷实现，环境温度传递及维系的冷媒可以是空气也可以是溶液；溶液包括水，水与甲醇、乙醇、乙二醇、甘油、氯化钙、磷酸二氢盐或亚硅酸盐等化学物质的混合溶液，混合溶液中的各个组成成分的比例可以参考相关的物理化学手册。
[0016]一般情况下，果蝇保存在培养瓶中。当将果蝇进行麻醉时，需要将果蝇从原来的培养瓶中按照标准操作转移到麻醉瓶内。所述的标准操作是:首先轻敲果蝇培养瓶使得培养瓶内果蝇落到培养瓶底部，迅速打开培养瓶塞子，将培养瓶与麻醉瓶的瓶口对接，保持瓶口对接状态使得麻醉瓶垂直立于培养瓶之下，麻醉瓶瓶口垂直向上，培养瓶瓶口向下，轻敲麻醉瓶，果蝇落到麻醉瓶底部，迅速移开果蝇培养瓶，将麻醉瓶塞子塞好，从而完成果蝇转移到果蝇麻醉瓶中的操作。麻醉瓶、培养瓶一般是玻璃的。
[0017]上述方法中，步骤2)是在O摄氏度~5摄氏度的实验操作台面上完成对果蝇的后续观测与操作，这里的观测即对果蝇遗传状态进行观测，主要包括果蝇眼睛(红眼、白眼、棒眼)、翅膀(长翅、残翅、小翅)、体色(黑檀体、黑体、黄身)、刚毛(直刚毛、焦刚毛)等；所述的操作包括对上述各种遗传状态的果蝇进行分别计数、测量果蝇体长、称量果蝇体重、分辨及选择雌雄果蝇等。
[0018]与【背景技术】相比:
[0019]I)本发明所述的程序化低温果蝇麻醉技术避免采用具有易燃、易挥发性质的有机试剂作为麻醉剂，避免了麻醉剂使用时的安全隐患和对操作人员的身体伤害；
[0020]2)程序化低温果蝇麻醉技术在麻醉果蝇时采用的环境温度低于零摄氏度，不需要对果蝇麻醉瓶进行长时间预冷，提高了实验操作的效率，降低了实验操作的难度，使得果蝇在近生理的条件下骤遇低温，生理性触发果蝇的“假死”机制，时间进程小于30秒，以麻醉后的果蝇的寿命和繁殖能力做考察对象，证实该低温环境对果蝇生理机能影响降至最低；[0021 ] 3)程序化低温果蝇麻醉技术将麻醉后的果蝇放置在O~5摄氏度温度区间的微型环境中不大于20分钟，确保对麻醉后的果蝇有充分的时间进行后续操作与观测，以麻醉后的果蝇的寿命和繁殖能力做考察对象，证实该温度下该时间段内，环境温度对果蝇生理机能影响降至最低；
[0022]4)完成麻醉状态下操作的果蝇转移到常温培养瓶中，自然恢复果蝇环境温度，实现果蝇苏醒，果蝇苏醒快速，寿命和繁殖能力不受程序低温麻醉操作影响。
【具体实施方式】
[0023]实施例1
[0024]根据表1和具体果蝇麻醉后操作时间需要，按照果蝇低温麻醉环境温度的需求进行冷媒选择和冷媒含量计算。本实施例中选择乙醇-水混合物作为冷媒,通过乙醇的不同添加量，可以实现不同的冷媒最低传质温度。计算公式为AT = -1.86XbB，其中bB为一千克水中添加的乙醇的摩尔数，AT为冷媒理论最低传质温度，而所设置的低温麻醉温度(即果蝇麻醉瓶所处冷媒提供的环境温度)要比冷媒理论最低传质温度高2~3摄氏度。
[0025]如在I千克水中添加10.16摩尔乙醇即配制36.1 %的乙醇-水溶液，就可以实现-18.9摄氏度的冷媒理论最低传质温度，以乙醇-水混合物作为冷媒能保证在我们进行果蝇麻醉操作时(-15摄氏度~-5摄氏度)冷媒体系稳定且不结冰。本实施例中，按照表1中所示乙醇-水混合冷媒的乙醇体积百分比含量配制各个操作温度下的冷媒，进行后续温度相关研究。
[0026]表1表明了果蝇 分别在O摄氏度、-5摄氏度、-10摄氏度及-15摄氏度麻醉30秒后转移到室温环境下的苏醒时间和苏醒后培养24小时的存活情况，如表1所示，麻醉30秒时，在各个温度下(除O摄氏度外)果蝇都能被全部麻醉，而麻醉后的果蝇转移到室温后苏醒所需时间的长短与果蝇麻醉温度有关。100秒到250秒后，苏醒的果蝇就会进行运动与飞行。进行果蝇的观测与操作时，观测与操作的时间不能大于果蝇苏醒所需要的时间，100秒到250秒的观测与操作时间，很难满足多数操作者的操作需求。本发明中对果蝇进行麻醉的温度应该在-15摄氏度~-5摄氏度之间。
[0027]实施例2
[0028]表2表明了果蝇麻醉后在O摄氏度、-5摄氏度、-10摄氏度及-15摄氏度继续保持600秒(10分钟)及1200秒(20分钟)后立即转移到室温时的果蝇苏醒所需时间及果蝇的24小时存活率。如表2所示，除O摄氏度外，虽然保存温度降低后，果蝇在室温的苏醒时间也有所延长，但是果蝇也随着保存温度的降低出现死亡现象，果蝇死亡不利于以果蝇为实验对象的后续研究。
[0029]实施例3
[0030]如表1、表2所示，无论是将麻醉后的果蝇立即转移到室温后，还是将果蝇麻醉后再保持一定时间，都不能够满足以果蝇为实验对象的后续研究工作(一个是苏醒时间短，一个是果蝇存活率低)。
[0031]因此，我们发展了本发明所述的新的果蝇麻醉技术，即将果蝇低温麻醉后，再放置在O~5摄氏度的低温环境内保持一段时间(如表3)，进行后续观测与操作后，再放入室温环境实现果蝇的苏醒。操作人员可以根据自身实验技术及实验操作所需要的操作时间，选择果蝇麻醉温度(-5摄氏度、-10摄氏度及-15摄氏度)、麻醉后果蝇的低温保温温度(O~5摄氏度)及低温保温时间(10~20分钟)。
[0032]具体的技术方案如下:
[0033]1、通过控制在水中加入乙醇的量来实现对环境温度的控制，从而实现O摄氏度、-5摄氏度、-10摄氏度或-15摄氏度冷媒环境的程序控温；
[0034]2、将果蝇从培养瓶中按照标准操作转移到麻醉瓶中，将麻醉瓶装载在由热的不良导体材料构建的果蝇麻醉瓶托架上，通过托架将果蝇麻醉瓶迅速浸入上述不同温度的冷媒中，保证麻醉瓶从浸入冷媒到离开冷媒的时间为30秒；
[0035]3、将麻醉瓶内的果蝇迅速转移到温度为O~5摄氏度的果蝇操作台上，在20分钟内完成对果蝇的后续操作和观测。
[0036]对于一般的遗传学实验而言，果蝇在零下5摄氏度麻醉其麻醉时间和苏醒时间基本可以满足实验操作所需，此时按照表1所示，冷媒中的乙醇体积百分比含量为18~20 %，此浓度的乙醇不具有燃烧、爆炸等潜在危险，也不具有环境威胁性，具有较高的生物安全性和环境友好性。
[0037]表1:实施例1的低温-瞬时麻醉效果对比
[0038]
【权利要求】
1.一种对果蝇实施低温麻醉的方法，其步骤如下: 1)在-15摄氏度~-5摄氏度的环境温度下对果蝇进行麻醉，麻醉时间为25~35秒； 2)然后将麻醉后的果蝇转移到O摄氏度~5摄氏度的环境温度中，20分钟内完成对果蝇的后续观测与操作； 3)最后将步骤2)的果蝇转移到室温环境下，实现果蝇的苏醒、后续培养及观测。
2.如权利要求1所述的一种对果蝇实施低温麻醉的方法，其特征在于:所述的环境温度是通过压缩机制冷或半导体制冷实现的，环境温度传递及维系的冷媒是空气或溶液。
3.如权利要求2所述的一种对果蝇实施低温麻醉的方法，其特征在于:溶液为水、水与甲醇、水与乙醇、水与乙二醇、水与甘油、水与氯化钙、水与磷酸二氢盐或水与亚硅酸盐的混合溶液。
4.如权利要求1所述的一种对果蝇实施低温麻醉的方法，其特征在于:步骤2)是在O摄氏度~5摄氏度的实验 操作台面上完成。
【文档编号】A01K67/033GK104012475SQ201410267683
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】周杰, 张雪兰, 刘艳, 吕明, 孟令军, 权宇彤, 王亚文, 孟庆繁, 滕利荣 申请人:吉林大学