一种提高大花蕙兰类原球茎保存效果的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高大花蕙兰类原球茎保存效果的方法，为采用含有碳纳米材料的玻璃化溶液处理大花蕙兰类原球茎以提高其保存效果，具体包括：预培养、装载液处理、玻璃化溶液处理和液氮保存步骤，其中所述玻璃化溶液含有0.1~0.5g/L碳纳米管。本发明中公开的方法对大花蕙兰类原球茎的保存效果优化显著，通过添加碳纳米管作为外源物质对植物玻璃化超低温保存起到促进作用。
【专利说明】一种提高大花蕙兰类原球茎保存效果的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物或其局部的保存领域，具体涉及一种提高大花蕙兰类原球茎保存 效果的方法。
【背景技术】
[0002] 超低温保存是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常 在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的 生物学状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期 保存方式。玻璃化法超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护 剂组成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻 璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化法因操作简单快捷，成本低，适宜保存种类 广泛，保存材料遗传性稳定，保存效果好等优点，是近十年来用于优良种质资源中长期保存 的首选方法。
[0003] 兰科是被子植物中的第一大科，作为一种重要的观赏植物资源，在园林和观赏园 艺的发展过程中占据重要地位。大花蕙兰是对兰属中通过人工杂交培育出的、色泽艳丽、花 朵硕大的品种的一个统称。目前，已成功实现超低温保存的兰科植物种类包括金钗石斛、铁 皮石斛、大花万代兰、血色石斛、舌唇兰属、矮万代兰等。已初步建立的大花蕙兰类原球茎玻 璃化法超低温保存体系的相对成活率仅为10%，还不足以满足生产与科研的需求。
【发明内容】
[0004] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种新的提高大花蕙兰类 原球茎保存效果的方法，以克服现有技术中植物种质资源中长期保存难以实现，以及超低 温保存的植物或其组织恢复生长率低的缺点。
[0005] 为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现的。
[0006] -种提高大花蕙兰类原球茎保存效果的方法，采用玻璃化法超低温保存的方法对 大花蕙兰类原球茎进行保存，具体步骤如下：
[0007] 1)预培养：将大花蕙兰类原球茎置于预培养基上，在光照培养箱中预培养1?5 天；
[0008] 2)装载液处理：室温下，将大花蕙兰类原球茎在装载液中浸泡处理40?60分钟 后移除装载液；
[0009] 3)玻璃化溶液处理：在0?25°C下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理大花蕙兰类原球 茎40?60分钟；
[0010] 4)液氮保存：保持大花蕙兰类原球茎在玻璃化溶液中浸泡的状态，将其置于液氮 中保存；
[0011] 所述玻璃化溶液为含有〇. 1?〇. 5g/L碳纳米管的玻璃化冷冻保护液。
[0012] 优选地，所述 MS 培养液含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/L FeSO4 ? 7H20， lOOmg/L肌醇，0? 5mg/L烟酸，0? 5mg/L盐酸批B多醇，0? lmg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸， 0. 83mg/L KI,6. 2mg/L H3BO3, 22. 3mg/L MnSO4 ? 4H20, 8. 6mg/L ZnSO4 ? 7H20, 0. 25mg/L Na2MoO4 ? 2H20,0? 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0? 025mg/L CoCl2 ? 6H20,余量为水。优选地，所述 MS 培养液的pH为5. 8。
[0013] 优选地，上述步骤1)中所述大花蕙兰类原球茎为在含有40?80g/L的山梨醇的 MS固体培养基上光照预培养后的类原球茎。
[0014] 优选地，上述步骤1)中所述大花蕙兰类原球茎为在含有60g/L的山梨醇的MS固 体培养基上光照预培养后的类原球茎。
[0015] 本发明中所述 MS 固体培养基含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/ L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20, 440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/L FeSO4 *7H20, lOOmg/L 肌醇，0. 5mg/L 烟酸，0. 5mg/L 盐酸批咳醇，0. lmg/L 盐酸硫胺素，2mg/L 甘氨酸，〇.83mg/L KI，6.2mg/L H3B03,22.3mg/L MnSO4 .41^0,8. 6mg/L ZnSO4 *71120,0.2511^/ L Na2MoO4 ? 2H20,0. 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0. 025mg/L CoCl2 ? 6H20,30g/L 蔗糖，lOg/L 琼脂 粉，余量为水。所述MS固体培养基的pH为5. 8。
[0016] 优选地，上述步骤1)中所述的在MS固体培养基上培养的方法为：将大花蕙兰类原 球茎室温下置于含有60g/L的山梨醇的MS固体培养基上培养1?5天。
[0017] 优选地，所述装载液为含有2mol/L丙三醇、0. 4mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS 培养液。
[0018] 更优选地，上述步骤2)中，室温下，将大花蕙兰类原球茎在装载液中浸泡处理40 分钟后移除装载液；
[0019] 更优选地，上述步骤3)中，在0°C下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理大花蕙兰类原 球茎50分钟。
[0020] 优选地，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚 砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 5g/L碳纳米管的MS培养液。
[0021] 更优选地，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基 亚砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 3g/L碳纳米管的MS培养液。
[0022] -种大花蕙兰类原球茎的解冻及再培养方法，所述大花蕙兰类原球茎为采用如上 述所述方法保存的大花蕙兰类原球茎，所述大花蕙兰类原球茎的解冻及再培养方法为将大 花蕙兰类原球茎从液氮中取出，先水浴解冻，然后去除玻璃化溶液后用洗涤液洗涤，最后转 入恢复培养基中恢复培养。
[0023] 优选地，水浴解冻的条件为在30?40°C的水浴中解冻60?120s。
[0024] 更优选地，水浴解冻的条件为在40°C的水浴中解冻60s。
[0025] 优选地，所述洗涤液为含有1?I. 5mol/L蔗糖和5?lOmmol/L KNO3的MS培养 液，洗涤工艺为：用洗涤液在室温下将大花蕙兰类原球茎浸泡10?30分钟。
[0026] 更优选地，所述洗涤液为含有I. 2mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS培养液。洗 涤工艺为：用洗涤液在室温下将大花蕙兰类原球茎浸泡20分钟，每隔10分钟更换洗涤液。
[0027] 优选地，所述恢复培养基为含有1?2mg/L 6-苄基腺嘌呤、0. 1?0. 5mg/L萘乙酸 和30g/L蔗糖的MS固体培养基。
[0028] 优选地，所述恢复培养基为含有2mg/L 6-苄基腺嘌呤、0. lmg/L萘乙酸和30g/L蔗 糖的MS固体培养基。
[0029] 优选地，大花蕙兰类原球茎的制备方法参考文献：大花蕙兰'幻影'组培再生体系 建立及离体保存技术研究（刘佩佩，北京林业大学硕士学位论文，2008)。
[0030] 更优选地，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基 亚砜、0. 4mol/L蔗糖和0. lg/L碳纳米管的MS培养液。
[0031] 更优选地，所述洗涤工艺为：用洗涤液在室温下浸泡20分钟，每10分钟更换一次 洗涤液。
[0032] 更优选地，为了证明本发明中方法的保存效果，采用相对成活率来统计，具体地， 在恢复培养30天后利用氯化三苯四氮唑（缩写为TTC)法统计大花蕙兰类原球茎相对成活 率，并辅以荧光素二乙酸酯（缩写为FDA)染色法观察。
[0033] 根据纳米科学原理，向冷冻保护剂中添加纳米材料能够有效提高冷冻保护剂的粘 度和热导率，改变冰晶的形成状况、减少对细胞的伤害。本发明对大花蕙兰类原球茎在玻璃 化超低温条件下保存，先进行预培养，然后依次用装载液、玻璃化溶液处理，最后在液氮中 超低温保存，其中玻璃化溶液又为添加了碳纳米管的玻璃化溶液，这种外源物质的添加配 合方法中的其他工艺，能够有效的提高大花蕙兰类原球茎的保存效果。按照本发明公开的 保存方法，采用浓度为〇. 1?〇. 5g/L的碳纳米管作为外源物质使用时，大花蕙兰类原球茎 玻璃化超低温保存后的相对成活率显著提高，本发明中公开的方法对大花蕙兰类原球茎的 保存效果优化显著，通过添加碳纳米管作为外源物质对植物玻璃化超低温保存起到促进作 用。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1为实施例1中实验组和对照组中大花蕙兰类原球茎超低温保存恢复生长的 FDA染色照片。FDA能够进入活细胞原生质体内产生荧光，可以作为判断细胞死活的标志。
[0035] 图1中由左到右分别为对照组超低温保存后的大花蕙兰类原球茎、实验组组1超 低温保存后的大花蕙兰类原球茎、实验组组2超低温保存后的大花蕙兰类原球茎、实验组 组3超低温保存后的大花蕙兰类原球茎。如图1所示，亮度越大表示荧光强度越强，细胞活 力越1?。
【具体实施方式】
[0036] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0037] 本发明实施例中所用的大花蕙兰类原球茎由茎尖诱导，具体方法参照《大花蕙 兰'幻影'组培再生体系建立及离体保存技术研究》，刘佩佩，北京林业大学硕士学位论文， 2008。
[0038] 本发明实施例中所用实验试剂的配方如下：
[0039] I) MS 培养液为：MS 培养液含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/L FeSO4 ? 7H20， lOOmg/L肌醇，0? 5mg/L烟酸，0? 5mg/L盐酸批B多醇，0? lmg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸， 0. 83mg/L KI,6. 2mg/L H3BO3, 22. 3mg/L MnSO4 ? 4H20, 8. 6mg/L ZnSO4 ? 7H20, 0. 25mg/L Na2MoO4 ? 2H20,0. 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0. 025mg/L CoCl2 ? 6H20,余量为水，所述 MS 培养液 的pH为5. 8。
[0040] 2)MS 固体培养基为：MS 固体培养基含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/ L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20, 440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/L FeSO4 *7H20, lOOmg/L 肌醇，0. 5mg/L 烟酸，0. 5mg/L 盐酸批咳醇，0. lmg/L 盐酸硫胺素，2mg/L 甘氨酸，〇.83mg/L KI，6.2mg/L H3B03,22.3mg/L MnSO4 .41^0,8. 6mg/L ZnSO4 *71120,0.2511^/ L Na2MoO4 ? 2H20,0. 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0. 025mg/L CoCl2 ? 6H20,30g/L 蔗糖，lOg/L 琼脂 粉，余量为水，所述MS固体培养基的pH为5. 8。
[0041] 3)预培养基为含有60g/L山梨醇的MS培养基。
[0042] 4)装载液为：含有2mol/L丙三醇、0. 4mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS培养液。
[0043] 5)玻璃化溶液为：含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、 0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 5g/L碳纳米管的MS培养液。
[0044] 6)洗涤液为含有I. 2mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS培养液。
[0045] 7)恢复培养基为含有2mg/L 6-苄基腺嘌呤、0? lmg/L萘乙酸和30g/L蔗糖的MS 固体培养基。
[0046] 实施例1
[0047] 1)将大花蕙兰类原球茎在含有60g/L山梨醇的MS固体培养基上光照预培养5天；
[0048] 2)转至装载液中室温浸泡处理40分钟；
[0049] 3)转入玻璃化溶液中在0°C条件下脱水处理50分钟；
[0050] 4)最后置于液氮中超低温保存。
[0051] 步骤3)结束后，无需除去玻璃化溶液，直接将浸泡于玻璃化溶液中的大花蕙兰类 原球茎置于液氮中超低温保存。
[0052] 按照上述步骤将大花蕙兰类原球茎分为实验组和对照组。
[0053] 实验组的玻璃化溶液中分别含有0. Ig/L、0. 3g/L、0. 5g/L的碳纳米管。
[0054] 实验组组1的玻璃化溶液中含有0. lg/L的碳纳米管；实验组组2的玻璃化溶液中 含有0. 3g/L的碳纳米管；实验组组3的玻璃化溶液中含有0. 5g/L的碳纳米管；对照组中不 同之处在于玻璃化溶液不添加有碳纳米管，其他与实验组相同。
[0055] 在液氮中保存1小时后取出，快速放入40°C水浴锅中，解冻60s，并不时轻轻摇动； 将玻璃化溶液吸除，加入洗涤液，室温洗涤20min，每隔IOmin换一次洗涤液；洗涤后的大花 蕙兰类原球茎移到恢复培养基培养30天后，计算并比较实验组和对照组内大花蕙兰类原 球茎的相对存活率。
[0056] 实验组与对照组的大花蕙兰类原球茎的相对存活率见表1。
[0057] 表 1
[0058]
【权利要求】
1. 一种提高大花蕙兰类原球茎保存效果的方法，其特征在于，采用玻璃化法超低温保 存的方法对大花蕙兰类原球茎进行保存，具体步骤如下： 1) 预培养：将大花蕙兰类原球茎置于预培养基上，在光照培养箱中预培养1?5天； 2) 装载液处理：室温下，将大花蕙兰类原球茎在装载液中浸泡处理40?60分钟后移 除装载液； 3) 玻璃化溶液处理：在0?25°C下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理大花蕙兰类原球茎 40?60分钟； 4) 液氮保存：保持大花蕙兰类原球茎在玻璃化溶液中浸泡的状态，将其置于液氮中保 存； 所述玻璃化溶液为含有〇. 1?〇. 5g/L碳纳米管的玻璃化冷冻保护液。
2. 如权利要求1所述提高大花蕙兰类原球茎保存效果的方法，其特征在于，所述大花 蕙兰类原球茎预培养基为含有40?80g/L山梨醇的MS固体培养基。
3. 如权利要求1所述提高大花蕙兰类原球茎保存效果的方法，其特征在于，所述装载 液为含有1?2mol/L丙三醇、0. 3?0. 5mol/L蔗糖和5?10mmol/L ΚΝ03的MS培养液。
4. 如权利要求1所述提高大花蕙兰类原球茎保存效果的方法，其特征在于，所述玻璃 化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 1? 0. 5g/L碳纳米管的MS培养液。
5. -种大花蕙兰类原球茎的解冻及再培养方法，所述大花蕙兰类原球茎为采用如权利 要求1?4任一权利要求所述方法保存的大花蕙兰类原球茎，所述大花蕙兰类原球茎的解 冻及再培养方法为将大花蕙兰类原球茎从液氮中取出，先水浴解冻，然后去除玻璃化溶液 后用洗涤液洗涤，最后转入恢复培养基中恢复培养。
6. 如权利要求5所述解冻及再培养方法，其特征在于，水浴解冻的条件为在30?40°C 的水浴中解冻60?120s。
7. 如权利要求5所述解冻及再培养方法，其特征在于，所述洗涤液为含有1?1. 5mol/ L蔗糖和5?10mm〇l/L ΚΝ03的MS培养液洗漆，洗涤工艺为：用洗涤液在室温下将大花蕙兰 类原球茎浸泡10?30分钟。
8. 如权利要求5所述解冻及再培养方法，其特征在于，所述恢复培养基为含有1? 2mg/L 6-苄基腺嘌呤、0. 1?0. 5mg/L萘乙酸和30g/L蔗糖的MS固体培养基。
【文档编号】A01N3/00GK104255707SQ201410467904
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】张亚非, 王路尧, 任丽, 陈冠群, 申晓辉 申请人:上海交通大学