一种人肺腺癌细胞系及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种人肺腺癌细胞系及其应用。该人肺腺癌细胞，于2014年5月23日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，培养物名称为人肺腺癌细胞ZRLC-1，保藏编号为CCTCC?NO：C2014103。该人肺腺癌细胞ZRLC-1作为实验材料在肺腺癌基础和临床研究中的应用，可用于建立肺癌发生、发展或转移的动物模型。本发明的人肺腺癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，并且高表达EpCAM，E-cadherin等上皮标志，细胞流式显示EpCAM阳性细胞达99.70%，为肺癌研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。
【专利说明】一种人肺腺癌细胞系及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物动物细胞系领域，特别涉及一种人肺腺癌细胞系及其应用。
【背景技术】
[0002] 原发性肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年新发肺癌大约130万人， 占全部新发癌症病例总数的12.3 %，居首位，而尤以我国是该疾病的高发国家。近年的 流行病学调查数据显示，肺癌是我国人群中发病率和死亡率上升最快的癌症之一。卫生部 公布的的全国第三次死因调查结果中，肺癌居我国癌症死因首位，占全部癌症死因的22. 7 %，与70年代相比，我国的肺癌死亡率上升4. 65倍，特别值得关注。
[0003] 目前手术、化疗、放疗这些传统方案仍然是治疗肺癌的有效途径，随着相关辅助学 科的发展，靶向治疗、生物治疗为肺癌患者带来新的希望，但是多数肺癌患者确诊时已是晚 期，无手术机会，能手术的患者术后转移率高，术后生存率不高，总体预后欠佳。因而，寻求 更加有效的肺癌治疗手段显得尤为重要。
[0004] 肺癌细胞株作为肺癌发生机理及抗肺癌药物开发的接近临床肿瘤生物学特性的 实验材料已被广泛应用，但全世界目前报道的肺癌细胞株仍为数不多。同时，已有的肺癌细 胞株在反复的传代过程中，细胞特性与原始肿瘤细胞相比发生了很大变化。因此，肺癌原代 细胞培养并建立细胞系在现阶段具有很大的应用价值，而针对我国肺癌的高发现象，建立 我国自己的肺腺癌细胞模型具有更显著的科学意义和社会意义。
[0005] 运用临床肿瘤组织直接体外培养建立细胞系往往混杂其它非肿瘤细胞，成功率较 低。本发明通过运用临床肿瘤标本先初步体外扩增到一定的细胞数，再经动物皮下接种富 集纯化肿瘤细胞，进而通过原代培养建立人源性肿瘤细胞系。该方法成功率较高，且细胞系 接近于肿瘤的临床生物学特性，对药物的耐药性及敏感性有很好的预测性，是研究肺癌发 生分子机制和抗肿瘤药物筛选的理想实验材料。
[0006]
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有的人肺腺癌细胞系存在的生物多样性低，与临床上肺腺 癌的生物学性状相差较大等不足，提供一种新的人肺腺癌细胞系。
[0008] 本发明的人肺腺癌细胞，于2014年5月23日保藏在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)(地址：中国.武汉.武汉大学即湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，邮编： 430072)，培养物名称为人肺腺癌细胞ZRLC-1，保藏编号为CCTCC NO :C2014103。
[0009] 本发明采用取自一位55岁女性肺腺癌手术切除标本，经体外初步培养扩增成一 定数量级的细胞悬液后，接种于裸鼠皮下，成瘤后取出肿瘤组织，经体外培养获得稳定传代 的一种新的肺腺癌细胞，命名为：ZRLC-1。
[0010] 本发明人肺腺癌细胞ZRLC-1具有以下生物学特性： 1.细胞系贴壁生长，无接触抑制； 2. 细胞系生长快速和代谢旺盛，具有良好的体外培养扩增性； 3. 细胞系染色体核型分析提示该细胞为近二倍体细胞系，有较多的染色体缺失、异位 及衍生现象； 4. 细胞系高表达EpCAM (上皮细胞粘附分子)，E-cadherin (E-钙粘蛋白）等上皮表面 标志，细胞流式显示EpCAM阳性细胞达99. 7 % ; 5. 细胞系在无血清培养基条件下，具有一定的克隆球形成能力； 6. 细胞传至第五代按2*10~6、2*10~5、2*10~4、2*10~3数量级接种裸鼠，均可成瘤，致 瘤性强，组织切片提示移植瘤组织学特性与原发瘤相似。
[0011] 本发明的进一步目的是提供该人肺腺癌细胞ZRLC-1作为实验材料在肺腺癌基础 和临床研究中的应用，可用于建立肺癌发生、发展或转移的动物模型，可用于制备人肺腺癌 相关药物疗效的分子检测方法中的应用。
[0012] 本发明的人肺腺癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，并且高表达EpCAM， E-cadherin等上皮标志，细胞流式显示EpCAM阳性细胞达99. 70 %，为肺癌研究提供新的更 接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。具有强致瘤性，可以成功制备肺癌发生、发展或转 移的动物模型，所制得的动物模型可以用于研究肺癌发生发展分子机制、筛选抗肺癌小分 子化合物、探究肺癌的耐药机理以及发现肺癌转移新标志等，是人肺癌基础研究和临床前 期应用的理想细胞系。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1.本发明人肺腺癌细胞ZRLC-1的光镜下（X 100)形态学观察； 图2.本发明人肺腺癌细胞ZRLC-1的生长时间曲线； 图3.本发明人肺腺癌细胞ZRLC-1的染色体分析结果； 图4.本发明人肺腺癌细胞ZRLC-1的表面标志蛋白质印迹检测结果； 图5.本发明人肺腺癌细胞ZRLC-1的表面标志EpCAM的流式检测结果； 图6.本发明人肺腺癌细胞ZRLC-1无血清培养基条件下细胞克隆球形成结果，其中A 为第3天的克隆球图，B为第7天的克隆球图； 图7.本发明人肺腺癌细胞ZRLC-1的成瘤性； 图8.肿瘤的病理组织切片；其中A.临床上取得的肿瘤标本；B.第1代裸鼠移植瘤； C.第2代裸鼠移植瘤。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步的分析(下述实施例中所述实验方 法，如无特殊说明，均为常规方法)。
[0015] 本发明的人肺腺癌细胞，于2014年5月23日保藏在中国典型培养物保藏中 心（CCTCC)(地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072)，培养物名称为人肺腺癌细胞 ZRLC-1，保藏编号为 CCTCC N0:C2014103。
[0016] 实施例1.细胞的制备 裸鼠：5只裸小鼠，雄性，体重16. 0±1. 0g，鼠龄4周，饲养于SPF动物房。裸鼠由浙江 省实验动物中心统一饲养。
[0017] 从浙江大学医学院附属第二医院获得新鲜的临床肺腺癌切除标本（女，55岁，原 发性肺腺癌，病理诊断结果为：腺癌），立即浸入预冷的无菌Hanks缓冲液（含500U/ml青 霉素 G、500U/ml庆大霉素）中。在生物安全柜中，用无菌Hanks缓冲液冲洗标本4?5次， 用眼科剪剪碎成1_3小块，置于lmg/mll型胶原酶/透明质酸酶中37°C消化1小时，中间每 隔15分钟剧烈震荡1次，300目筛网过滤，接种到DMEM培养基(含10ng/ml重组人表皮生长 因子，10 μ g/ml重组人胰岛素，10 %胎牛血清蛋白，100U/ml青霉素 G，100U/ml庆大霉素） 中，培养48h后，将细胞转至普通RPMI1640培养基（含10 %胎牛血清蛋白，100U/ml青霉 素 G、100U/ml庆大霉素）中，扩增细胞至约10~7数量级进行裸鼠皮下接种。动物接种后， 健康状态良好，行为正常。接种一周后，通过触摸发现在接种部位皮下有肿瘤小结节，小结 节于接种二周后开始生长明显，至接种后30天时，肿瘤体积超过200mm 3。
[0018] 原代培养：体外接种扩增的人肺腺癌单细胞悬液30?40天后，将荷瘤裸鼠用过量 二氧化碳气体麻醉处死，无菌解剖，取出肿瘤组织，进行原代培养，方法如下：用Hanks缓 冲液（含500U/ml青霉素 G、500U/ml庆大霉素）漂洗肿瘤组织块4?5次，去除结缔组织 和坏死组织；用无菌手术刀片将肿瘤组织剪切成约1_3小块；置于lmg/mll型胶原酶/透 明质酸酶中37°C消化1小时，中间每隔15分钟剧烈震荡1次，300目筛网过滤，接种到DMEM 培养基中（含l〇ng/ml重组人表皮生长因子，10 μ g/ml重组人胰岛素，10 %胎牛血清蛋白， 100U/ml青霉素 G、100U/ml庆大霉素）中。
[0019] 传代培养：当细胞布满培养瓶底部后，进行细胞传代，具体步骤如下：吸弃旧培养 液，加入5ml PBS缓冲液润洗两遍，吸弃废液，加入lml新鲜的0. 25 %胰蛋白酶溶液，于 37°C孵箱中孵育，观察到细胞质回缩、细胞间隙增大，待细胞脱落后，加入3ml新鲜的含10 %胎牛血清的RPMI1640培养液，仔细吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液，收集全部细胞，离 心，计数，分别接种于新的培养瓶。当细胞传代到第3代以后，将培养液逐步更换为含10 % 胎牛血清的RPMI 1640培养液，细胞生长良好，形态均一。传代至50代以上。
[0020] 在本发明中，传代细胞形态较为均一，无接触抑制，初期生长速度较为缓慢；随着 传代次数的增加，生长速度逐步加快；将该细胞系命名为ZRLC-1，提交保藏，保藏编号为 CCTCC NO ：C2014103〇
[0021] 实施例2 ZRLC-1细胞的生物学特性及应用 本发明如实施例1采用含有胎牛血清和抗生素的RPMI 1640培养液培养ZRLC-1细胞， 使其能体外长期生长和稳定传代。当细胞传至10代以上，细胞性状逐渐稳定，进行相关的 生物学、遗传学和组织来源鉴定。经实验观察与验证，体外生长的细胞具有典型的上皮样形 态，失去接触生长抑制，呈恶性生长。遗传学研究证实该细胞为异倍体，染色体数目和结构 畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。该ZRLC-1细胞以2*10~3数量级即可在裸鼠皮下成 瘤，具有高度致瘤性。该ZRLC-1细胞可以为研究体内外临床抗肺癌药物敏感性及耐药性， 以及肺癌的发生、发展和转移提供新的试验材料。具体如下： 1.形态学观察 将培养ZRLC-1细胞的培养瓶置于倒置显微镜下，在明视野下进行拍照。如图1所示， ZRLC-1细胞失去了接触抑制，呈恶性生长，具有重叠生长的特点，贴壁生长部分呈扁平状， 符合上皮样细胞的特点。
[0022] 2.细胞生长曲线检测 用细胞计数法绘制细胞生长曲线：a.取对数生长期的ZRLC-1细胞，将细胞密度调整 为2X10~3/ml，将其接种于六孔板中，每孔加入2ml细胞悬液，共接种21孔；b.分别于接种 后第1、2、3、4、5、6、7天的同一时间随机抽取3孔胰酶消化后进行细胞计数，连续计数7天； c.根据每日细胞数绘制细胞生长曲线，连续细胞计数绘制细胞的生长曲线。如图2所示，本 株细胞贴壁后第1.2天生长缓慢，第四天开始呈指数生长，在隔天更换培养基营养充足的 条件下细胞可出现叠加生长，无接触抑制现象，具有良好的体外培养扩增性。
[0023] 3.染色体的鉴定 将培养的ZRLC-1细胞置于4 °C下12小时后，加入秋水仙素，使秋水仙素终浓度为 0.4118/1111，再于371：孵箱中继续培养10小时。采集分裂中期的细胞，用0&111〇7固定液 (甲醇：冰醋酸=3:1)进行固定，然后将细胞悬液滴于预冷的载物片上，用Giemas染色液染 色，于显微镜下计数染色体数。如图3所示，细胞连续传代后，染色体仍保持人源性肿瘤细 胞染色体的特征，表现为近二倍体核型，细胞染色体数目大多在42?53之间，染色体数目 和结构存在一定变异，符合恶性肿瘤的遗传学特征。
[0024] 4.蛋白质印迹法检测表面标志物 取1 X ΚΓ6贴壁生长的ZRLC-1细胞及对照另一株皮肤成纤维细胞，PBS缓冲液各清洗 细胞2次，加入RIPA细胞裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，待测样品按50ug/孔上样，进 行10 % SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺）电泳，然后将蛋白转移到PVDF (聚偏二 氟乙烯）膜上，予5 %的脱脂奶粉常温封闭1小时，分别加入小鼠抗人EpCAM (用含5 %牛 血清白蛋白的TBST缓冲液稀释成 1:1000)、小鼠抗人E-Cadherin(用含5%牛血清白蛋白 的TBST缓冲液稀释成1 :1000)、小鼠抗人Vimentin单克隆抗体(用含5 %牛血清白蛋白的 TBST缓冲液稀释成1 :1000)4°C孵育过夜，HRP (辣根过氧化物酶）标记的山羊抗鼠 IgG(用 含5 %脱脂奶粉的TBST缓冲液稀释成1:5000) 37°C孵育1小时，洗膜后ECL化学发光显色液 显像成像。如图4所示，ZRLC-1细胞高表达上皮表面标志EpCAM、E-cadherin，几乎不表达 波形蛋白Vimentin,而对照成纤维细胞高表达Vimentin,几乎不表达EpCAM、E-cadherin。
[0025] 5.流式检测上皮EpCAM标志 ZRLC-1细胞经胰酶消化后制成单细胞悬液，PBS缓冲液冲洗离心后，调整细胞数为 10~6/管,其中一管加入PE标记的小鼠抗人EpCAM单克隆抗体作为实验组，另一管加入PE 标记的小鼠 IgG作为同型对照，避光4°C孵育30min，PBS缓冲液冲洗后上机检测。流式细胞 仪为FACScan，200mW氩激光（488nm)检测PE绿色荧光信号，采集10000个细胞，所测数据用 Flow jo 7. 0软件处理。EpCAM阳性数（％)=(实验管EpCAM阳性细胞数-阴性对照EpCAM 阳性细胞数)/10000X 100 %。如图5所示，ZRLC-1细胞高表达上皮表面标志EpCAM，EpCAM 阳性细胞达99. 7 %，与蛋白质印迹法检测结果相一致。
[0026] 6.无血清培养克隆球形成实验 接种分散均匀的第6代ZRLC-1细胞于低粘附六孔板中，每孔1000个细胞，设置三个副 孔，静置培养1-2周，加入无血清的DMEM培养基(含10ng/ml重组人表皮生长因子，10 μ g/ ml重组人胰岛素，100U/ml青霉素 G，100U/ml庆大霉素)。如图6所示，在无血清条件培养 基条件下，细胞呈球形立体生长，细胞球呈圆形，球内细胞结合紧密，球体饱满，折光性强， 随着时间延长，细胞球可逐渐增大，形状趋于规则。
[0027] 7.第1代裸鼠移植瘤 将新鲜的临床肺腺癌切除标本进行体外初步扩增培养，细胞扩增至约1(Γ7数量级进 行裸鼠皮下接种，形成第1代裸鼠移植瘤。将此第1代裸鼠移植瘤细胞进行原代培养形成 ZRLC-1 细胞。
[0028] 8.细胞的成瘤性 体外大规模培养和收集ZRLC-1细胞，以2*10~6、2*10~5、2*10~4、2*10~3数量级接种裸 鼠皮下，每数量级接种2只裸鼠，裸鼠皮下接种该肿瘤细胞后一周，即可见移植瘤长出，8只 裸鼠全部成瘤，移植瘤呈结节状，与皮肤有粘连，结果见图7,可见该细胞达2*10~3数量级 即可在裸鼠体内形成肿瘤，具有高度致瘤性。
[0029] 9.肿瘤的病理学鉴定 将实施例1的临床肺癌手术标本、手术标本体外初步扩增后接种于裸鼠皮下形成的第 1代移植瘤、上述8步骤中第1代移植瘤细胞体外扩增后接种于裸鼠皮下形成第2代移植 瘤，进行福尔马林固定、石蜡包埋切片及Η&Ε染色，结果见图8,临床手术标本镜下观察，肿 瘤细胞核大、深染，核浆比例增大，周围被纤维组织包裹，形成大量腺管样结构；裸鼠体内成 瘤标本镜下观察，细胞生长旺盛，细胞核增大、深染，异型性明显。它们的病理诊断结果见表 1。可见临床标本、第1代裸鼠移植瘤和第2代裸鼠移植瘤的组织学形态结构类似，形成对 应关系。
[0030] 表1.各肿瘤标本的病理诊断结果
【权利要求】
1. 一种人肺腺癌细胞系，其特征在于其于2014年5月23日保藏在中国典型培养物 保藏中心CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072,培养物名称为人肺腺癌细胞 ZRLC-1，保藏编号为 CCTCC N0:C2014103。
2. 如权利要求1所述的一种人肺腺癌细胞系，其特征在于人肺腺癌细胞ZRLC-1作为建 立肺癌发生、发展或转移的动物模型中的应用。
3. 如权利要求1或2所述的一种人肺腺癌细胞系，其特征在于具有以下生物学特性： 细胞系贴壁生长，无接触抑制；细胞系生长快速和代谢旺盛，具有良好的体外培养扩增性； 细胞系染色体核型分析提示该细胞为近二倍体细胞系，有较多的染色体缺失、异位及衍生 现象；细胞系高表达EpCAM，E-cadherin等上皮表面标志，细胞流式显示EpCAM阳性细胞达 99.7 % ;细胞系在无血清培养基条件下，具有克隆球形成能力；细胞传至第五代按2*10~6、 2*10~5、2*10~4、2*10~3数量级接种裸鼠，均可成瘤，致瘤性强，组织切片提示移植瘤组织学 特性与原发瘤相似。
【文档编号】A01K67/027GK104195109SQ201410332239
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】王凯, 徐霞, 柴守杰, 朱永良, 王晓健 申请人:浙江大学