索拉胶在防治土传病原真菌方面的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种索拉胶在防治土传病原真菌方面的应用。将索拉胶置于土壤中，所述索拉胶占土壤质量的0.002％-0.2％。本发明只需要将索拉胶直接拌入土壤，或是间接的混入肥料或农药中再加入到土壤中，索拉胶作为外源碳源，诱导土壤中能降解索拉胶的微生物数量增加，产生更多降解索拉胶的β-1,3葡聚糖酶，最终降解病原真菌；本发明方法更加经济，可行性更高，如果往土壤中直接加入降解真菌的葡聚糖酶，将提高成本；如果往土壤中加入生防微生物，微生物的繁殖和葡聚糖酶的产量受到土壤本身理化性质的影响。
【专利说明】索拉胶在防治土传病原真菌方面的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于农业【技术领域】，本发明具体涉及β -葡聚糖索拉胶在防治土传病原真菌方面的应用。
【背景技术】
[0002]葡聚糖是自然合成的非淀粉多糖，作为细胞壁的重要组成成分广泛存在于微生物、植物、动物界中，也可由细菌分泌到胞外，成为胞外多糖。不同来源的葡聚糖其糖苷键结合方式和比例不同，主链主要由β-1，3糖苷键连接，通常还含有不同比例和大小的β-1，2、β-1，4、β-1，6糖苷键连接的支链。从裂褶菌，褐藻和酵母中提取的葡聚糖主要是带β_1，6-分枝的β-1，3-葡聚糖，燕麦β-葡聚糖主要是β-1，3-1，4-葡聚糖。啤酒酵母细胞壁中的葡聚糖与纤维素一样，极不容易溶于水，还有香菇多糖，可得然等都不易溶于水，因此都难以得到利用。
[0003]索拉胶是一种由土壤杆菌Agrobacterium sp.ΖΧ09分泌产生的胞外多糖，是一种新结构的葡聚糖(已申请中国专利，201010146371.2)，经过急性毒理学和慢性毒理学的评价，索拉胶无毒安全。索拉胶还能降低肝脂、血脂、体脂和体重(已申请中国专利，201010198223.5)，预防和治疗便秘的作用(已申请中国专利，201110028483.2)，具有水溶性生物絮凝剂的作用(已申请中国专利，201210236587.7)，和预防和修复紫外线UVA对皮肤损伤的作用(已申请中国专利，201310730754.8)。
[0004]对土传病害的防控主要集中在耕作防治、物理防控，化学防控和生物防控几个方面。第一，耕作防治是通过一系列的农业实践和农业技术减少害虫和疾病对作物的影响以提高作物的产量和质量，主要包括轮作、去除已染病作物、休耕制、覆盖、避免过度灌溉、株距、除草、播种抗病品种、过度耕种、移植、选择最适的播种时间和收割时间等等。第二，物理防控主要是通过对土壤进行处理以达到防控的目的。第三，化学防控主要是农药保护。其中包括咪鲜胺、敌力脱、噻苯咪唑、多菌灵、麦穗灵、苯菌灵和所有的苯并咪唑。目前仍尚无特效的化学药剂可用于生产上防控所有的土传病原菌。第四，生物防控就是利用微生物间的拮抗、竞争、捕食、寄生等关系抑制病原菌的生长发育与繁殖，从而减少病害的发生。这种防控方法是直接利用有益微生物或者其代谢产物防治植物土传病害，具有对环境安全、无污染、不易引起病原菌产生抗性等优点。
[0005]目前利用生物防控土传病害主要集中在以下两个方面，一、利用拮抗微生物防控土传病害(此方法用得多)；二、利用无毒菌系或用弱毒株系和促生菌诱导作物产生抗病性来防控土传病原菌的侵害。拮抗菌是通过抑制病原菌的生长和诱导植株的系统抗性起作用，又以前者居多。拮抗微生物由主要有三类:细菌，真菌和放线菌。研宄较多的拮抗细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus spp)、焚光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、黄单胞杆菌(Xanthomonas sp.)、棒状杆菌(Corynebacterium sp.)等。其中数芽抱杆菌的研宄最为广泛，芽孢杆菌可以产生杆菌肽、环脂肽、氨基酸等多类抗菌物质，还能产生真菌细胞壁组成成分之一的葡聚糖酶。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是要提供一种索拉胶在防治土传病原真菌方面的应用，该索拉胶具有使用方便、防治土传病原真菌的功能。
[0007]实现本发明目的的技术方案为:一种索拉胶在防治土传病原真菌方面的应用，将索拉胶置于土壤中，所述索拉胶占土壤质量的0.002% -0.2%。
[0008]与现有生物防治的技术相比，本发明具有以下优点:
[0009]1.本发明只需要将索拉胶直接拌入土壤，或是间接的混入肥料或农药中再加入到土壤中，索拉胶作为外源碳源，诱导土壤中能降解索拉胶的微生物数量增加，产生更多降解索拉胶的β-1，3葡聚糖酶，最终降解病原真菌。
[0010]2.本发明方法更加经济，可行性更高，如果往土壤中直接加入降解真菌的葡聚糖酶，将提高成本；如果往土壤中加入生防微生物，微生物的繁殖和葡聚糖酶的产量受到土壤本身理化性质的影响。
[0011]下面结合附图对本发明作进一步的详细描述。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是本发明实施例1索拉胶增加土壤中细菌的菌落数。
[0013]图2是本发明实施例1索拉胶增加土壤中产β-1, 3葡聚糖酶细菌的菌落数。
[0014]图3是本发明实施例1索拉胶增加了土壤β -1, 3葡聚糖酶活性。
[0015]图4是本发明实施例1索拉胶减少土壤中真菌的菌落数。
[0016]图5是本发明实施例1索拉胶减少土壤中土传病原真菌的菌落数。
【具体实施方式】
[0017]下面的实施例可以使本专业技术人员更全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0018]下述实施例中采用的索拉胶结构通式为:
[0019]— {— 3) - β -D-Glcp-(I — 3) -[ β -D-Glcp- (I — 3) - β -D-Glcp-(I — 3) ] 3_ a -D-Glcp- (I 一 3) _ a -D-Glcp- (I 一)} η —
[0020]上述结构中的η基指具有100-10000个葡萄糖基相连的聚合物。
[0021]利用土壤杆菌ΖΧ09生产索拉胶，其步骤如下:
[0022]a、配置培养液:磷酸二氢钠lg，硝酸钾3g，氯化镁0.2g，无水氯化钙0.07g，氯化亚铁 0.0125g，硫酸锰 0.003g，氯化锌 0.0075g，蔗糖 30g，水 1000ml，pH 7.0-7.2 ；
[0023]b、将培养液加热到121°C灭菌15分钟；
[0024]c、向冷却至室温的10mL培养液内加入100 μ L平皿菌落液；
[0025]d、28°C发酵24h形成种子培养液；
[0026]e、向冷却至室温的培养液内加入10%的种子培养液；
[0027]f、在 28°C发酵 48h ;
[0028]h、向发酵液内注入超过两倍体积的乙醇或丙酮，60°C抽真空干燥得到索拉胶粗品O
[0029]下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
[0030]实施例1:实验土壤来源:取南京郊区普通菜地的土壤(受到土传病原真菌感染的土壤)两份。索拉胶改变土壤微生物群落的条件:土壤中加入浓度为0.2%的索拉胶溶液，使土壤中索拉胶的含量分别为0.002%和0.2%。每隔10天取一次土壤样品，一部分用于稀释涂平板计数，另一部分用土壤总DNA提取试剂盒提取土壤总DNA，其实验过程如下:
[0031]1.索拉胶对土壤细菌的影响:
[0032]I)稀释涂平板计数法记录土壤细菌的变化过程:取Ig 土壤样品稀释到1ml无菌磷酸盐缓冲液(15mM，pH 7.0)中，剧烈震荡30min让土壤完全均匀的溶解于缓冲液中，并按此方法和比例进行梯度稀释，最后选择合适的浓度涂布到LB平板，30°C培养24h后计数。如图1所示，土壤中加入0.002%的索拉胶60天后细菌数量增加为空白对照的1.2倍，而加入0.2%的索拉胶60天后细菌数量增加为空白对照的1.5倍。
[0033]2)变性梯度凝胶电泳检测土壤中细菌群落的变化:以土壤整DNA为模板，16SrDNAV3引物357F-GC和518R为引物，以‘touchdown’PCR扩增出16S rDNA V3片段，最后进行变性梯度凝胶电泳。使用10%的聚丙烯酰胺凝胶，变性范围40% -60%，PCR产物加上样缓冲液后上样，50 μ I/孔，电压80V，温度60°C，电泳时间15小时。如图2 (a)所示，加入索拉胶后的土壤细菌群落结构发生了改变。将改变明显的条带切下来TA克隆后测序。如图2(b)所示，有两条带B3和B4都是加入索拉胶后土壤中增加的条带，且这两条带跟芽孢杆菌属具有很近的亲缘关系。
[0034]2.索拉胶对土壤β-1，3-葡聚糖酶活性的影响:
[0035]以5mg/ml的海带多糖为底物，用二硝基水杨酸比色法测量水解得到的葡萄糖的含量来表征土壤β-1，3-葡聚糖酶活性。如图3所示，在加入0.002%和0.2%的索拉胶60天时，β-1, 3-葡聚糖酶的活性分别为0.359mg/g soil/d和0.385mg/g soil/d，跟空白对照相比分别增加了 8%和15%。
[0036]3.索拉胶对土壤真菌的影响:
[0037]I)稀释涂平板计数法记录土壤真菌的变化过程:取Ig 土壤样品稀释到1ml无菌磷酸盐缓冲液(15mM，pH 7.0)中，剧烈震荡30min让土壤完全均匀的溶解于缓冲液中，并按此方法和比例进行梯度稀释，最后选择合适的浓度涂布到PDA平板，30°C培养48h后计数。如图4所示，土壤中加入0.2%的索拉胶60天后真菌数量从105CFU/g减少到104CFU/g，而加入0.02%的索拉胶60天后真菌数量也呈现明显的减少。
[0038]2)变性梯度凝胶电泳检测土壤中真菌群落的变化:以土壤整DNA为模板，18SrDNA引物GC-Fung和NSl为引物，扩增出18S rDNA片段，最后进行变性梯度凝胶电泳。使用8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性范围25% -40%, PCR产物加上样缓冲液后上样，50 μ I/孔，电压60V，温度60°C，电泳时间16小时。如图5(a)所示，加入索拉胶后的土壤真菌群落结构发生了改变。将改变明显的条带切下来TA克隆后测序。如图5(b)所示，变化的条带Fl和F3分别跟镰刀菌属和斑点小球腔菌具有很近的亲缘关系。选择枯萎病病原真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，黑腔病病原真菌斑点小球腔菌(Leptosphaeria)和纹枯病病原真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的特异性引物对土壤中三种病原真菌进行定量检测，相对DNA的量用2 — ΛΛ CT方法分析，以真菌整DNA作为内参。如图5(c)所示，加入0.002%索拉胶的土壤60天后尖孢镰刀菌的相对量从0.99减到0.72，0.2%索拉胶的尖孢镰刀菌的相对量从0.98减少到0.54 ;如图5(d)所示，加入0.002%索拉胶的土壤60天后斑点小球腔菌的相对量从0.98减到0.81，0.2%索拉胶的斑点小球腔菌的相对量从0.97减少到0.64 ；;如图5(e)所示，加入0.002%索拉胶的土壤60天后立枯丝核菌的相对量从
0.99减到0.72，0.2%索拉胶的立枯丝核菌的相对量从0.98减少到0.54。
[0039]实施例2:实验土壤来源:取南京郊区普通菜地的土壤(受到土传病原真菌感染的土壤)两份。索拉胶改变土壤微生物群落的条件:将索拉胶固体粉末加入土壤中，使土壤中索拉胶的含量分别为0.002%和0.2%。每隔10天取一次土壤样品，一部分用于稀释涂平板计数，另一部分用土壤总DNA提取试剂盒提取土壤总DNA。
[0040]1.索拉胶对土壤细菌的影响:
[0041 ] I)稀释涂平板计数法记录土壤细菌的变化过程。土壤中加入0.002%的索拉胶60天后细菌数量增加为空白对照的1.3倍，而加入0.2%的索拉胶60天后细菌数量增加为空白对照的1.5倍。
[0042]2)变性梯度凝胶电泳检测土壤中细菌群落的变化。加入索拉胶后的土壤细菌群落结构发生了改变。将改变明显的条带切下来TA克隆后测序。有两条带是加入索拉胶后土壤中增加的条带，且这两条带跟芽孢杆菌属具有很近的亲缘关系。
[0043]2.索拉胶对土壤β -1, 3-葡聚糖酶活性的影响。在加入0.002%和0.2%的索拉胶60天时，β-1，3-葡聚糖酶的活性分别为0.357mg/g soil/d和0.385mg/g soil/d，跟空白对照相比分别增加了 8%和15%。
[0044]3.索拉胶对土壤真菌的影响:
[0045]I)稀释涂平板计数法记录土壤真菌的变化过程。土壤中加入0.2 %的索拉胶60天后真菌数量从105CFU/g减少到104CFU/g，而加入0.002 %的索拉胶60天后真菌数量也呈现明显的减少。
[0046]2)变性梯度凝胶电泳检测土壤中真菌群落的变化。加入索拉胶后的土壤真菌群落结构发生了改变。将改变明显的条带切下来TA克隆后测序。变化的条带Fl和F3分别跟镰刀菌属和斑点小球腔菌具有很近的亲缘关系。加入0.002%索拉胶的土壤60天后尖孢镰刀菌的相对量从0.99减到0.72，0.2%索拉胶的尖孢镰刀菌的相对量从0.98减少到0.54 ；加入0.002%索拉胶的土壤60天后斑点小球腔菌的相对量从0.98减到0.82，0.2%索拉胶的斑点小球腔菌的相对量从0.97减少到0.64 ;加入0.002%索拉胶的土壤60天后立枯丝核菌的相对量从0.99减到0.74，0.2%索拉胶的立枯丝核菌的相对量从0.98减少到0.55。
[0047]实施例3:实验土壤来源:取南京郊区普通菜地的土壤(受到土传病原真菌感染的土壤)。索拉胶改变土壤微生物群落的条件:将索拉胶固体粉末加入土壤中，使土壤中索拉胶的含量为0.02%。每隔10天取一次土壤样品，一部分用于稀释涂平板计数，另一部分用土壤总DNA提取试剂盒提取土壤总DNA。
[0048]1.索拉胶对土壤细菌的影响:
[0049]I)稀释涂平板计数法记录土壤细菌的变化过程。土壤中加入0.02%的索拉胶60天后细菌数量增加为空白对照的1.3倍。
[0050]2)变性梯度凝胶电泳检测土壤中细菌群落的变化。加入索拉胶后的土壤细菌群落结构发生了改变。将改变明显的条带切下来TA克隆后测序。有两条带是加入索拉胶后土壤中增加的条带，且这两条带跟芽孢杆菌属具有很近的亲缘关系。
[0051]2.索拉胶对土壤β -1, 3-葡聚糖酶活性的影响。在土壤加入0.02%的索拉胶60天后，β-1，3-葡聚糖酶的活性分别为0.378mg/g soil/d，跟空白对照相比增加了 15%。
[0052]3.索拉胶对土壤真菌的影响:
[0053]I)稀释涂平板计数法记录土壤真菌的变化过程。，土壤中加入0.02%的索拉胶60天后真菌数量从105CFU/g减少到104CFU/g。
[0054]2)变性梯度凝胶电泳检测土壤中真菌群落的变化。变化的条带分别跟镰刀菌属和斑点小球腔菌具有很近的亲缘关系。加入0.02%索拉胶的土壤60天后尖孢镰刀菌的相对量从0.98减到0.66 ;斑点小球腔菌的相对量从0.98减到0.85 ;立枯丝核菌的相对量从0.99 减到 0.77。
[0055]本发明中的索拉胶也可以先加入肥料和农药中，再加入土壤。
【权利要求】
1.一种索拉胶在防治土传病原真菌方面的应用，其特征在于，将索拉胶置于土壤中，所述索拉胶占土壤质量的0.002%-0.2%。
2.如权利要求1所述的索拉胶在防治土传病原真菌方面的应用，其特征在于，所述索拉胶具有如下通式卜 3) - β -D-Glcp- (I — 3) - [ β -D-Glcp- (I — 3) - β -D-Glcp- (1-3)]3- a -D-Glcp- (I 一 3) _ a -D-Glcp- (I 一)} η — 其中，η基为具有100-10000个葡萄糖基相连的聚合物。
3.如权利要求1所述的索拉胶在防治土传病原真菌方面的应用，其特征在于，所述索拉胶利用土壤杆菌ΖΧ09制备，其步骤如下: a、配置培养液:磷酸二氢钠lg，硝酸钾3g，氯化镁0.28，无水氯化钙0.078，氯化亚铁 0.01258，硫酸锰0.0038，氯化锌 0.00758，蔗糖3(^，水 1000 ml，pH 7.0-7.2 ； b、将培养液加热到121°C灭菌15分钟； C、向冷却至室温的10mL培养液内加入10PL平皿菌落液； d、28°C发酵24h形成种子培养液； e、向冷却至室温的培养液内加入10%的种子培养液；
f、在28°C 发酵 48h ； h、向发酵液内注入超过两倍体积的乙醇或丙酮，60°C抽真空干燥得到索拉胶粗品。
【文档编号】A01N43/16GK104488867SQ201410579023
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】张建法, 王世明, 陈云美 申请人:南京理工大学