一种瘤果槲寄生苦石莲悬浮细胞培养的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种瘤果槲寄生悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞的培养及调控等步骤，本发明方法所制备的瘤果槲寄生悬浮细胞增殖率高，生长周期短，次生代谢物含量高，为瘤果槲寄生的开发和利用提供研究基础。
【专利说明】一种瘤果槲寄生苦石莲悬淳细胞培养的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及瘤果槲寄生悬浮细胞培养的快繁方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 瘤果槲寄生，灌木，槲寄生科，蕭ora/i/b/iw? 1 ,高约0· 5米，莖、枝圆柱 状，枝交叉对生或二歧地分枝，节间长1. 5-3厘米，粗3-4毫米，干后具细纵纹，节稍膨大。 叶对生，革质，卵形、倒卵形或长椭圆形，长3-8. 5厘米，宽1. 5-3. 5厘米，顶端圆钝，基部骤 狭或渐狭；基出脉3-5条；叶柄长2-4毫米。生境：常绿阔叶林中，海岸红树林中，寄生于芸 香科树上，盆地，平原，山坡，疏林中，亚热带雨林中，分布于福建省，海南省，广东省，广西自 治区,云南省，生境：常绿阔叶林中，海岸红树林中，生于海拔10-1100米沿海红树林中或平 原、盆地、山地亚热带季雨林中，寄生于柚树、黄皮、柿树、无患子、柞木、板栗或海桑、海莲等 多种植物上。性味功效：味苦、辛；性凉。祛风除湿；活血止痛；化痰止咳；解毒。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供瘤果槲寄生悬浮细胞培养的快速繁殖方法，工 艺流程简单，生长周期短，次生代谢物质含量高，有利于建立瘤果槲寄生悬浮细胞的大规模 工厂化生产。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案： 取瘤果槲寄生幼嫩叶片，在漂白粉中浸泡5min，流水冲洗20min，超净工作台上 0. 1%氯化汞处理llmin，无菌水冲洗6遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入 DCR+NAAO. 25mg/L+6-BA2. 5mg/L+IBA0. 5mg/L+2, 4-D3. Omg/L+L-谷胺酰胺 50mg/L 培养基中 进行愈伤组织诱导，附加6. 5g/L琼脂，30g/L蔗糖，暗光照，温度25°C，湿度60%，诱导出来 的愈伤组织，接入 DCR+NAAO. 5mg/L+ZT0. lmg/L+2, 4-D2. Omg/L+L-谷胺酰胺 50mg/L 培养基 中进行愈伤组织增殖，附加6. 5g/L琼脂，30g/L蔗糖，光照20001x，温度25°C，湿度60%，生 长良好，长势均一的愈伤组织，称取〇. 2g加入改良DCR+NAAO. 5-0. 8mg/L+6-BA3. 5-4. Omg/ L+2, 4-D2. Omg/L+5-磺基水杨酸1%-2%培养基中水平震荡培养，震荡速度120r/min，温度 25°C，光照20001x，培养一定时间后，取出样品，用滤纸吸干细胞表面水分。
[0005] 采用本发明制备的瘤果槲寄生悬浮细胞，产量大，能耗少，生长周期短，次生代谢 物产量高。
[0006] 下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不 局限于下列实施方式。 【具体实施方式】 [0007] 实施例1 取瘤果槲寄生幼嫩叶片，在漂白粉中浸泡5min，流水冲洗20min，超净工作台上 0. 1%氯化汞处理llmin，无菌水冲洗6遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入 DCR+NAAO. 25mg/L+6-BA2. 5mg/L+IBA0. 5mg/L+2, 4-D3. Omg/L+L-谷胺酰胺 50mg/L 培养基 中进行愈伤组织诱导，附加6. 5g/L琼脂，30g/L蔗糖，暗光照，温度25°C，湿度60%，诱导出 来的愈伤组织，接入 DCR+NAAO. 5mg/L+ZIU lmg/L+2, 4-D2. Omg/L+L-谷胺酰胺 50mg/L 培 养基中进行愈伤组织增殖，附加6. 5g/L琼脂，30g/L蔗糖，光照20001x，温度25°C，湿度 60%，生长良好，长势均一的愈伤组织，称取0. 2g加入改良DCR+NAAO. 5mg/L+6-BA3. 5mg/ L+2, 4-D2. Omg/L+5-磺基水杨酸1%培养基中水平震荡培养，震荡速度120r/min，温度25°C， 光照20001x，培养一定时间后，取出样品，用滤纸吸干细胞表面水分，悬浮细胞增长率65%。 [0008] 实施例2 取瘤果槲寄生幼嫩叶片，在漂白粉中浸泡5min，流水冲洗20min，超净工作台上 0. 1%氯化汞处理llmin，无菌水冲洗6遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入 DCR+NAAO. 25mg/L+6-BA2. 5mg/L+IBA0. 5mg/L+2, 4-D3. Omg/L+L-谷胺酰胺 50mg/L 培养基 中进行愈伤组织诱导，附加6. 5g/L琼脂，30g/L蔗糖，暗光照，温度25°C，湿度60%，诱导出 来的愈伤组织，接入 DCR+NAAO. 5mg/L+ZIU lmg/L+2, 4-D2. 0mg/L+L-谷胺酰胺 50mg/L 培 养基中进行愈伤组织增殖，附加6. 5g/L琼脂，30g/L蔗糖，光照20001x，温度25°C，湿度 60%，生长良好，长势均一的愈伤组织，称取0· 2g加入改良DCR+NAAO. 8mg/L+6-BA4. Omg/ L+2, 4-D2. Omg/L+5-磺基水杨酸2%培养基中水平震荡培养，震荡速度120r/min，温度25°C， 光照20001x，培养一定时间后，取出样品，用滤纸吸干细胞表面水分，悬浮细胞增长率60%。 [0009] 实施例3 取瘤果槲寄生幼嫩叶片，在漂白粉中浸泡5min，流水冲洗20min，超净工作台上 0. 1%氯化汞处理llmin，无菌水冲洗6遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入 DCR+NAAO. 25mg/L+6-BA2. 5mg/L+IBA0. 5mg/L+2, 4-D3. 0mg/L+L-谷胺酰胺 50mg/L 培养基 中进行愈伤组织诱导，附加6. 5g/L琼脂，30g/L蔗糖，暗光照，温度25°C，湿度60%，诱导出 来的愈伤组织，接入 DCR+NAAO. 5mg/L+ZIU lmg/L+2, 4-D2. 0mg/L+L-谷胺酰胺 50mg/L 培 养基中进行愈伤组织增殖，附加6. 5g/L琼脂，30g/L蔗糖，光照20001x，温度25°C，湿度 60%，生长良好，长势均一的愈伤组织，称取0. 2g加入改良DCR+NAAO. 7mg/L+6-BA3. 8mg/ L+2, 4-D2. Omg/L+5-磺基水杨酸2%培养基中水平震荡培养，震荡速度120r/min，温度25°C， 光照20001x，培养一定时间后，取出样品，用滤纸吸干细胞表面水分，悬浮细胞增长率63%。
【权利要求】
1. 一种瘤果槲寄生悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的 诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞的培养及调控，其主要步骤如下： (1)取瘤果槲寄生幼嫩的叶片，在超净工作台上对其进行消毒处理； (2 )取步骤（1)消毒处理过的叶片接入 DCR+NAAO. 25mg/L+6-BA2. 5mg/L+IBA0. 5mg/ L+2, 4-D3. Omg/L+L-谷胺酰胺50mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加6. 5g/L琼脂，30g/ L蔗糖，暗光照，温度25 °C，湿度60% ; (3) 取步骤（2)诱导出来的愈伤组织，接入 DCR+NAAO. 5mg/L+ZT0. lmg/L+2, 4-D2. Omg/ L+L-谷胺酰胺50mg/L培养基中进行愈伤组织增殖，附加6. 5g/L琼脂，30g/L蔗糖，光照 20001x，温度 25°C，湿度 60% ; (4) 取步骤（3)生长良好，长势均一的愈伤组织，称取0. 2g加入改良 DCR+NAAO. 5-0. 8mg/L+6-BA3. 5-4. Omg/L+2, 4-D2. Omg/L+5-磺基水杨酸 1%-2% 培养基中震 荡培养，培养一定时间后，取出样品，用滤纸吸干细胞表面水分。
2. 按照权利要求1所述的一种瘤果槲寄生悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在 于：步骤（1)中所述瘤果槲寄生无菌叶片的获得为，取瘤果槲寄生幼嫩叶片，在漂白粉中浸 泡5min，流水冲洗20min，超净工作台上0. 1%氯化萊处理1 lmin，无菌水冲洗6遍，吸水纸吸 去表面水分。
3. 按照权利要求1所述的一种瘤果槲寄生悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在 于：步骤（3)愈伤组织诱导和增殖培养基中附加了 L-谷胺酰胺，可以消除生长过程中褐化 现象的出现。
4. 按照权利要求1所述的一种瘤果槲寄生悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在 于：步骤（4)悬浮细胞培养中附加了 5-磺基水杨酸，可以调控细胞的生长量和次生代谢物 质的含量。
5. 按照权利要求1所述的一种瘤果槲寄生悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在 于：步骤（4)悬浮细胞培养采用水平震荡培养，震荡速度120r/min，温度25°C，光照20001x。
【文档编号】A01H4/00GK104206275SQ201410463127
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】杨存 申请人:南京通泽农业科技有限公司