电穿孔转染干扰rna到细粒棘球绦虫的方法
【专利摘要】本发明公开了电穿孔转染干扰RNA到细粒棘球绦虫的方法，包括下述步骤：1)细粒棘球蚴原头节在含有青霉素和链霉素的RPMI1640培养基中培养1-5天；2)清洗培养后的细粒棘球蚴原头节，将其加入到RPMI1640培养基中，接着加入电转缓冲液、干扰RNA到电极杯中，利用电转仪对细粒棘球蚴原头节进行转染；3)转染好的细粒棘球蚴原头节静置后转移至含有RPMI1640培养基的无菌培养皿中，在孵育箱内培养。上述方法进一步还包括通过RT-PCR检测转染后细粒棘球蚴原头节内GRP78mRNA表达水平,Western blot检测转染后细粒棘球蚴原头节内GRP78蛋白表达水平，鉴定转染效果。观察结果显示，本发明利用电穿孔方法成功实现了转染干扰RNA到细粒棘球绦虫。
【专利说明】电穿孔转染干扰RNA到细粒棘球绦虫的方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了使用电穿孔将干扰RNA转染到细粒棘球绦虫的方法，属于生物实验
【技术领域】。
【背景技术】
[0002]棘球蝴病（echinococcosis)俗称包虫病（hydatiddisease)，是棘球蝴绦虫的中 绦期幼虫寄生于人及其他一些动物体内所引起的一种严重危害人体健康和畜牧业发展的 人畜共患寄生虫病。棘球绦虫的种类较多，目前在我国主要有细粒棘球蚴病（囊型包虫病 cysticechinococcosis，CE)和多房棘球蝴病（泡型包虫病alveolarechinococcosis， AE)两种，其分别由细粒棘球绦虫（Echinococcusgranulosus,E.g)和多房棘球绦虫 (Echinococcusmultilocularis，E.m)寄生于人及某些动物体内所致。细粒棘球蝴病呈全 球性分布，在我国主要流行于新疆、青海、内蒙古、西藏等畜牧业发达的省区。
[0003] 细粒棘球蚴可寄生于人体任何部位，其中肝脏最为常见（50-70% )，其次为肺脏 (占20%?30% )，在脾，肾，骨，脑及其他器官中较少见到。目前，对于肝细粒棘球蚴病的 治疗，仍然以外科手术为主，药物治疗为辅。对于手术治疗方式而言，一个严重的缺陷是内 囊摘除过程中易引起内囊里的原头节外溢，复发率较高。即使近些年出现的肝包虫外膜内 外囊完整摘除术可完整摘除肝包虫外囊，降低包虫病的复发率，但是当包虫囊肿体积较大 或紧贴重要脏器或管道（肝门或胆管）时，则需要选择开放式外膜内完整摘除术。此种术 式有两种情况：一是开放式外膜内外囊完全切除术，二是开放式外膜内外囊次全切除术，这 两种情况都可能有头节的外漏和残留，增加术后复发的风险。因此本领域近年来已经开始 尝试使用药物制剂来降低复发率。
[0004] 迄今为止，国内外已经在体外、动物及临床上对95%乙醇，高渗盐水，5%的福尔马 林，硝酸银及阿苯达唑等药物及其联合作用效果方面进行了广泛的研究，它们虽然可以起 到一定的疗效，但都不尽理想且副作用较大：95%的乙醇可导致机体出现严重的肝胆并发 症，20%的高渗盐水会使病人出现严重的肝胆并发症，10%H202会致使机体出现空气栓赛 甚至会发生过敏性休克，福尔马林使用后会产生严重的肝胆并发症，20%的硝酸银可致使 病人出现术中休克，心血管功能衰竭，肾功能衰竭，肝功能不全等副作用，术后发生呼吸困 难，紫绀，低血压等一系列副作用，阿苯达唑（ABZ)临床上病人使用后，肝酶水平会因此而 上升，高浓度酸性和碱性溶液尽管能有效杀灭，但是无法在人体内应用，而低浓度的酸性和 碱性溶液杀灭效果不理想。
[0005] 最近几年来，本领域技术人员尝试将分子生物学的治疗方案应用于包虫病的治 疗，这种方案集中体现在利用RNA干扰技术抑制与细粒棘球蚴生长密切相关的基因到蛋白 的表达，从而使得靶基因沉默，杀灭细粒棘球蚴。针对细粒棘球蚴而言，如何将小分子的干 扰RNA进入到目标体内是本领域面临的一项技术难题，常见方法例如浸泡法效果并不理 想，转染方法，例如病毒介导法，腺病毒，阳离子脂质体法等，研发发现通过脂质体法和腺病 病毒法转染细粒棘球蚴原头节，未达到干扰RNA沉默原头节靶基因的目的，因此本领域目 前迫切需要一种操作简单、条件明确、能有效实现干扰RNA功能的转染方法。
【发明内容】
[0006] 申请人:多年来致力于棘球蚴病的治疗研究，尤其是致力于研究细粒棘球蚴病在 细胞和基因层面的致病机理，发现在细粒棘球蚴病中细粒棘球蚴原头节存在GRP78蛋白 (分子伴侣葡萄糖调节蛋白 78，glucose-regulatedprotein78/bindingimmunoglobulin protein，GRP78)的高表达，从而确定内质网应激反应参与细粒棘球蚴发病。在该研究过程 中， 申请人:通过创造性的努力发明了一种利用电穿孔成功实现转染干扰RNA到细粒棘球绦 虫的方法，利用该方法转染干扰RNA能够成功的实现靶基因的沉默，从而抑制和杀灭细粒 棘球蚴原头节的生长，从而有效治疗细粒棘球蚴病。
[0007] 基于上述，本发明公开了一种电穿孔转染干扰RNA到细粒棘球绦虫的方法，包括 下述步骤：1)细粒棘球蚴原头节在含有青霉素和链霉素的RPMI1640培养基中培养1-5 天；2)清洗培养后的细粒棘球蚴原头节，将其加入到RPMI1640培养基中，接着加入电转缓 冲液、干扰RNA到电极杯中，利用电转仪对细粒棘球蚴原头节进行转染；3)转染好的细粒棘 球蚴原头节静置后转移至含有RPMI1640培养基的无菌培养皿中，在孵育箱内培养。
[0008] 为了准确了解转染效果，上述方法还包括：4)通过RT-PCR检测转染后细粒棘球蚴 原头节内GRP78mRNA表达水平，Westernblot检测转染后细粒棘球蚴原头节内GRP78蛋白 表达水平，鉴定转染效果。
[0009] 其中，RPMI1640培养基是本领域所公知的，其含有10%的牛血清，其配置方法为 本领域技术人员熟知，此处不再赘述。
[0010] 其中，在步骤1)中，青霉素和链霉素的含量为100U/mL，培养条件为37°C、5%C02 恒温培养。
[0011] 在上述条件下，根据细粒棘球蚴的培养特性，优选培养时间为3-4天。
[0012] 其中，在步骤2)中，干扰尺嫩的浓度为311111〇1/1-811111〇1/1，转染时间为0.5-7211。 为了提高转染的成功率，在转染前对细粒棘球蚴进行清洗，清洗方法为细粒棘球蚴原头节 用磷酸盐缓冲液清洗，再用无菌的DEPC处理水清洗。
[0013] 为了保证清洗效果，优选采用多次清洗。
[0014] 其中，步骤2)所用电转缓冲液可参考市场上已有的电转缓冲液进行配置，优选 的，所述电转缓冲液是如下两种电转缓冲液的混合物：电转缓冲液I为加入三磷酸腺苷二 钠盐2g，六水氯化镁1.2g，然后注入双蒸水使溶液达到10ml，过滤除菌；电转缓冲液II为 加入磷酸二氢钾6g，碳酸氢钠0. 2g，葡萄糖0. 2g，然后调节pH到7. 4,接着注入双蒸水使溶 液达到500ml，过滤除菌。
[0015] 上述两种成分的用量可以进行合理调整，优选为电转缓冲液I与电转缓冲液II的 用量比为80ul:4ml。
[0016] 申请人:在研发过程中，对转染的时间、温度、顺序等各种条件进行了大量摸索，发 现使用下列仪器及其设置是最有效的：采用Amaxa2型电转仪，转染参数为D023或U033程 序。
[0017] 上述的电转仪为Lonza生产，在国内外广泛使用，其程序设定可参考机器操作手 nn ) \)i〇
[0018]其中，在步骤3)中，培养条件与步骤1)类似，也为37°C，5%C02恒温培养。
[0019] 本发明的方法可以适用于各种干扰RNA序列到细粒棘球蚴的转染，尤其是所转染 的干扰RNA靶向细粒棘球绦虫的GRP78基因，序列为（siRNA的靶序列）
【权利要求】
1. 电穿孔转染干扰RNA到细粒棘球绦虫的方法，包括下述步骤：1)细粒棘球蚴原头节 在含有青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基中培养1-5天；2)清洗培养后的细粒棘球蚴原 头节，将其加入到RPMI 1640培养基中，接着加入电转缓冲液、干扰RNA到电极杯中，利用 电转仪对细粒棘球蚴原头节进行转染；3)转染好的细粒棘球蚴原头节静置后转移至含有 RPMI 1640培养基的无菌培养皿中，在孵育箱内培养。
2. 根据权利要求1的方法，其特征在于还包括下述步骤：4)通过RT-PCR检测转染后 细粒棘球蚴原头节内GRP78mRNA表达水平，Western blot检测转染后细粒棘球蚴原头节内 GRP78蛋白表达水平，鉴定转染效果。
3. 根据权利要求1的方法，其特征在于在步骤1)中，青霉素和链霉素的含量为100U/ mL，培养条件为37°C、5% C02恒温培养。
4. 根据权利要求1的方法，其特征在于在步骤2)中，干扰RNA的浓度为3 y mol/ L-8iimol/L，转染时间为 0. 5-72h。
5. 根据权利要求1的方法，其特征在于在步骤2)中，清洗方法为细粒棘球蚴原头节用 磷酸盐缓冲液清洗，再用无菌的DEPC处理水清洗。
6. 根据权利要求1的方法，其特征在于在步骤2)中，电转缓冲液是如下两种电转缓冲 液的混合物：电转缓冲液I为加入三磷酸腺苷二钠盐2g，六水氯化镁1. 2g，然后注入双蒸水 使溶液达到l〇ml，过滤除菌；电转缓冲液II为加入磷酸二氢钾6g，碳酸氢钠0. 2g，葡萄糖 0. 2g，然后调节pH到7. 4,接着注入双蒸水使溶液达到500ml，过滤除菌。
7. 根据权利要求6的方法，其特征在于电转缓冲液I与电转缓冲液II的用量比为 80ul ：4ml〇
8. 根据权利要求1的方法，其特征在于在步骤2)中，采用Amaxa 2型电转仪，转染参数 为D023或U033程序。
9. 根据权利要求1的方法，其特征在于在步骤3)中，培养条件为37°C，5% C02恒温培 养。
10. 根据权利要求1的方法，其特征在于所转染的干扰RNA靶向细粒棘球绦 虫的 GRP78 基因，其靶序列为 GGITTCGGCTATGGITCTT，或 GGACATTACAAAGGATGT，或 CCTCGTGGTTTACCTCAAA。
【文档编号】A01K67/033GK104342456SQ201410571966
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】姜玉峰, 吕海龙, 李思源 申请人:姜玉峰