一种大鳞副泥鳅良种选育方法
【专利摘要】本发明公开了一种大鳞副泥鳅良种选育方法。具体而言，该方法包括如下步骤：1）提供12个与生长性状相关的微卫星分子标记；2）选择亲本群体1进行电子标记并提取DNA；3）采用分子标记对亲本群体1进行基因型筛选并选定亲本群体2；4）采用分子标记对亲本群体2进行基因型筛选，分别建立具有不同纯合基因型的亲本群体3和4；5）以亲本群体3和4为繁殖群体，分别进行人工繁殖获得亲本群体5和6；6）亲本群体5和6之间进行杂交并进行规模化繁殖。与传统育种相比，该方法具有迅速、稳定、可靠的特点，实用性强、成本低、准确性高、不受环境等因素的影响，可摆脱对表型性状鉴定的依赖，缩短了育种年限，提高了育种效率，极具应用价值。
【专利说明】一种大鱗副泥鳅良种选育方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于鱼类育种学领域，具体涉及一种大鳞副泥鳅良种选育方法。
【背景技术】
[0002] 大鳞副泥鳅)属鳅科、花鳅亚科、副泥鳅属，是一种分 布于东南亚地区的小型淡水底栖鱼类，国内多分布于四川、浙江、台湾、辽宁、黑龙江等地。 体近圆筒形，头较短。口下位，马蹄形，下唇中央有一小缺口。鼻孔靠近眼，眼下无刺，鳃孔 小。头部无鳞，体鳞较泥鳅为大。须5对，其中吻须2对，口角须1对，颏须2对，各须均长， 口角须后伸可达鳃盖后缘。眼被皮膜覆盖。尾柄处皮褶棱发达，与尾鳍相连。尾柄长与高 约相等。尾鳍圆形。肛门近臀鳍起点。体背部及体侧上半部灰褐色，腹面白色。体侧具有 许多不规则的黑色褐色斑点。背鳍、尾鳍具黑色小点，其他各鳍灰白色。大鳞副泥鳅肉质鲜 美，营养丰富，富含钙、维生素A、维生素D以及多种蛋白质、氨基酸和矿物质，素有"水中人 参"之美誉，具有较高的食用、药用及经济价值，已发展成为我国重要的养殖对象，也是我国 出口韩国的主要水产品之一。
[0003] 中国已成为全世界大鳞副泥鳅养殖规模最大的国家,江苏省大鳞副泥鳅养殖规模 又占居了全国的70%以上。然而，目前用于大鳞副泥鳅养殖的鱼种主要捕捞自天然水域，野 生苗种的质量难以保证，生长性能与养殖效果也极不稳定。众所周知，种质是水产养殖的物 质基础，良种在我国水产业从捕捞为主的产业向以养殖为主的产业的转变过程中起到的作 用不容小觑。传统良种培育技术基本上分为两类：遗传操作和选择操作，遗传操作技术最为 成功的是杂交育种技术，选择操作技术则主要有家系和群体选育。杂交选育面临引入不良 性状尚需多代回交的问题；传统选育要想建成目标品种，至少需要经过多代（4-5代）人工 选择才能育成优良品种(遗传稳定、在生物学、形态学和经济性状基本一致的有一定数量的 群体)。传统选择操作的弊端在于对基因型富集的解释和控制近亲繁殖的方法尚处于经验 阶段，仅间接利用现代遗传学理论，概念模糊，操作和理论间缺乏等价关系，以致育种过程 出现优良品种杂合度低，有害基因通过纯合而表现出来，杂合度和多态性下降，有综合经济 性状下降的隐患。
[0004] 随着分子生物学和基因组学在水产遗传育种上的应用，多种分子标记(如SSR/SNP 等)出现及应用有效地解决了上述问题。然而，国内外目前尚未开始大鳞副泥鳅的系统遗传 选育工作，特别是分子标记辅助选育，优质苗种的缺乏已严重制约了大鳞副泥鳅养殖业的 发展，因此亟待开发出一种大鳞副泥鳅的良种选育方法。
【发明内容】
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种大鳞副泥鳅良种选育方法，从而可以 快速选育出质量可靠、生长性能与养殖效果稳定的大鳞副泥鳅优良品种，此项技术适用于 有较大规模的良种场或国家良种基地进行大鳞副泥鳅的良种选育。
[0006]为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现： 一种大鳞副泥鳅良种选育方法，其包括以下步骤： 1) 提供12个与生长性状相关的微卫星分子标记，其各自对应的引物如下所示： 微卫星分子标记Pda48 的引物：L:5' -TGAGGCACITTGTTTACGCTC-3' ； R:5, -GCTCATGGGACACAAGATGG-3,； 微卫星分子标记Pda66 的引物：L:5' -TACCCTGTGCTAAGGAGGC-3' ； R:5' -AGAGGGAACGGCCAACAG-3,； 微卫星分子标记Pdal74 的引物：L:5' -GTCGGACCTGAAGAGGCAC-3' ； R:5' -TGCCGTCTGTCATCCATGC-3' ； 微卫星分子标记Pda242 的引物：L:5' -TGCCAGCAAITGACATAAAGGG-3' ； R:5' -GATTTCTCAAGCCCAGCGG-3' ； 微卫星分子标记Pda247 的引物：L:5' -ATAGTGCCCGITTCCTGCC-3' ； R:5' -TGGTGAAAGAGTGAAACAATTACC-3' ；微卫星分子标记Pda260 的引物：L: 5' -GCTCTGCTCCGAACATTCC-3' ； R:5' -CTTTCCGTCGCACCTTTCC-3' ； 微卫星分子标记Pda288 的引物：L:5' -AGGTGTGGITTCAGGITGC-3' ； R:5, -ACAGAGGAAACCGGTGAGG-3,； 微卫星分子标记Pda301 的引物：L:5' -CCTGTAGirGACCCAITTCGC-3' ； R:5' -AGAAGGGTGACTTGTCCAAAC-3' ； 微卫星分子标记Pda310 的引物：L:5' -GGGTCTCCACAGTGACGC-3' ； R:5, -CGCTGTCTGAGTGATCCCG-3,； 微卫星分子标记Pda315 的引物：L:5' -ACATCCTGCCTGAGGITCC-3' ； R:5, -TCTTAATGATGACGGCAGAGC-3,； 微卫星分子标记Pda316 的引物：L:5' -TGAGTGGCACGCTCCAAG-3' ； R:5, -CGAGGCCAAACTAACTGCG-3,； 微卫星分子标记Pda371 的引物：L:5' -CTGGITTCAACGGTGGACG-3' ； R:5' -GTGCGTGTCCCTGAACTTG-3' ； 2) 选择体型、体色正常，无病无伤的大鳞副泥鳅个体作为备选亲本群体1，对备选亲本 群体1中的所有个体进行电子标记，并提取DNA; 3) 采用Pda66、Pdal74、Pda242、Pda247、Pda260、Pda288、Pda310、Pda316、Pda371 对备 选亲本群体1进行基因型筛选，选取基因型为AA(对应Pda66)、FF(对应Pdal74)、EE(对应 Pda242)、NN(对应Pda247)、CC(对应Pda260)、CC或DD(对应Pda288)、CC(对应Pda310)、 BB或AA(对应Pda316)、AA或BB(对应Pda371)的个体作为备选亲本群体2 ; 4) 采用Pda48、Pda301、Pda315对备选亲本群体2进行基因型筛选，获得基因型分别为 AA或FF(对应Pda48)、AA或BB(对应Pda301)、BB或CC(对应Pda315)的个体，将同一基 因位点具有相同基因型的个体进行单独培育，分别建立备选亲本群体3和备选亲本群体4 ; 5) 以备选亲本群体3为繁殖群体，进行人工繁殖一代获得后备亲本群体5 ;以备选亲本 群体4为繁殖群体，进行人工繁殖一代获得后备亲本群体6 ; 6) 按照亲本群体5中的雌性个体X亲本群体6中的雄性个体或亲本群体5中的雄性 个体X亲本群体6中的雌性个体的配对方式进行规模化繁殖，即可获得大鳞副泥鳅良种， 完成选育过程。
[0007] 在实际生产操作中，当步骤6)完成之后，可以重复步骤2)至步骤6)的操作，并监 控选育系遗传背景，防止近亲交配。
[0008] 优选的，在上述方案中，步骤1)中所述微卫星分子标记依下法获得： a) 选取不同年龄及性别的大鳞副泥鳅，采集多种组织并提取RNA，等量移取并混合成 总RNA，分离出mRNA，反转录获得cDNA文库，PCR扩增富集后回收目的片段，定量后采用第 二代高通量测序平台（IlluminaHiseq2000平台）进行测序，测序后采用序列组装软件 (Trinity软件）组装测序片段，得到转录本序列； b) 采用微卫星分子标记捕获软件(Msatco_ander软件）扫描步骤a)中获得的转录本 序列，筛选出核心序列长度为10-360bp的微卫星分子标记，对侧翼序列长度为50bp以上 的微卫星分子标记进行引物设计； c) 根据转录组GO功能注释的结果，选取分类到生长过程条目的微卫星分子标记，加之 随机选取的其他微卫星分子标记，共计合成微卫星引物400对； d) 收集不同地域的大鳞副泥鳅野生群体，观察并比较其形状差异，选取差异最大的群 体进行杂交，人工催产获得全同胞家系群体； e) 随机采用步骤b)中的微卫星分子标记对步骤d)中获得的大鳞副泥鳅全同胞家系群 体中的个体进行扫描，进行微卫星分子标记与家系群体的生长性状之间的相关分析，筛选 出12个与生长性状相关的微卫星分子标记。
[0009] 此外，本发明还请求保护在上述大鳞副泥鳅良种选育方法中使用的12个微卫星 分子标记的引物。
[0010] 与现有技术相比，本发明的大鳞副泥鳅良种选育方法具有如下有益效果：分子标 记辅助育种（marker-assistantselection,简称MAS)利用分子标记从DNA水平上对育种 材料进行选择，从而加快进程获得具有目的性状的后代。与传统育种相比，MS方法具有迅 速、稳定、可靠的特点，实用性强、成本低、准确性高、不受环境等因素的影响，可摆脱对表型 性状鉴定的依赖，在早世代进行选择，从而大大缩短育种年限(理论上经过3代就可以选择 出理想的优质种群)，提高育种效率，极具应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1为从不同性别的大鳞副泥鳅体内各组织中采集的RNA样品的电泳图。
[0012] 图2为转录本序列长度分布图。
[0013] 图3为转录组GO功能注释(生物过程水平）结果示意图。
[0014] 图4为12个微卫星分子标记在大鳞副泥鳅群体中的部分电泳图，其中每个泳道 代表一个大鳞副泥鳅个体，M代表DNA分子量标准，条带由上到下依次为1000bp，700bp， 500bp，400bp，300bp，200bp和100bp，由图可知12个分子标记在群体中不同个体的带型(基 因型）有明显差异。
【具体实施方式】
[0015] 除非有相反陈述，下列用在说明书和权利要求书中的术语具有下述含义。
[0016] "良种"是指与养殖业中正在使用的同物种的多数养殖群体相比，具有比较优势的 一个或多个经济性状的品种，其中养殖鱼类的经济性状一般为生长性、出肉率、抗逆性等。
[0017] "良种选育"是指通过直接或间接筛选方法对基础群体的一个或多个优良经济性 状进行世代选择以获得良种的过程。
[0018] "微卫星分子标记（MicrosatelliteMolecularMarker，MMM)" 是指一种遗传标 记，又称短串联重复（ShortTandemRepeats，STR)或简单重复序列（SimpleSequence R印eats，SSR)，是以1-6个碱基的序列串联重复而成的DNA序列，长度一般在几十到几百个 喊基。
[0019] "高通量测序平台"包括三种主流的第二代测序技术，分别为Roche/454焦磷酸测 序、Illumina/Solexa聚合酶合成测序和ABI/SOLiD连接酶测序技术，三种测序技术共有的 突出特征是单次运行产出序列数据量大，故而又被通称为"高通量测序技术"。
[0020] "转录组GO功能注释"是基于基因本体（GeneOntology,G0)对转录组数据进行的 基因功能注释和分类方法，其包括生物过程、分子功能和细胞组件三个分支，属生物信息学 范畴。
[0021] "基因型"是指决定物种特定性状的遗传物质(基因）表现形式，例如AA基因型代 表红色花色性状，BB基因型代表白色花色性状，AB基因型代表粉色花色性状。
[0022] "生长性状"是指与生长相关的性状，如体长、体高等，其中"全长"是指鱼吻端到尾 鳍末端的长度；"体长"是指鱼吻端到尾鳍基部或末端椎骨的长度；"体高"是指鱼体的最大 高度；"体重"是指鱼体的质量；"空壳重"是指去除内脏团后鱼体的质量。
[0023] "基因型与生长性状相关分析"是指利用统计学方法分析基因型与生长性状(如体 长）有无相关性及相关性显著程度。
[0024] "家系群体"是指用于遗传图谱绘制的试验群体，包括全同胞家系(来源于相同父 母亲的群体）和半同胞家系（同父异母或同母异父的群体)。
[0025] "备选亲本群体"是指用于选择人工繁殖用雌、雄亲鱼的性成熟群体。
[0026] "后备亲本群体"是指将来用于选择人工繁殖用雌、雄亲本的群体，群体内个体不 一定性成熟。
[0027] "电子标记"又称为电子标签、射频标签、应答器、数据载体，是指利用有别于传统 物理标记的，基于电子芯片的，可以通过注射器注射的标签来标记不同受试动物的方法。
[0028] 较佳实施例：大鳞副泥鳅的良种选育。
[0029] 1、大鳞副泥鳅转录组数据库的构建： 选大鳞副泥鳅家系群体的亲本为实验材料，雄鳅、雌鳅分别来自洞庭湖和洪泽湖。用 100mg/L的间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222)进行麻醉后，采集雌雄泥鳅的多种组织 (雌、雄鱼的肌肉、骨骼、鳍条、脑、脾脏、肝胰脏及雌鱼的卵)，按说明书（D311A试剂，宝生物 工程(中国）有限公司）的要求置于RNA保存液中，冻存备用。具体操作如下： 采用TRIzof试剂（100ml，生命科学（中国）公司）提取上述各种组织的RNA(其电泳 图如图1所示，图中每个泳道包含两到三条带，说明RNA质量较好，满足测序要求)，质量检 测合格后等量移取各种RNA最终混合成5iig总RNA，用带有oligo(dT)的磁珠分离出具 有PolyA尾的mRNA，离子法打断mRNA，然后用6碱基随机引物反转录得到一链cDNA，加入 dNTPs、RNaseH和DNA聚合酶I合成二链cDNA。得到双链cDNA之后通过T4连接酶末端补平 并且连接"A"碱基，最后连接index接头。以上构建文库的试剂盒是Truseq?RNAsample prepKit。对得到的文库进行PCR扩增富集，然后用2%的琼脂糖胶回收目的片段。用TBS380 对文库进行定量，在Hiseq2000测序平台上测序。测序后经过去冗余和低质量片段过滤后， 剩余39, 751，380条序列片段，加之大鳞副泥鳅两个肌肉转录组序列样本共计105, 308, 078 个片段（10. 47Gb)，采用Trinity软件组装测序片段，组装后得到71，887个转录组序列，均 长1464. 58bp，总长度105, 284, 263bp，序列均长1464. 58bp，其中大于IOOObp的序列有 34, 603 (48. 1%)条，适于微卫星分子标记的批量挖掘(具体数据参见图2)。
[0030] 2、批量开发大鳞副泥鳅微卫星分子标记： 采用Msatcommander软件对所有转录组序列进行SSR筛选，参数设计为核心序列大于 12bp的，发现SSR位点有15106个，用Primer3. 0软件对侧翼序列>50bp的所有微卫星分 子标记进行引物设计，具体引物设计参数详见表1。
【权利要求】
1. 一种大鳞副泥鳅良种选育方法，其包括以下步骤： 1) 提供12个微卫星分子标记，其各自对应的引物如下所示： 微卫星分子标记 Pda48 的引物：L :5' -TGAGGCACITTGTTTACGCTC-3' ； R:5, -GCTCATGGGACACAAGATGG-3,； 微卫星分子标记 Pda66 的引物：L :5' -TACCCTGTGCTAAGGAGGC-3' ； R :5' -AGAGGGAACGGCCAACAG-3,； 微卫星分子标记 Pdal74 的引物：L :5' -GTCGGACCTGAAGAGGCAC-3' ； R:5' -TGCCGTCTGTCATCCATGC-3' ； 微卫星分子标记 Pda242 的引物：L :5' -TGCCAGCAAITGACATAAAGGG-3' ； R:5' -GATTTCTCAAGCCCAGCGG-3' ； 微卫星分子标记 Pda247 的引物：L :5' -ATAGTGCCCGITTCCTGCC-3' ； R :5' -TGGTGAAAGAGTGAAACAATTACC-3' ；微卫星分子标记 Pda260 的引物：L : 5' -GCTCTGCTCCGAACATTCC-3' ； R:5' -CTTTCCGTCGCACCTTTCC-3' ； 微卫星分子标记 Pda288 的引物：L :5' -AGGTGTGGITTCAGGITGC-3' ； R :5, -ACAGAGGAAACCGGTGAGG-3,； 微卫星分子标记 Pda301 的引物：L :5' -CCTGTAGirGACCCAITTCGC-3' ； R：5, -AGAAGGGTGACTTGTCCAAAC-3,； 微卫星分子标记 Pda310 的引物：L :5' -GGGTCTCCACAGTGACGC-3' ； R:5, -CGCTGTCTGAGTGATCCCG-3,； 微卫星分子标记 Pda315 的引物：L :5' -ACATCCTGCCTGAGGITCC-3' ； R:5, -TCTTAATGATGACGGCAGAGC-3,； 微卫星分子标记 Pda316 的引物：L :5' -TGAGTGGCACGCTCCAAG-3' ； R:5, -CGAGGCCAAACTAACTGCG-3,； 微卫星分子标记 Pda371 的引物：L :5' -CTGGITTCAACGGTGGACG-3' ； R:5' -GTGCGTGTCCCTGAACTTG-3' ； 2) 选择体型、体色正常，无病无伤的大鳞副泥鳅个体作为备选亲本群体1，对备选亲本 群体1中的所有个体进行电子标记，并提取DNA ; 3) 采用 Pda66、Pdal74、Pda242、Pda247、Pda260、Pda288、Pda310、Pda316、Pda371 对备 选亲本群体1进行基因型筛选，选取基因型为Pda66对应的AA、Pdal74对应的FF、Pda242 对应的EE、Pda247对应的NN、Pda260对应的CC、Pda288对应的CC或DD、Pda310对应的 CC、Pda316对应的BB或AA、Pda371对应的AA或BB的个体作为备选亲本群体2 ; 4) 采用Pda48、Pda301、Pda315对备选亲本群体2进行基因型筛选，获得基因型分别为 Pda48对应的AA或FF、Pda301对应的AA或BB、Pda315对应的BB或CC的个体，将同一基 因位点具有相同基因型的个体进行单独培育，分别建立备选亲本群体3和备选亲本群体4 ; 5) 以备选亲本群体3为繁殖群体，进行人工繁殖一代获得后备亲本群体5 ;以备选亲本 群体4为繁殖群体，进行人工繁殖一代获得后备亲本群体6 ; 6) 按照亲本群体5中的雌性个体X亲本群体6中的雄性个体或亲本群体5中的雄性 个体X亲本群体6中的雌性个体的配对方式进行规模化繁殖，即可获得大鳞副泥鳅良种， 完成选育过程。
2. 根据权利要求1所述的大鳞副泥鳅良种选育方法，其特征在于，在步骤6)完成之后 重复步骤2)至步骤6)的操作。
3. 根据权利要求1所述的大鳞副泥鳅良种选育方法，其特征在于，步骤1)中所述微卫 星分子标记依下法获得： a) 选取不同年龄及性别的大鳞副泥鳅，采集多种组织并提取RNA，等量移取并混合成 总RNA，分离出mRNA，反转录获得cDNA文库，PCR扩增富集后回收目的片段，定量后采用 Illumina Hiseq 2000平台进行测序，测序后采用Trinity软件组装测序片段，得到转录本 序列； b) 采用Msatcommander软件扫描步骤a)中获得的转录本序列，筛选出核心序列长度 为10-360 bp的微卫星分子标记，对侧翼序列长度为50 bp以上的微卫星分子标记进行引 物设计； c) 根据转录组GO功能注释的结果，选取分类到生长过程条目的微卫星分子标记，加之 随机选取的其他微卫星分子标记，共计合成微卫星引物400对； d) 收集不同地域的大鳞副泥鳅野生群体，观察并比较其形状差异，选取差异最大的群 体进行杂交，人工催产获得全同胞家系群体； e) 随机采用步骤b)中的微卫星分子标记对步骤d)中获得的大鳞副泥鳅全同胞家系群 体中的个体进行扫描，进行微卫星分子标记与家系群体的生长性状之间的相关分析，筛选 出12个与生长性状相关的微卫星分子标记。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的大鳞副泥鳅良种选育方法中使用的12个微卫 星分子标记的引物。
【文档编号】A01K61/00GK104351096SQ201410606181
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】凌去非, 李彩娟 申请人:苏州大学