一种金粟兰快速繁殖的方法
【专利摘要】本发明涉及一种金粟兰的繁育方法，所述的方法包括：1)外植体的选取，2)外植体消毒，3)初始诱导培养，4)愈伤组织诱导，5)增殖培养，6)生根培养，7)炼苗和移栽。采用本方法繁育金粟兰，可以降低生产成本，提高繁殖速度和成活率。
【专利说明】一种金粟兰快速繁殖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物快速繁殖【技术领域】，尤其是金粟兰快速繁殖【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 金粟兰（Chloranthus spicatus)又名珠兰、鱼子兰、茶兰等，为金粟兰科植物，原 产我国南部，喜温暖、潮湿和通风的环境，多生于山坡、沟谷密林下。半灌木，直立或稍平卧， 高30-60厘米。金粟兰生性强健，容易栽培，用分株、扦插和压条繁殖皆可。金粟兰花和根 状茎可提取芳香油，鲜花极香，常用于熏茶叶。全株入药，治风湿疼痛、跌打损伤，根状茎捣 烂可治疗疮。
[0003] 目前，金粟兰多采用分株、扦插和压条来进行生产栽培，这繁育技术提高品种的纯 度，保持了品种特性，但成活率较低及繁殖速度较慢，制约了金粟兰产业的发展。而组织培 养育苗技术既可以保持种的纯度和特性，也可以降低生产成本，提高繁殖速度和成活率。
[0004] 现有技术中尚无经愈伤组织途径获得金粟兰再生植株的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种金粟兰快速繁殖的方法，经愈伤组织途径 获得金粟兰丛生芽，诱导生根，可实现金粟兰组培苗的大量快速繁殖。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提出下列技术方案：
[0007] -种金粟兰快速繁殖的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：
[0008] 1)外植体的选取：取当年生直径2_5mm的金粟兰枝条为外植体，剪去叶片后剪成 l_2cm的莖段；
[0009] 2)外植体消毒：将上述茎段放入盛有自来水的20-25KHZ超声波清洗中保持温度 30-35°C处理30-45min，然后以自来水冲洗10-20min ;随后在超净工作台上以70-75%的酒 精消毒25-35秒，0. 5%升汞溶液中处理6-8分钟，然后以无菌水冲洗4-5遍，置于无菌培养 皿备用；
[0010] 3)初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm，茎段按末端向下插入初始 诱导培养基中培养，培养条件为光强2500-3500LX、光周期10-14h/d，温度25°C ±2°C ;培 养4-6d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中，并继续培养12-18d 至新芽长出；所述的初始诱导培养基组成为：WPM+6-BA0. 1-0. 2mg/L+NAA0. 01-0. 02mg/ L+PVP5-10mg/L ；
[0011] 4)愈伤组织诱导：取初始诱导培养中的芽，放入愈伤组织诱导培养基中培养 15-20d，条件为暗培养，温度20°C ±2°C ;所述愈伤组织培养基为：WPM+6-BA0. 5-2.0mg/ L+NAA0. 02-0. 05mg/L+PVP5-10mg/L ；
[0012] 5)分化和增殖培养：将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养20-25d，增 殖产生大量丛生苗，培养条件为光强1800-2500LX、光周期10-14h/d，温度25°C ±2°C ;所 述分化和增殖培养用培养基为：l/2MS+6-BA0. 1-0. 5mg/L+NAA0. 1-0. 5mg/L+PVP5-10mg/L ;
[0013] 6)生根培养：将5)步骤中的丛生苗切割成单个，转移至生根培养基中培养15-20d 后生根，培养条件为光强1800-2500LX、光周期10-14h/d，温度25°C ±2°C ;所述生根用培 养基为：1/2MS+IBA0. 1-0. 5mg/L+PVP5-10mg/L ;
[0014] 7)炼苗和移栽：将有生根的金粟兰幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗3-5d 后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽装有河沙基质的苗床上，保持温度20-25 °C，湿度 85% -95%，适当遮荫即可；
[0015] 所述的WPM培养基配方为：大量元素：硝酸铵NH4N03400mg/L，硫酸钾K 2S04900mg/ L，磷酸二氢钾 KH2P03170mg/L，硫酸镁 MgS04 · 7H20370mg/L ;钙盐：氯化钙 CaCl2 · 2H2096mg/ L ;四水合硝酸钙Ca(N03)2 · 4H20556mg/L ;微量元素：硼酸Η3Β036· 2mg/L，硫酸锰 MnS04 · 4Η2022· 5mg/L，硫酸锌 ZnS04 · 7Η208· 6mg/L，钥酸钠 Na2Mo04 · 2Η200· 25mg/L， 硫酸铜CuS04 · 5Η200· 25mg/L ;铁盐：乙二胺四乙酸二钠 Na2-EDTA37. 3mg/L，硫酸亚铁 FeS04 · 7Η2027· 8mg/L ;有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素 lmg/L，盐酸批口多 醇 0· 5mg/L，烟酸 0· 5mg/L ;
[0016] 所述的MS培养基配方为：大量元素：硝酸钾KN031900mg/L，硝酸铵NH 4N031650mg/ L，磷酸二氢钾 KH2P03170mg/L，硫酸镁MgS04 ·7Η20370π^/1 ;钙盐：氯化钙 CaCl2 ·2Η20440π^/ L ;微量元素：碘化钾 ΚΙ(λ 83mg/L，硼酸 Η3Β036· 2mg/L，硫酸锰 MnS04 · 4Η2022· 3mg/L，硫酸 锌 ZnS04 · 7Η208· 6mg/L，钥酸钠 Na2Mo04 · 2Η200· 25mg/L，硫酸铜 CuS04 · 5Η200· 025mg/L， 氯化钴CoCl2 · 6H200. 025mg/L ;铁盐：乙二胺四乙酸二钠 Na2-EDTA37. 25mg/L，硫酸亚铁 FeS04 · 7Η2027· 85mg/L ;有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0· 5mg/L，盐酸吡 哆醇 0· 5mg/L，烟酸 0· 5mg/L ;蔗糖 30g/L，琼脂粉 7g/L，pH 为 5. 7 ;
[0017] 所述的1/2MS培养基配方为：大量元素：硝酸钾KN039 50mg/L，硝酸铵NH4N038 2 5mg/ L，磷酸二氢钾KH2P0385mg/L，硫酸镁MgS04 · 7H20185mg/L ;余同上述MS培养基；
[0018] 所述的6-BA为6-苄氨基嘌呤；
[0019] 所述的NAA为α -萘乙酸；
[0020] 所述的ΙΒΑ为吲哚-3- 丁酸；
[0021] 所述的PVP为聚乙烯吡咯烷酮。
[0022] 优选的，步骤3)中初始诱导培养基组成为：WPM+6-BA0. 15mg/L+NAA0. 015mg/ L+PVP6mg/L〇
[0023] 优选的，步骤 4)中愈伤组织培养基为：WPM+6-BAl. Omg/L+NAAO. 04mg/L+PVP8mg/ L〇
[0024] 优选的，步骤5)中分化和增殖培养用培养基为：l/2MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. 3mg/ L+PVP8mg/L〇
[0025] 优选的，步骤6)中生根用培养基为：1/2MS+IBA0. 3mg/L+PVP8mg/L。
[0026] 采用本发明繁殖金粟兰，可实现金粟兰组培苗的大量快速繁殖，为金粟兰生产栽 培和品种改良奠定基础。
[0027] 为了更好的阐述技术方案，下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的说明，但 本发明所要求的保护范围不限于下列实施例。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1
[0029] 1)外植体的选取：取当年生直径2_5mm的金粟兰枝条为外植体，剪去叶片后剪成 l_2cm的莖段；
[0030] 2)外植体消毒：将上述茎段放入盛有自来水的20KHz超声波清洗中保持温度 30°C处理30min，然后以自来水冲洗lOmin ;随后在超净工作台上以70%的酒精消毒25秒， 〇. 5%升汞溶液中处理6分钟，然后以无菌水冲洗4遍，置于无菌培养皿备用；
[0031] 3)初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm，茎段按末端向下插入初始 诱导培养基中培养，培养条件为光强2500-3500LX、光周期10-14h/d，温度25°C ±2°C ;培 养6d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中，并继续培养18d至新芽 长出；所述的初始诱导培养基组成为：WPM+6-BA0. lmg/L+NAAO. 01mg/L+PVP5mg/L ;
[0032] 4)愈伤组织诱导：取初始诱导培养中的芽，放入愈伤组织诱导培养基中培养20d， 条件为暗培养，温度20°C ±2°C ;所述愈伤组织培养基为：WPM+6-BA0. 5mg/L+NAA0.02mg/ L+PVP5mg/L ；
[0033] 5)分化和增殖培养：将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养25d，增殖 产生大量丛生苗，培养条件为光强1800-2500LX、光周期10-14h/d，温度25°C ±2°C ;所述 分化和增殖培养用培养基为：l/2MS+6-BA0. lmg/L+NAAO. lmg/L+PVP5mg/L ;
[0034] 6)生根培养：将5)步骤中的丛生苗切割成单个，转移至生根培养基中培养120d 后生根，培养条件为光强1800-2500LX、光周期10-14h/d，温度25°C ±2°C ;所述生根用培 养基为：1/2MS+IBA0. lmg/L+PVP5mg/L ;
[0035] 7)炼苗和移栽：将有生根的金粟兰幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗5d 后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽装有河沙基质的苗床上，保持温度20-25°C，湿度 85% -95%，适当遮荫即可。
[0036] 经试验，采用本实施例所育试管苗的苗床移栽成活率为85. 2%。
[0037] 实施例2
[0038] 1)外植体的选取：取当年生直径2_5mm的金粟兰枝条为外植体，剪去叶片后剪成 l_2cm的莖段；
[0039] 2)外植体消毒：将上述茎段放入盛有自来水的25KHz超声波清洗中保持温度 30-35 °C处理45min，然后以自来水冲洗20min ;随后在超净工作台上以75 %的酒精消毒 25-35秒，0. 5%升汞溶液中处理8分钟，然后以无菌水冲洗5遍，置于无菌培养皿备用；
[0040] 3)初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm，茎段按末端向下插入初始 诱导培养基中培养，培养条件为光强2500-3500LX、光周期10-14h/d，温度25°C ±2°C ;培 养4d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中，并继续培养12d至新芽 长出；所述的初始诱导培养基组成为：WPM+6-BA0. 2mg/L+NAA0. 02mg/L+PVP10mg/L ;
[0041] 4)愈伤组织诱导：取初始诱导培养中的芽，放入愈伤组织诱导培养基中培养15d， 条件为暗培养，温度20°C ±2°C ;所述愈伤组织培养基为：WPM+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/ L+PVP10mg/L ；
[0042] 5)分化和增殖培养：将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养20d，增殖 产生大量丛生苗，培养条件为光强1800-2500LX、光周期10-14h/d，温度25°C ±2°C ;所述 分化和增殖培养用培养基为：l/2MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 5mg/L+PVP10mg/L ;
【权利要求】
1. 一种金粟兰快速繁殖的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤： 1) 外植体的选取：取当年生直径2-5_的金粟兰枝条为外植体，剪去叶片后剪成l-2cm 的茎段； 2) 外植体消毒：将上述茎段放入盛有自来水的20-25KHZ超声波清洗机中保持温度 30-35°C处理30-45min，然后以自来水冲洗10-20min ;随后在超净工作台上以70-75%的酒 精消毒25-35秒，0. 5%升汞溶液中处理6-8分钟，然后以无菌水冲洗4-5遍，置于无菌培养 皿备用； 3) 初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段各剪去2-3mm，茎段按末端向下插入初始诱 导培养基中培养，培养条件为光强2500-3500LX、光周期10-14h/d，温度25°C ±2°C ;培 养4-6d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的初始诱导培养基中，并继续培养12-18d 至新芽长出；所述的初始诱导培养基组成为：WPM+6-BA0. 1-0. 2mg/L+NAA0. 01-0. 02mg/ L+PVP5-10mg/L ； 4) 愈伤组织诱导：取初始诱导培养中的芽，放入愈伤组织诱导培养基中培养 15-20d，条件为暗培养，温度20°C ±2°C ;所述愈伤组织培养基为：WPM+6-BA0. 5-2.0mg/ L+NAA0. 02-0. 05mg/L+PVP5-10mg/L ； 5) 分化和增殖培养：将透明无色的愈伤组织块放入分化培养基中培养20-25d，增殖产 生大量丛生苗，培养条件为光强1800-2500LX、光周期10-14h/d，温度25°C ±2°C ;所述分 化和增殖培养用培养基为：l/2MS+6-BA0. 1-0. 5mg/L+NAA0. 1-0. 5mg/L+PVP5-10mg/L ; 6) 生根培养：将5)步骤中的丛生苗切割成单个，转移至生根培养基中培养15-20d后 生根，培养条件为光强1800-2500LX、光周期10-14h/d，温度25°C ±2°C ;所述生根用培养 基为：1/2MS+IBA0. 1-0. 5mg/L+PVP5-10mg/L ; 7) 炼苗和移栽：将有生根的金粟兰幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗3-5d后，取出 幼苗，洗去根部培养基，移栽装有河沙基质的苗床上，保持温度20-25°C，湿度85 % -95 %， 适当遮荫即可； 所述的WPM培养基配方为：大量元素：硝酸铵NH4N03400mg/L，硫酸钾K2S0 4900mg/L， 磷酸二氢钾 KH2P03170mg/L，硫酸镁 MgS04 · 7H20370mg/L ;钙盐：氯化钙 CaCl2 · 2H2096mg/ L ;四水合硝酸钙Ca(N03)2 · 4H20556mg/L ;微量元素：硼酸Η3Β036· 2mg/L，硫酸锰 MnS04 · 4Η2022· 5mg/L，硫酸锌 ZnS04 · 7Η208· 6mg/L，钥酸钠 Na2Mo04 · 2Η200· 25mg/L， 硫酸铜CuS04 · 5Η200· 25mg/L ;铁盐：乙二胺四乙酸二钠 Na2-EDTA37. 3mg/L，硫酸亚铁 FeS04 · 7Η2027· 8mg/L ;有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素 lmg/L，盐酸批口多 醇 0· 5mg/L，烟酸 0· 5mg/L ; 所述的MS培养基配方为：大量元素：硝酸钾KN031900mg/L，硝酸铵NH4N0 31650mg/L， 磷酸二氢钾 KH2P03170mg/L，硫酸镁 MgS04 · 7H20370mg/L ;钙盐：氯化钙 CaCl2 · 2H20440mg/ L ;微量元素：碘化钾 ΚΙ(λ 83mg/L，硼酸 Η3Β036· 2mg/L，硫酸锰 MnS04 · 4Η2022· 3mg/L，硫酸 锌 ZnS04 · 7Η208· 6mg/L，钥酸钠 Na2Mo04 · 2Η200· 25mg/L，硫酸铜 CuS04 · 5Η200· 025mg/L， 氯化钴CoCl2 · 6H200. 025mg/L ;铁盐：乙二胺四乙酸二钠 Na2-EDTA37. 25mg/L，硫酸亚铁 FeS04 · 7Η2027· 85mg/L ;有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0· 5mg/L，盐酸吡 哆醇 0· 5mg/L，烟酸 0· 5mg/L ;蔗糖 30g/L，琼脂粉 7g/L，pH 为 5. 7 ; 所述的1/2MS培养基配方为：大量元素：硝酸钾KN039 50mg/L，硝酸铵NH4N038 2 5mg/L，磷 酸二氢钾KH2P0385mg/L，硫酸镁MgS04 · 7H20185mg/L ;余同上述MS培养基； 所述的6-BA为6-苄氨基嘌呤； 所述的NAA为α -萘乙酸； 所述的ΙΒΑ为吲哚-3-丁酸； 所述的PVP为聚乙烯吡咯烷酮。
2. 根据权利要求1所述一种金粟兰快速繁殖的方法，其特征在于所述步骤3)中初始诱 导培养基组成为：WPM+6-BA0. 15mg/L+NAA0. 015mg/L+PVP6mg/L。
3. 根据权利要求1所述一种金粟兰快速繁殖的方法，其特征在于所述步骤4)中愈伤组 织培养基为：WPM+6-BA1. Omg/L+NAAO. 04mg/L+PVP8mg/L。
4. 根据权利要求1所述一种金粟兰快速繁殖的方法，其特征在于所述步骤5)中分化和 增殖培养用培养基为：l/2MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. 3mg/L+PVP8mg/L。
5. 根据权利要求1所述一种金粟兰快速繁殖的方法，其特征在于所述步骤6)中生根用 培养基为：1/2MS+IBA0. 3mg/L+PVP8mg/L。
【文档编号】A01G31/00GK104094826SQ201410318391
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】戴勤, 王冬梅, 李慧珍 申请人:芜湖欧标农业发展有限公司