一种竹节参e-香树素合酶基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种竹节参e-香树素合酶基因及其应用，利用正向引物P1:5’ATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA3’；反向引物P2:5’TTAGGTGCCMGGGACGGTGAT3’，以竹节参cDNA文库为模板扩增，可获得竹节参P-香树素合酶基因，其序列为SEQIDN0.1所示。通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到竹节参中，提高竹节参中齐墩果烷型皂苷的含量。
【专利说明】一种竹节参β-香树素合酶基因及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于生物【技术领域】，主要涉及竹节参中β -香树素合酶（β -amyrin synthase)基因的克隆和应用，
【背景技术】
[0002] 竹节参（Panax japonicus C. A. Mey)属于五加科人参属（Panax L.)植物是传统的 名贵中药材之一，具有较高的药用价值，如增强人体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗疲劳以及保 护心肌等作用，其主要有效成分为皂苷类化合物，其中以齐墩果烷型五环三萜类皂苷为主， 同时含有少量达玛烷型四环三萜类皂苷。
[0003] 竹节参是中国药典收载品种，具有广阔的应用前景和可观的经济价值，目前中国 竹节参的野生资源近于濒危，人工栽培药材生长周期长，造成目前市场供不应求的现状。通 过研究竹节参中活性成分三萜皂苷生物合成的途径及其调控的分子机制，找出其中的关键 酶，实现其基因的定位、克隆及高效表达，在分子水平上对三萜皂苷生物合成进行人工调 控，进一步实现三萜皂苷类化合物的规模生产，以提供医药市场的需求。
[0004] β -香树素合酶（β-amyrin synthase, β AS)基因在三廠类阜苷的生物合成途径 中起着重要的作用。β AS催化2, 3-氧化角鲨烯生成β -香树素 ，β -香树素再经一系列生 化反应生成齐墩果烷型皂苷。β AS被公认为是控制2, 3-氧化角鲨烯流向齐墩果烷型皂苷 合成途径的关键酶。
[0005] 本研究首次利用第二代Solexa HiSeq2000进行竹节参全株的转录组测序及De novo拼接。分析找到竹节参中编码香树素合酶的候选基因并进行体外克隆表达，验证 其功能，为竹节参齐墩果烷型皂苷化合物的生物合成提供理论基础。
[0006] 在本发明被公布之前，尚未有任何公开报道过本专利申请中所提及的竹节参 β -香树素合酶基因及其氨基酸序列，此基因编码的酶在竹节参中齐墩果烷型皂苷化合物 的生物合成的过程中有重要的作用，本研究认为体外克隆该基因是利用基因工程方法和技 术来调控竹节参中齐墩果烷型皂苷化合物生物合成的关键点。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种竹节参β-香树素合酶（PJPAS)基因，其序列为SEQ ID NO. 1所示。该基因编码的酶是直接催化2,3_氧化角鲨烯行成β-香树素，而β-香树 素为齐墩果烷型皂苷的前体，进而为人参属植物中齐墩果烷型皂苷含量的积累提供技术手 段。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种竹节参β_香树素合酶（PJPAS)基因编码的蛋 白质，其序列为SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 本发明的最后一个目的在于提供一种竹节参β_香树素合酶（PJPAS)基因在提 高竹节参中齐墩果烷型皂苷含量的应用，通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到竹节参 中，提高竹节参中齐墩果烷型皂苷的含量。
[0010] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0011] 一种竹节参香树素合酶（PJPAS)基因（以下称为PJ PAS基因），其制备方法 如下：
[0012] 利用正向引物 P1:5'ATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA3' ；反向引物 P2:5' TTAGGTGCCAAGGGACGGTGAT3'，以竹节参cDNA文库为模板扩增，PCR反应程序为94°C预 变性5!1^11，941：变性4〇8,541：退火11^11，721：延伸9〇8,40个循环后，721：延伸1〇1^11。
[0013] 最终获得了 PJP AS基因，其序列为SEQ ID NO. 1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO. 2所示。
[0014] 一种竹节参β -香树素合酶（PJ β AS)基因在提高竹节参中齐墩果烷型皂苷含量 的应用，其应用过程如下：
[0015] 将竹节参β -香树素合酶蛋白质（SEQ ID NO. 2所示）对应的PJ β AS基因（优选 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列）通过农杆菌介导的遗传转化转入珠子参，可获得高齐墩果 烷型皂苷含量的的转基因植株。
[0016] 本发明的所要保护的内容还包括：
[0017] 编码SEQ ID NO. 2所示氨基酸的核苷酸序列；优选SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列。
[0018] 含有本发明的竹节参β-香树素合酶（PJPAS)基因全序列或其ORF序列的重组 载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围，包括但不限 于 pBI121，pCAMBIA1301。
[0019] 含有本发明的竹节参β-香树素合酶（PJPAS)基因全序列或其ORF序列的宿主 细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。包括但不限于烟草细 胞大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、竹节参细胞或竹节参发根细胞。
[0020] 本发明的竹节参香树素合酶（PJPAS)基因的应用，包括用所述的重组载体， 如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养，得到 转基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的竹节参β -香树素 合酶（PJPAS)基因全序列或其ORF序列的转化获得转基因生物体，包括但不限于烟草、酵 母、拟南芥、竹节参发根。
[0021] 本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆 菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
[0022] 利用本发明的竹节参香树素合酶（PJi3AS)，通过各种常规筛选方法，可筛选 出与竹节参β_香树素合酶（PJPAS)发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0024] 本发明所提供的竹节参β -香树素合酶（PJ β AS)基因是首次从竹节参植物中克 隆制备所得，利用本发明的技术可以对竹节参等含有同类化合物的药用植物进行基因工程 改造，通过转基因来提高植物体内的齐墩果烷型皂苷化合物的含量。竹节参β_香树素合 酶（PJPAS)基因可参与竹节参齐墩果烷型皂苷化合物的生物合成，因此本专利为竹节参 齐墩果烷型皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。
[0025] 本发明利用转基因技术得到了高含量齐墩果烷型皂苷类化合物的植株，为人参属 植物中齐墩果烷型皂苷类活性成分的工业化生产提供了技术支撑。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为竹节参总RNA电泳图。
[0027] 图2为PJ β AS功能域预测分析。
[0028] 图3为PJ β AS系统进化树。
[0029] 图4为表达载体pYES2-PJ β AS构建示意图。
[0030] 图5为酶活力检测示意图。
【具体实施方式】
[0031] 本发明所述方案如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂如未特别说明， 均购自生物技术公司。
[0032] 实施例1 :
[0033] 竹节参转录组测序及数据分析
[0034] 1、样品采集
[0035] 竹节参植株来源于湖北恩施，分别取根茎、叶、花、果实置液氮中速冻后，在-80°C 冰箱中冷冻保存备用。
[0036] 2、竹节参总RNA的分离和检测
[0037] 对_80°C保存的各类样本于液氮中充分研磨，然后采用优化的Trizol法对样本进 行总RNA的提取，全过程保证在低温条件下进行，加入一定浓度的PVP溶液（聚乙烯吡咯烷 酮），并适当加大β -巯基乙醇的浓度，离心去除PVP和β -巯基乙醇后，采用高浓度NaAc 溶液析出RNA，DNase去除残留DNA完成RNA的纯化。用1. 0%琼脂糖电泳检测RNA的完整 性（图1)，用Nanodrop2000核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度，RNA样本置于-80°C 冰箱备用。
[0038] 3、转录组测序（RNA-Seq)
[0039] 用 oligo (dT)的磁珠从总 RNA 中富集 mRNA，接加入 fragmentation buffer 将 mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers)合成第一条 cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经 过QiaQuick PCR试剂盒纯化并被EB缓冲液洗脱之后进行末端修复、加 poly (A)并连接测 序接头，琼脂糖凝胶电泳分离并选择片段大小，PCR扩增构建测序文库，利用第二代Solexa HiSeq2000进行RNA测序，及De novo拼接。
[0040] 4、候选基因初步筛选
[0041] 通过GO注释，Blast比对分析以及MEGA5. 0构建系统发育树（图3)等软件分析 初步筛选到竹节参中编码β-香树素合酶的候选基因。
[0042] 实施例2 :
[0043] 竹节参β -香树素合酶基因的克隆
[0044] 利用正向引物 P1:5'ATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA3' ；反向引物 P2:5' TTAGGTGCCAAGGGACGGTGAT3'，以竹节参根茎cDNA文库为模板扩增，PCR反应程序 为941：预变性51^11，941：变性4〇8,541：退火11^11，721：延伸9〇8,40个循环后，721：延伸 IOmin克隆候选基因全长序列，链接到克隆载体pMDIS-T上并转化到大肠杆菌感受态细胞 E. coli DH5a中，步骤如下：
[0045] a)从_80°C超低温冰箱中取100 μ L感受态细胞悬液，解冻后置于冰上；
[0046] b)加入5 μ L连接产物，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min ;
[0047] c) 42°C热激90s，迅速置冰上5min ;
[0048] d)向EP管中加入ImL LB液体培养基（不含抗生素），37°C 200rpm45min ;
[0049] e)摇菌后取100 μ L菌液涂布于含抗生素的平板上，37°C培养箱过夜；
[0050] f)挑取单菌落于4mL含抗生素的LB液体培养基中，37°C 200rpm振荡培养过夜选 取阳性克隆送样测序。
[0051] 至此获得了竹节参β -香树素合酶基因，其序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0052] 实施例3 :
[0053] PJ β AS基因的生物信息学分析
[0054] 本发明涉及的竹节参β-香树素合酶（PJPAS)基因全长为2292bp，其序列为SEQ ID NO. 1所示，其中开放读码框位于1?2292bp，编码的蛋白质序列为SEQ ID NO. 2所示。 将拼接分析好的β_香树素合酶全长序列在NCBI数据库中进行Blast。该基因具有典型的 ISOP REN_C2_like superfamily 结构域，如图 2。
[0055] 实施例4 :
[0056] PJ β AS基因功能的研究
[0057] 1、表达载体的构建
[0058] 依据竹节参PJ β AS基因全长序列（SEQ ID NO. 1)的0RF，设计扩增完整开放阅读 框的引物，分别在正、反向引物上分别引入限制性酶切位点KpnI和XhoI，利用正向引物P1 : 5' GGTACCATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA 反向引物 P2 :5' CTCGAGTTAGGTGCCAAGGGACGGTGAT3' 进 行PCR反应，进行琼脂糖凝胶电泳，30min后照相，观察胶图，扩增片段为2304bp，TA克隆， 提取质粒。以KpnI和XhoI酶切扩增产物2h，利用回收试剂盒（Takara公司，中国）纯化酶 切产物。同时利用KpnI和XhoI酶在37°C下酶切pYES2载体2h，进行琼脂糖凝胶电泳，观 察胶图，并利用试剂盒回收大小约5856bp的片段。
[0059] 二者经连接酶在16°C连接过夜。转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉 素的LB平板上筛选重组子。PCR检测阳性菌斑，提取阳性克隆质粒，进行限制性内切酶酶切 电泳鉴定，保存且有正确目标的重组质粒PYES2-PJ β AS用于表达转化。该表达载体命名为 PYES2-PJ β AS (图 4)。
[0060] 2、蛋白的诱导表达
[0061] 以PYES2-PJ β AS质粒转化突变酵母宿主菌GIL77,在缺少尿嘧啶的完全合成培养 基SC-U(20ug/ml麦角固醇，13ug/ml血红素，5mg/mlTween80)上30°C震荡培养2d，收集细 胞在不含葡萄糖的3〇11培养基（20即/1111麦角固醇，131^/1111血红素，511^/111]^￥661180,2(%半 乳糖）上30°C培养IOh.收集细胞悬浮于0. 1Μ，ρΗ7. 0的磷酸钾溶液中添加3%葡萄糖和血 红素30°C培养24h。回收菌体，分离微粒体，纯化蛋白。
[0062] 3、酶促反应鉴定
[0063] 对表达纯化的β -香树素合酶进行酶活力的检测，加入2ug的纯化表达蛋白到反 应体系0.说磷酸钾缓冲液（?!17.5)，2,3-环氧角鲨烯，11111的001'，111^/1111的以5,0.05% 的Triton X-100。2, 3-环氧角鲨烯作为反应底物，底物浓度越高产生的β-香树素含量越 高。反应总体系在37°C下预孵20min。在100°C下加热3min终止反应，用氯仿提取反应产 物。检测β-香树素的含量。如图5所示当添加的底物2,3_环氧角鲨烯浓度越高时产生 的β-香树素含量越高，反应速率随着β-香树素合酶的减少而逐渐减少。
[0064] 实施例5 :PJi3 AS在竹节参中进行真核表达及转基因竹节参发根中总皂苷含量的 测定
[0065] 转基因用的受体材料采自湖北恩施。
[0066] 含目的基因（竹节参β -香素树合酶基因）的表达载体的构建：根据竹节参β -香 素树合酶基因的全长cDNA序列（SEQ ID NO. 1)，在扩增编码区的正反方向引物上引入限制 性内切酶位点（视选用的载体而定），以便构建植物表达载体。
[0067] 具体步骤如下：
[0068] 以实施例2中获得的含有PJ β AS基因编码区的pMD18-T Vector的质粒 为模版，在上述构建的正向引物前引入BamH I酶切位点，在反向引物前引入Sac I 酶切位点，正向引物 Pl :5'GGATCCATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA3' ：反向引物 P2 : 5' GAGCTCTTAGGTGCCAAGGGACGGTGAT3' 讲行 PCR 扩增后，TA 克降，提取质粒。以 BamH I 和 Sac I酶切扩增产物4h，利用回收试剂盒（Takara公司，中国）纯化酶切产物。同时利用BamH I和Sac I酶在37°C下酶切pBI121载体4h，在16°C下利用T4连接酶连接产物过夜在保证 阅读框正确的前提下将竹节参PJPAS基因的编码区克隆到植物表达载体pBI121上。将酶 切鉴定好的表达载体PBI121PJ β AS转入农杆菌中，遗传转化竹节参。
[0069] 利用发根农杆菌介导的竹节参遗传转化技术，所需的材料和操作步骤如下：
[0070] 1)发根农杆菌A4,使用前自冰箱中取出，用YEB培养基传代2次，菌种在使用前接 种于YEB液体培养基中，28 °C培养过夜。
[0071] 2)取竹节参细嫩腋芽，洗净后置于70%酒精中浸泡lmin，弃酒精，加入2%次氯酸 钠消毒lOmin，期间摇动数次，弃去消毒液，用无菌水漂洗4?5次，置于无菌滤纸上晾干，用 无菌刀片将竹节参腋芽切成5mmX 5mm小片，置于预培养固体培养基上，在（23±1) °C暗箱 培养箱中预培养2d。
[0072] 3)经过夜培养的发根农杆菌A4菌液离心后，菌体沉淀用1/2MS重悬，置于4°C中 2h后取出。将预培养过的竹节参腋芽浸泡于1/2MS重悬的菌液中5min，用无菌滤纸吸去多 余菌液，放入含250-500mg/L卡那霉素的1/2MS固体培养基中，（23±1) °C黑暗条件下培养， 每2周转移到新鲜培养基中1次，待长出毛状根后分离毛状根，转移至含250-500mg/L卡那 霉素的无激素1/2MS固体培养基中培养，每2周转移到新鲜培养基中至无菌为止，然后再转 移至不含卡那霉素的无激素1/2MS培养基中培养。
[0073] 4)把在固体培养基上的毛状根继代培养物接种于装有150ml无激素1/2MS液体 培养基的500ml三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条 件相同，培养20d后，将毛状根从培养基中取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮 存-80°C中备用。
[0074] 阳性株利用常规real-time PCR进行进一步的筛选验证，本发明所用方法具体如 下：
[0075] 提取具有卡那霉素抗性的转化珠节参植株的总RNA，利用Takara反转录试剂盒 将RNA反转录成cDNA，半定量所用引物为珠节参β-香树素合酶基因特异引物（正向引物 5' -CACTGTCGGATGGTTTAT-3' ；反向引物 5' -CAAGGGACGGTGATGG-3'），反应程序为 94°C 时 3 分钟，94°C变性30秒，61°C退火30秒，72°C延伸45秒，25个循环；循环完成后72°C延伸5 分钟。用植物beta-actin基因做为内参基因（正向引物5' -GGAAAAGATTTGGCATC-3'，反向 引物5' -GGGCGTAACCCTCATA-3'）。对竹节参的野生型和转化系在相同生长状态下进行目的 基因表达水平的分析。最终选择相对于野生型植株，基因表达量的Fold-change值高于4 倍以上（P〈0. 01)的转化植株作为阳性株进行后续实验。
[0076] 5)含竹节参β -香素树合酶基因的转基因发根的齐墩果烷型皂苷含量测定
[0077] 根据2010版《中华人民共和国药典》，人参属植物中的皂苷都为三萜皂苷。
[0078] 转基因竹节参发根中齐墩果烷型皂苷含量的检测可使用本领域的常规技术，本发 明具体采用以下步骤：
[0079] 参考袁丁等（华西药学杂志，2008, 23 (6) :692-694)的齐墩果烷型皂苷待测溶液 处理方法及检测方法，利用高效液相色谱法对过表达竹节参PJ β AS基因的转基因竹节参 发根系和野生型对照组进行齐墩果烷型皂苷的含量测定，每组各测20株，标准品为齐墩果 酸，购自中国药品生物制品检定所（批号：110709-200505)。
[0080] 测定结果发现，在过表达竹节参PJ β AS基因的转基因竹节参发根中齐墩果烷型 皂苷含量比非转基因对照组平均提高了 2. 3倍（P〈0. 05)。由此证明，竹节参β -香素树合 酶基因对促进齐墩果烷型化合物含量的提高有显著作用，竹节参β-香素树合酶基因可用 于利用转基因技术提高齐墩果酸型皂苷含量的研究和产业化中，具有很好的应用前景。
【权利要求】
1. 一种分离的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示。
2. 编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO. 1所示。
4. 含有权利要求2所述核苷酸序列的植物表达载体。
5. 含有权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因的转基因植株。
6. 权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高植物齐墩果烷型皂苷含量中 的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：权利要求1所述蛋白质或权利要求2所 述的基因在提高竹节参齐墩果烷型皂苷含量中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK104212787SQ201410441707
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】黄璐琦, 陈平, 张绍鹏, 杨涛, 朱闻君, 宋佳, 孙巧, 伍羽中, 郑用琏, 邓琛 申请人:黄璐琦, 陈平, 张绍鹏, 杨涛, 朱闻君, 宋佳, 孙巧, 伍羽中, 郑用琏, 王如峰, 邓琛, 陈超