四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法
【专利摘要】本发明公开了一种四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，该方法为：首先确定二倍体矮牵牛减数分裂前期Ⅰ时花蕾大小与形态特征以掌握最佳处理时期，诱导处理时最适宜的秋水仙素浓度和处理次数等因素，掌握矮牵牛2n花粉与n花粉大小、外观特征以快速区分鉴定，对矮牵牛杂交后代植株倍性较为实用简易的细胞学鉴定方法。采用本发明育种方法，所获得的有性多倍化杂交F1不但具有母本多倍体器官巨大性的特点，还具有一些来自二倍体父本的遗传性状，与无性多倍化途径获得的同源四倍体相比，具有更广泛的遗传多样性、更高的观赏性和结籽率。
【专利说明】四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法
【技术领域】
[0001]本发明属于园艺植物育种领域，具体涉及到一种四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法。
【背景技术】
[0002]植物多倍体是指体细胞中含有三个或三个以上染色体组，因具有巨大性、抗逆性强、结实性低和营养成分高等特点而得到广泛应用，多倍体育种在现代育种中具有广阔前景，目前人工诱导植物多倍体主要有无性多倍化和有性多倍化二种方法。
[0003](I)无性多倍化(Somatic polyploidizat1n),染色体加倍发生在有丝分裂过程中，即由染色体加倍的体细胞发育成多倍体植株。常见的诱导方式是物理和化学方式。物理方式有温度激变、机械创伤、电离辐射、非电离辐射、离心力、热冲击、X和Y射线等；化学方式多为药剂诱导，主要有秋水仙素、吲哚乙酸、萘骈乙烷、芫荽脑、苯及其衍生物、有机砷制剂、有机汞制剂(富民隆)等。秋水仙素是最为有效的化学诱导剂，它与正在有丝分裂的细胞接触后，即可抑制微管的聚合过程，不能形成纺锤丝，使染色体不能排在赤道板上，也不能分向细胞的两极，从而产生染色体加倍的细胞核，常处理种子、子叶、幼苗生长点等部位，一般为浸种和滴涂生长点。目前已在许多园艺植物种中通过秋水仙素诱变获得了人工多倍体，培养出多倍体苹果、柑橘、葡萄、金丝小枣、西瓜、白菜、黄瓜、番茄、不结球白菜、花椰菜、芹菜、萝卜、金鱼草、百合、香石竹、君子兰等。本申请第一发明人曾于2005年利用秋水仙素化学诱导二倍体矮牵牛 ，通过无性多倍化途径经过多年选择鉴定，培育出同源四倍体新品种‘红霞’，该品种于2012年10月通过江苏省农作物品种审定委员会鉴定通过(证书编号:2012-2-9)。与原有二倍体植株相比较，具有花期延长、花瓣增大和边缘褶皱等观赏性增强的特点，同时植株叶片增厚、长势增强，抗逆境能力也增加，显示了矮牵牛多倍体育种具有较好的生产实践利用前景和研究价值。
[0004]但是通过无性多倍化途径形成的多倍体植株往往存在着混倍体、嵌合体等现象，诱变后代与母本的遗传特性差异小后代变异率低，对优良单株选择不利，此外由于无性多倍化后结实率显著降低对于结籽率低的有性繁殖品种不宜采用。
[0005](2)有性多倍化(Sexual polyploidizat1n)。有性多倍化是相对无性有丝分裂过程染色体加倍而言的，其途径是诱导二倍体减数分裂紊乱产生2n配子参与受精而形成多倍体。有研究表明2n配子在植物进化过程中起着非常重要的作用，在传递杂合性和上位性中具有特殊的价值。但对一年生草本花卉矮牵牛尚无有性多倍化的发明专利报道。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，采用该方法能得到遗传多样性、结籽率高的四倍体矮牵牛。
[0007]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为:一种四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，该方法包括如下步骤:
[0008](I) 二倍体矮牵牛减数分裂前期I时花蕾大小的确定；
[0009](2)当花蕾长度为2.5-3.0mm时进行2η雄配子的诱导，得到的含有2η花粉的二倍体矮牵牛作为父本；其中父本2η花粉的染色体数为2χ = 14 ;
[0010](3)有性多倍化杂交:以四倍体矮牵牛为母本，并对母本进行去雄处理，去雄处理后的母本与步骤(2)中的父本进行授粉杂交；得到F1 ；
[0011](4)杂交后RF1倍性的鉴定:第二年春季播种F1种子，成株后进行农艺性状、解剖学鉴定，鉴定后选取配子染色体数目2χ = 14的植株即为通过有性多倍化途径获得的新四倍体种质。
[0012]有益效果:采用本发明育种方法，所获得的有性多倍化杂交F1不但具有母本多倍体器官巨大性的特点，还具有一些来自二倍体父本的遗传性状，与无性多倍化途径获得的同源四倍体相比，具有更广泛的遗传多样性、更高的观赏性和结籽率。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为未诱变处理的二倍体父本‘梦幻’的η花粉；
[0014]图2为2η与η花粉同时存在于经秋水仙素诱导的二倍体父本‘梦幻’花粉；
[0015]图3匕花粉母细胞减数分裂后期II中一极(箭头示)染色体数目2x = 14 ;
[0016]图4叶片比较图；左为二倍体父本‘梦幻’，右为杂交后代四倍体F1 ；
[0017]图5花药和柱头比较(左为未经秋水仙素诱变处理二倍体父本‘梦幻’对照，中为杂交后代四倍体匕，右为四倍体母本‘红霞’)；
[0018]图6气孔比较图；左为二倍体父本‘梦幻’，右边的为杂交后代四倍体F1 ；
[0019]图7花瓣比较图；左为母本四倍体‘红霞’，右为杂交后代四倍体F1 ；
[0020]图8植株形态:左上为二倍体父本‘梦幻’，左下为杂交后代四倍体F1，右为四倍体母本‘红霞’。
【具体实施方式】
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[0021]下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0022]实施例1:一种四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，方法包括如下步骤:
[0023](1) 二倍体矮牵牛减数分裂前期I时花蕾大小的确定:晴天上午8:00至10:00取二倍体矮牵牛幼小花蕾，测量其长度后用卡诺氏固定液固定24h，经体积浓度为90%、体积浓度为80%乙醇梯度脱水最后转入体积浓度为70%乙醇4°C下保存备用；用1 N盐酸60°C恒温水浴花蕾约2-3min，蒸馏水冲洗3_4次，从花蕾中剥取花药，用质量浓度为I %醋酸洋红染色常规染色、压片，火焰拷片2s分色，在100倍油镜下对花粉母细胞减数分裂期进行观察，确定前期I时花蕾的长度；其中卡诺氏固定液是由无水乙醇与冰醋酸按体积比为3:1混合制得。
[0024](2)当花蕾长度为2.5-3.0mm时进行2n雄配子的诱导，得到的含有2n花粉的二倍体矮牵牛作为父本；其中父本2n花粉的染色体数为2x = 14 ;具体方法为:采用秋水仙素溶液处理花蕾时间为早晨8:00-10:00，处理温度25°C _32°C，诱导二倍体矮牵牛产生2n花粉的秋水仙素溶液质量浓度分别为0.1^^0.2^^0.3%,在二倍体矮牵牛花蕾(不包括萼片)长度为2.5-3.0mm时进行处理，采用微量注射法，将注射器针头深入花蕾中注射9-1IL秋水仙素溶液，每天处理I次，分别进行1、2、3天处理，开花后套袋隔离，以未诱变处理二倍体植株为对照；然后取花粉粒于载玻片上质量浓度为I %醋酸洋红染色3min后，在40倍镜下用显微测微尺测量花粉的直径并结合外观特征确认2n花粉，统计2n花粉百分率，表1中9个处理中确定以浓度0.2%秋水仙素处理I次效果最好，2n花粉率可达29.3%，为对照1.3%的22.5倍。其中2n花粉百分率的计算公式为:
[0025]2n花粉百分率=2n花粉数/花粉总数X 100%。
[0026]表1 9种秋水仙素处理诱导2n花粉效果的比较
[0027]
【权利要求】
1.一种四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: (1)二倍体矮牵牛减数分裂前期I时花蕾大小的确定； (2)当花蕾长度为2.5-3.0mm时进行2η雄配子诱导，得到的含有2η花粉的二倍体矮牵牛作为父本；其中父本2η花粉的染色体数为2χ =14 ； (3)有性多倍化杂交:以四倍体矮牵牛为母本，并对母本进行去雄处理，去雄处理后的母本与步骤(2)中的父本进行授粉杂交得到F1 ； (4)杂交后代F1倍性的鉴定:第二年春季播种F1种子，成株后进行农艺性状、解剖学鉴定，鉴定后选取配子染色体数目2χ =14的植株即为通过有性多倍化途径获得的新四倍体种质。
2.根据权利要求1所述的四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，其特征在于，步骤(1)中，于晴天上午8:00至10:00取二倍体矮牵牛幼小花蕾，测量其长度后用卡诺氏固定液固定24 h，经体积浓度为90%、体积浓度为80%乙醇梯度脱水最后转入体积浓度为70%乙醇4°C下保存备用；用1 N盐酸60°C恒温水浴花蕾约2-3 min，蒸馏水冲洗3_4次，从花蕾中剥取花药，用质量浓度为1%醋酸洋红染色常规染色、压片，火焰拷片2s分色，在100倍油镜下对花粉母细胞减数分裂期进行观察，确定前期I时花蕾的长度；其中卡诺氏固定液是由无水乙醇与冰醋酸按体积比为3:1混合制得。
3.根据权利 要求1所述的四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，其特征在于，步骤(2)的操作方法为:采用秋水仙素溶液处理花蕾时间为早晨8:00-10:00，处理温度25°C -32°C,诱导二倍体矮牵牛产生2n花粉的秋水仙素溶液质量浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%，在二倍体矮牵牛花蕾(不包括萼片)为2.5-3.0 mm时进行处理，采用微量注射法，将注射器针头深入花蕾中注射9-lluL秋水仙素溶液，每天处理I次，分别进行1、2、3天处理，开花后套袋隔离，以未诱变处理二倍体植株为对照；然后取花粉粒于载玻片上质量浓度为1%醋酸洋红染色3min后，在40倍镜下用显微测微尺测量花粉的直径并结合外观特征确认2n花粉，统计2n花粉百分率，其中2n花粉百分率的计算公式为: 2n花粉百分率=2n花粉数/花粉总数X 100%。
4.根据权利要求1或3所述的四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，其特征在于，步骤(2)中得到的父本2n花粉形态特征为圆形或近似四边形，直径3 40um，有4个萌发孔，染色体数为2x =14。
5.根据权利要求1所述的四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，其特征在于，步骤(3)中所述的四倍体矮牵牛为‘红霞’。
6.根据权利要求1所述的四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，其特征在于，步骤(4)中解剖学鉴定方法为:于晴天上午8:00-10:00取的植株上长度为2.6-5.8 mm幼小花蕾(不包括萼片)，用卡诺氏固定液固定24 h后，经体积浓度为90%、体积浓度为80%乙醇梯度脱水最后转入体积浓度为70%乙醇4°C下保存备用；用I N盐酸60°C恒温水浴花蕾约2-3 min,蒸馏水冲洗3-4次，从花蕾中剥取花药，用质量浓度为1%醋酸洋红染色常规染色、压片，火焰拷片2s分色，在100倍油镜下对花粉母细胞减数分裂期染色体数目进行计数，选取配子染色体数目2x=14的杂交后代植株即为通过有性多倍化途径获得的新四倍体矮牵牛种质。
【文档编号】A01H1/04GK104067931SQ201410268727
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】魏跃, 王全智, 颜志明, 杨宝林, 董慧, 嵇怡, 贾思振, 史红林 申请人:江苏农林职业技术学院