快速高效香石竹再生体系建立方法
【专利摘要】本发明为一种香石竹快速高效再生体系的建立方法，属于植物生物技术育种领域。该方法以香石竹无菌苗的茎尖为材料，在MS培养基的基础上，配有激素TDZ、NAA，通过茎尖间接再生获得完整植株。本发明具有简便、再生周期短、再生能力强的特点，仅剥离茎尖，培养15～20天，就可通过愈伤组织获得再生植株，再生率为36％～53％，平均愈伤组织分化植株数为5.7～9.3株/愈伤，该方法缩短了香石竹转基因技术育种的周期，为培育性状优良的香石竹品种奠定了更好的基础。
【专利说明】快速高效香石竹再生体系建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于香石竹生物技术育种领域，具体涉及一种香石竹快速、高效再生体系 的建立方法，可用于香石竹基因工程和组培苗的扩繁。
【背景技术】
[0002] 香石竹别名康乃馨、麝香石竹，石竹科，石竹属，为多年生宿根草本植物，香石竹是 著名的"母亲节"之花，也被称为"诚挚的爱"与"幸福祥和"之花，代表慈祥、温馨、真挚、不 求代价的母爱。
[0003] 农杆菌介导的转基因技术在植物基因工程中应用日盛。然而，低的再生效率严重 制约了其在香石竹育种中的进程。因此，探索出高再生频率的再生途径就显得极其重要。外 植体的选择是建立再生系统的第一环节。尽管目前认为植物体的任何组织和器官都可以作 为建立再生系统的外植体，甚至作为植物基因转化的外植体，但是这些外植体的脱分化和 再分化能力，细胞全能性潜在趋势及感受态程度等都有很大差别，即使是同一组织器官的 不同部位也有明显差异。此外，寻找一种最佳的再生培养基也是至关重要的，而激素的浓度 及配比对外植体的生长分化起到关键的作用。
[0004] 现有技术中，通过叶片或茎段诱导愈伤组织，再由愈伤组织分化成植株，这个过程 历时较长，大多需2?3个月，所需时间和人力、物力较多，且增殖系数低。因此，本发明通 过外植体及激素的选择，旨在建立香石竹快速、高效再生体系，从而为转入优良的基因提供 可能，以期改良香石竹的抗病，抗虫品质，提高瓶插寿命，美化花形等。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种以香石竹的茎尖为外植体，通过薄层培养，再生培育时 间快，再生效率高的香石竹再生体系建立方法。
[0006] 本发明的技术方案为一种香石竹快速高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤 如下：
[0007] (1)茎尖的剥离
[0008] 在超净工作台上，取无菌的香石竹组培苗，放入解剖镜下，用镊子小心的剥去顶端 的叶片，露出茎尖；
[0009] (2)植株的再生
[0010] 将步骤⑴中获得的茎尖，去除生长点，然后将茎尖横切成1?2mm的薄片2-3片， 将茎尖薄片组织的背面朝下接种于再生培养基中培养；所述再生培养基为：MS+TDZ0. 5? 0· 8mg/L+NAA0. 1 ?0· 3mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 7 ?9g/L，pH 为 5. 8 ?6. 0 ;培养条件为： 暗培养5?7天后光照培养，光照时间为12?16小时/天，光照强度为20001x，培养温度 24?28°C，培养时间为15?20天；
[0011] (3)植株的继代培养
[0012] 将步骤（2)的茎尖愈伤组织再生的植株分棵切开或切成3?5棵一丛接种于继代 培养基中培养20?25天；所述的继代培养基为：MS+BAO?0. 3mg/L+NAA0?0. 3mg/L+蔗 糖30g/L+琼脂7-9g/L，pH为5. 8?6. 0 ;光照12?16h/天，光照强度为20001x，培养温度 24 ?28°C。
[0013] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0014] 本发明方法简便、快速、高效，再生周期短、再生能力强，仅剥离茎尖，培养15?20 天，就可通过愈伤组织获得再生植株，且再生率高，达到36%?53 %，平均愈伤组织分化植 株数为5. 7?9. 3株/愈伤，最高可达16株/愈伤。而现有技术获得再生植株的培养时间 至少为30天以上，愈伤组织分化植株数大多在5株/愈伤以下，与现有技术相比，缩短再生 植株的培养时间10?15天，缩短了香石竹转基因技术育种的周期，每愈伤组织分化植株数 提高14%?86%，产生了预料不到的技术效果，为培育性状优良的香石竹品种奠定了更好 的基础。
[0015] 本发明把茎尖切成薄片可以增加与农杆菌接触的表面积，使大都多细胞都接触到 筛选培养基，避免了转化细胞和嵌合体的出现，大大提高转效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是接种到培养基上的茎尖薄片细胞。
[0017] 图2是茎尖薄片细胞诱导愈伤并分化出植株。
【具体实施方式】
[0018] 以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详 细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。以下各实施例所用的试验材料均为市售。
[0019] 实施例1
[0020] 实施例1使用的香石竹为"粉恋"品种。
[0021] 香石竹组培苗的获得：取温室内生长的香石竹带腋芽的幼嫩茎段，用洗衣粉水洗 净后，清水冲洗10分钟，吸干表面水分，在超净工作台上用体积分数为75%的酒精浸泡20 秒，无菌水冲洗2?3次，再用质量分数为0. 1 %升汞浸泡15min，无菌水冲洗2?3次，接 种在MS+BAO. 8mg/L+NAA0. lmg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5. 8的增殖培养基上，带腋 芽的部位朝上，一个星期后即可长出幼芽，一个月左右继代一次，以提供试验所用的无菌组 培苗。
[0022] (1)茎尖的剥离
[0023] 在超净工作台上，取无菌的香石竹组培苗'粉恋'，放入解剖镜下，用镊子小心的剥 去顶端的叶片，露出茎尖；
[0024] (2)植株的再生
[0025] 将'粉恋'茎尖切去生长点，然后将茎尖横切成2mm的薄层2片，薄层背面朝下接 种于MS+TDZO. 6mg/L+NAA0. lmg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5. 8的再生培养基中；培 养条件为：暗培养7天后光照培养，光照时间为16小时/天，光照强度为20001χ，培养温度 28°C，培养时间为20天，可分化出再生植株，平均再生率为36%，平均每愈伤再生的植株数 为5. 7,最商可达8株/愈伤；
[0026] (3)植株的继代培养
[0027] 将'粉恋'的茎尖愈伤组织再生的植株分棵切开或切成3?5棵一丛接种于MS+ 蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH为5. 8的继代培养基中培养20天；光照16h/天，光照强度为 20001x，培养温度24°C，即得增殖的再生植株。
[0028] 实施例2
[0029] 实施例2所用的香石竹为香石竹'罗加特'品种。实施例2中无菌的香石竹组培 苗的获得与实施例1相同。
[0030] (1)茎尖的剥离
[0031] 在超净工作台上，取无菌的香石竹组培苗'罗加特'，放入解剖镜下，用镊子小心的 剥去顶端的叶片，露出茎尖；
[0032] (2)植株的再生
[0033] 将'罗加特'茎尖切去生长点，然后将茎尖横切成1mm的薄层3片，薄层背面朝下 接种于MS+TDZO. 8mg/L+NAA0. 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH为6. 0的再生培养基中培 养；培养条件为：暗培养5天后光照培养，光照时间为14小时/天，光照强度为20001χ，培 养温度26°C，培养时间为15天，可分化出再生植株，平均再生率为53. 3%，平均每愈伤再生 的植株数为9. 3,最高可达16株/愈伤；
[0034] (3)植株的继代培养
[0035] 将'罗加特'的茎尖愈伤组织再生的植株分棵切开或切成3?5棵一丛接种于 MS+BAO. 05mg/L+NAA0. lmg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为6. 0的继代培养基中培养25天； 光照14h/天，光照强度为20001x，培养温度26°C，即得增殖的再生植株。
[0036] 以上实施例表明：本发明通过外植体和激素的合理配合，建立了简便、快速、高效 的香石竹再生体系，仅剥离茎尖，培养15?20天，就可通过愈伤组织获得再生植株，且再生 率高，达到36 %?53 %，平均愈伤组织分化植株数为5. 7?9. 3株/愈伤，最高可达16株 /愈伤。而现有技术获得再生植株的培养时间至少为30天以上，愈伤组织分化植株数大多 在5株/愈伤以下，与现有技术相比，缩短再生植株的培养时间10?15天，缩短了香石竹 转基因技术育种的周期，每愈伤组织分化植株数提高14%?86%，产生了预料不到的技术 效果，为培育性状优良的香石竹品种奠定了更好的基础。
【权利要求】
1. 一种香石竹快速高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤如下： (1) 茎尖的剥离 在超净工作台上，取无菌的香石竹组培苗，放入解剖镜下，用镊子剥去顶端的叶片，露 出茎尖； (2) 植株的再生 将步骤（1)中获得的茎尖，去除生长点，然后将茎尖横切成1?2mm的薄片2?3片， 将茎尖薄片组织的背面朝下接种于再生培养基中培养；所述再生培养基为：MS+TDZO. 5? 0· 8mg/L+NAA0. 1 ?0· 3mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 7 ?9g/L，pH 为 5. 8 ?6. 0 ;培养条件为： 暗培养5?7天后光照培养，光照时间为12?16小时/天，光照强度为20001x，培养温度 24?28°C，培养时间为15?20天； (3) 植株的继代培养 将步骤（2)的茎尖愈伤组织再生的植株分棵切开或切成3?5棵一丛接种于继代培养 基中培养20?25天；所述的继代培养基为：MS+BA0?0· 3mg/L+NAA0?0· 3mg/L+蔗糖30g/ L+琼脂7-9g/L，pH为5. 8?6. 0 ;光照12?16h/天，光照强度为20001x，培养温度24? 28。。。
【文档编号】A01H4/00GK104186315SQ201410383569
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月6日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】周旭红, 林亮, 莫锡君, 苏艳, 吴学尉, 桂敏, 余蓉培, 蒋亚莲, 施自明 申请人:云南集创园艺科技有限公司