一种战骨的组织培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种战骨的组织培养方法，包括：诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养，其中，诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养在固体培养基中进行。本发明提供的战骨的组织培养方法能够快速繁殖出大量适合移栽的优良战骨种苗，满足生产上的需要。
【专利说明】一种战骨的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物繁殖方法，尤其涉及一种战骨的组织培养方法。
【背景技术】
[0002]战骨，为马鞭草科植物黄毛豆腐柴，其茎或根入药称斑鸠占，味辛、微甘，性微温；有活血散瘀、强筋健骨、祛风止痛的功效，用于风湿痹痛、肥大性脊接骨椎炎、肩周炎、肾虚阳痿、月经延期等症。
[0003]战骨的生产主要靠野生资源，地域分布零散且蕴藏量稀少。随着以战骨为主要原料的“健骨注射液”、“跌打生骨颗粒”、“复方黄毛豆腐柴搽剂”等系列产品的开发，其市场需求量逐年攀升，野生资源遭到过度采挖，濒临枯竭。在自然条件下，战骨主要依靠种子进行繁殖，但因其结实量大而叶片的光合产物供应有限，致使果实细小，种子发育不完整、生活力低，生产上难以实现大面积栽培。采用生物技术一组织培养技术，可以有效快速地提高战骨的种苗质量和繁殖系数，实现战骨优质种苗的工厂化育苗，以满足生产上的需要。
[0004]植物组织培养用的外植体大部分取自田间，表面上附着有大量的微生物，为了获得无菌外植体，在外植体接种培养前必须进行消毒处理，消毒要求杀灭外植体表面的微生物，同时保证对外植体的损伤尽可能小。外植体的消毒是植物组织培养中的首要环节，也是最重要的环节。现有的消毒处理，大多采用双氧水、次氯酸钠、抗生素和升汞等进行消毒，存在着消毒效果差，消毒剂残留，对外植体和人体伤害大，严重污染环境等问题。
[0005]现有的组织培养用的固体培养基干化较快，培养物周边容易堆积代谢产物，导致培养基的营养成分分布不均匀，影响植物的生长。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
[0007]本发明提供的技术方案为:
[0008]一种战骨的组织培养方法，包括:
[0009]诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养，所述诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养在固体培养基中进行。
[0010]优选的是，所述的战骨的组织培养方法中，在所述固体培养基中放入明胶海绵，所述明胶海绵为边长0.5cm的立方体，每升所述固体培养基中放置有100-120个所述明胶海绵，当所述固体培养基凝固时，所述明胶海绵全部均匀浸入所述固体培养基中。
[0011]优选的是，所述的战骨的组织培养方法中，所述诱导培养中，将外植体在温度为24-26°C，光照强度为15001UX，及光照时间为10_12h/d的条件下培养20d，诱导不定芽萌发，以得到无菌试管苗；
[0012]所述诱导培养中的固体培养基包含:MS，30g.Γ1蔗糖，1.0mg.L_V苄基腺嘌呤，
0.2mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
[0013]优选的是，所述的战骨的组织培养方法中，在所述诱导培养之后进行所述增殖培养，将经过所述诱导培养得到的无菌试管苗在温度为24-26°C，光照强度为15001uX，及光照时间为10-12h/d的条件下培养30d，得到大量不定芽；
[0014]所述增殖培养中的固体培养基包含:MS，30g.Γ1蔗糖，1.0g.Γ1活性炭，
1.0-2.0mg.1^6-苄基腺嘌呤，0.1-1.0mg ?Γ1 萘乙酸，0.3-0.5mg.171 吲哚乙酸和 3.5g.171琼脂，并调节初始PH值为5.8。
[0015]优选的是，所述的战骨的组织培养方法中，在所述增殖培养之后进行所述壮苗培养，将经过所述增殖培养得到的不定芽在温度为24-26°C，光照强度为15001uX，及光照时间为10-12h/d的条件下培养30d，得到健壮植株；
[0016]所述壮苗培养中的固体培养基包含:MS，30g.Γ1蔗糖，1.0g.Γ1活性炭，0.5-1.5mg.L-V苄基腺嘌呤，0.l_2mg.L-1的萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为 5.8。
[0017]优选的是，所述的战骨的组织培养方法中，在所述壮苗培养之后进行所述生根培养，将经过所述壮苗培养得到的健壮植株在温度为24-26°C，光照强度为15001uX，及光照时间为10-12h/d的条件下培养30d，得到带根苗；
[0018]所述生根培养中的固体培养基包含:l/2MS,30g.L—1蔗糖，1.0g.L-1活性炭，0.3-0.5mg.L-1生根粉，1.0-2.0mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
[0019]优选的是，所述的战骨的组织培养方法中，在所述诱导培养之前还包括获得无菌外植体的步骤，所述获得无菌外植体的步骤为:
[0020]步骤一、取带腋芽的茎段作为外植体，放置于烧杯中，加入质量分数为0.05% -0.1 %的洗洁精水溶液浸泡5-10min，浸泡过程中用毛笔轻轻洗刷所述外植体表面污垢，取出所述外植体后用流水冲洗15-20min，移至超净工作台；
[0021]步骤二、将所述步骤一中处理后的外植体在体积分数为70% -75%的酒精中浸泡10-20秒，然后将所述外植体在含有重量份数为0.01-0.1份的表面活性剂、0.1-1.0份的抗菌肽和70-100份的无菌水的混合溶液中浸泡10-20min，再利用低温等离子体处理浸泡在所述混合溶液中的外植体l-5min,取出所述外植体后用无菌水冲洗3_5次,一次2_5min,最后用无菌吸水纸吸干所述外植体表面水分，切成0.5-0.8cm的带一个腋芽的茎段，得到无菌外植体。
[0022]优选的是，所述的战骨的组织培养方法中，所述步骤二中所述表面活性剂为吐温-20、蔗糖酯和十六烷基三甲基氯化铵中的任意一种或几种。
[0023]优选的是，所述的战骨的组织培养方法中，所述步骤二中利用所述低温等离子体处理所述外植体的步骤为:将大气压低温等离子体装置的喷嘴没入所述混合溶液液面以下，在所述大气压低温等离子体装置内通入氧气和氦气质量比为1: 20的混合气体，然后打开放电装置，放电处理l_5min让所述大气压低温等离子体装置产生的低温等离子体与水接触，对所述混合溶液中的外植体进行杀菌处理。
[0024]优选的是，所述的战骨的组织培养方法中，在所述生根培养之后还包括炼苗移栽的步骤，所述炼苗移栽的步骤为:
[0025]步骤(I)、在温度23_25°C下，向所述生根培养的固体培养基中加入水使所述生根培养的固体培养基全部位于水中，并继续培养3-5d ;以及，
[0026]步骤(2)、洗净所述步骤(I)中处理后的试管苗的根部培养基，移栽到泥炭土与细河沙质量比为3: I的混合基质中培养30-40d，再移栽至大田。
[0027]本发明提供了一种战骨的组织培养方法。本发明的优点是:
[0028]第一、本发明中对外植体先用乙醇浸泡消毒，乙醇具有杀菌速度较快，对人体刺激性小，无毒，对外植体无损伤等优点；再用抗菌肽浸泡消毒，抗菌肽具有热稳定性好，广谱抗菌，无耐药性，对人体和外植体无损伤等优点；最后用低温等离子体消毒，高电压放电低温等离子体，综合了自由基、臭氧、过氧化氢等强氧化化学效应和紫外线辐射、高强电磁场等物理效应，同时破坏微生物细胞体和遗传物质DNA，能在常温、常压条件下实现快速、高效地杀菌，不会损伤外植体，且安全环保，无残留。
[0029]第二、由于固体培养基干化较快，培养物周边容易堆积代谢产物，导致培养基的营养成分分布不均匀。本发明在固体培养基中放入了明胶海绵，明胶海绵吸水性很强，明胶海绵在培养基没有凝固时，能吸收很多培养基，这样，能有效地保持营养成分，使营养成分的分布比较均匀，促进外植体的生长。
[0030]第三、本发明在诱导培养基中添加6-苄基腺嘌呤和萘乙酸，能够诱导不定芽萌发；在增殖培养基中添加6-苄基腺嘌呤、萘乙酸和吲哚乙酸可促进不定芽的分化和生长；在壮苗培养基中添加6-苄基腺嘌呤和萘乙酸可促进苗壮和芽的再次增殖；在1/2MS生根培养基中添加生根粉和萘乙酸可获得完整的带根苗，经炼苗后可直接移栽至基质中。
[0031]第四、本发明采用生物技术对战骨进行组织培养快速繁殖，保持了原有品种的优良性状，在短时间内培育出大量可供大田栽培的战骨幼苗，显著提高了战骨的种苗质量和繁殖系数，适用于工厂化生产，从而满足生产上的需要。
[0032]第五、本发明得到的单芽增殖系数达6.5倍以上，经过扩繁、壮苗和生根培养，组培苗生根率达93.7%以上，移栽基质后成活率在90.4%以上。本发明提供的战骨的组织培养方法能够快速繁殖出大量适合移栽的优良战骨种苗，满足生产上的需要。
【具体实施方式】
[0033]下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0034]实施例1:
[0035]一种战骨的组织培养方法，包括以下步骤:
[0036]步骤一、外植体的取材与消毒:取带腋芽的茎段作为外植体，放置烧杯中，用质量分数为0.05%的洗洁精水溶液浸泡5min，浸泡过程中用毛笔轻轻清洗外植体表面污垢，再经流水冲洗15min ;移至超净工作台，用添加了 2-3滴吐温-20的10mL质量分数为0.1%的升萊消毒8min,然后用无菌水冲洗3次,再用无菌吸水纸吸干表面水分,切成0.5cm带一个腋芽的茎段，获得无菌外植体；
[0037]步骤二、无菌试管苗的获取:将所述步骤一中得到的无菌外植体接种到诱导培养基中，在培养温度为24°C，光照强度为15001UX，光照时间为10h/d的条件下培养20d，诱导不定芽萌发，得到无菌试管苗；其中所述诱导培养基以MS为基本培养基，附加30g.L—1蔗糖、1.0mg.L—V苄基腺嘌呤、0.2mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8 ;
[0038]步骤三、试管苗繁殖培养:将所述步骤二中得到的无菌试管苗置于增殖培养基中，在培养温度为24°C，光照强度为15001UX，光照时间为10h/d的条件下培养30d，得到大量不定芽；其中所述增殖培养基以MS为基本培养基，附加30g.Γ1蔗糖、1.0g.Γ1活性炭、
1.0mg.L-V苄基腺嘌呤、0.1mg.L-1萘乙酸、0.3mg.L-1吲哚乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始PH值为5.8 ;
[0039]步骤四、试管苗壮苗培养:将所述步骤三中得到的试管苗不定芽置于壮苗培养基中，在培养温度为24°C，光照强度为15001UX，光照时间为10h/d的条件下培养30d，得到健壮植株；其中所述壮苗培养基以MS为基本培养基，附加30g.I/1蔗糖、1.0g.Γ1活性炭、
0.5mg.L-V苄基腺嘌呤、0.1mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8 ;
[0040]步骤五、试管苗生根培养:将所述步骤四中得到的健壮植株置于生根培养基中，在培养温度为24°C，光照强度为15001UX，光照时间为10h/d的条件下培养30d，得到完整的带根苗；其中所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加30g.Γ1蔗糖、1.0g.Γ1活性炭、
0.3mg.L-1生根粉、1.0mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8 ;
[0041]步骤六、试管苗炼苗移栽:经过所述步骤五处理得到完整的带根苗后，在室温为230C的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水淹没培养基，炼苗3d，用镊子取出试管苗，洗净根部培养基，移栽到泥炭土与细河沙质量比为3: I的基质中生长30d，再移栽至大田。
[0042]实施例2:
[0043]一种战骨的组织培养方法，包括以下步骤:
[0044]步骤一、外植体的取材与消毒:取带腋芽的茎段作为外植体，放置烧杯中，用质量分数为0.05%的洗洁精水溶液浸泡5min，浸泡过程中用毛笔轻轻清洗外植体表面污垢，再经流水冲洗15min ;移至超净工作台，用添加了 2-3滴吐温-20的10mL质量分数为0.1%的升萊消毒1min,然后用无菌水冲洗5次,再用无菌吸水纸吸干表面水分,切成0.8cm带一个腋芽的茎段，获得无菌外植体；
[0045]步骤二、无菌试管苗的获取:将所述步骤一中得到的无菌外植体接种到诱导培养基中，在培养温度为26°C，光照强度为15001UX，光照时间为12h/d的条件下培养20d，诱导不定芽萌发，得到无菌试管苗；其中所述诱导培养基以MS为基本培养基，附加30g.L—1蔗糖、1.0mg.L—V苄基腺嘌呤、0.2mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8 ;
[0046]步骤三、试管苗繁殖培养:将所述步骤二中得到的无菌试管苗置于增殖培养基中，在培养温度为26°C，光照强度为15001UX，光照时间为12h/d的条件下培养30d，得到大量不定芽；其中所述增殖培养基以MS为基本培养基，附加30g.Γ1蔗糖、1.0g.Γ1活性炭、
2.0mg.L-V苄基腺嘌呤、1.0mg.L-1萘乙酸、0.5mg.L-1吲哚乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始PH值为5.8 ;
[0047]步骤四、试管苗壮苗培养:将所述步骤三中得到的试管苗不定芽置于壮苗培养基中，在培养温度为26°C，光照强度为15001UX，光照时间为12h/d的条件下培养30d，得到健壮植株；其中所述壮苗培养基以MS为基本培养基，附加30g.I/1蔗糖、1.0g.Γ1活性炭、
1.5mg.L-V苄基腺嘌呤、2.0mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8 ;
[0048]步骤五、试管苗生根培养:将所述步骤四中得到的健壮植株置于生根培养基中，在培养温度为26°C，光照强度为15001UX，光照时间为12h/d的条件下培养30d，得到完整的带根苗；其中所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加30g.Γ1蔗糖、1.0g.Γ1活性炭、
0.5mg.L-1生根粉、2.0mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8 ;
[0049]步骤六、试管苗炼苗移栽:经过所述步骤五处理得到完整的带根苗后，在室温为250C的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水淹没培养基，炼苗5d，用镊子取出试管苗，洗净根部培养基，移栽到泥炭土与细河沙质量比为3: I的基质中生长40d，再移栽至大田。
[0050]实施例3:
[0051]一种战骨的组织培养方法，包括以下步骤:
[0052]步骤一、外植体的取材与消毒:取带腋芽的茎段作为外植体，放置烧杯中，用质量分数为0.05%的洗洁精水溶液浸泡5min，浸泡过程中用毛笔轻轻清洗外植体表面污垢，再经流水冲洗15min ;移至超净工作台，用添加了 2-3滴吐温-20的10mL质量分数为0.1%的升萊消毒9min,然后用无菌水冲洗4次,再用无菌吸水纸吸干表面水分,切成0.6cm带一个腋芽的茎段，获得无菌外植体；
[0053]步骤二、无菌试管苗的获取:将所述步骤一中得到的无菌外植体接种到诱导培养基中，在培养温度为25°C，光照强度为15001UX，光照时间为llh/d的条件下培养20d，诱导不定芽萌发，得到无菌试管苗；其中所述诱导培养基以MS为基本培养基，附加30g.L—1蔗糖、1.0mg.L—V苄基腺嘌呤、0.2mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8 ;
[0054]步骤三、试管苗繁殖培养:将所述步骤二中得到的无菌试管苗置于增殖培养基中，在培养温度为25°C，光照强度为15001UX，光照时间为llh/d的条件下培养30d，得到大量不定芽；其中所述增殖培养基以MS为基本培养基，附加30g.Γ1蔗糖、1.0g.Γ1活性炭、1.5mg.L-V苄基腺嘌呤、0.5mg.L-1萘乙酸、0.4mg.L-1吲哚乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始PH值为5.8 ;
[0055]步骤四、试管苗壮苗培养:将所述步骤三中得到的试管苗不定芽置于壮苗培养基中，在培养温度为25°C，光照强度为15001UX，光照时间为llh/d的条件下培养30d，得到健壮植株；其中所述壮苗培养基以MS为基本培养基，附加30g.Γ1蔗糖、1.0g.Γ1活性炭、
1.0mg.L-V苄基腺嘌呤、1.0mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8 ;
[0056]步骤五、试管苗生根培养:将所述步骤四中得到的健壮植株置于生根培养基中，在培养温度为25°C，光照强度为15001UX，光照时间为Ilh/d的条件下培养30d，得到完整的带根苗；其中所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加30g.Γ1蔗糖、1.0g.Γ1活性炭、
0.4mg.L-1生根粉、1.5mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8 ;
[0057]步骤六、试管苗炼苗移栽:经过所述步骤五处理得到完整的带根苗后，在室温为240C的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水淹没培养基，炼苗4d，用镊子取出试管苗，洗净根部培养基，移栽到泥炭土与细河沙质量比为3:1的基质中生长35d，再移栽至大田。
[0058]实施例4:
[0059]一种战骨的组织培养方法，包括:
[0060]诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养，所述诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养在固体培养基中进行。
[0061]所述的战骨的组织培养方法中，在所述固体培养基中放入明胶海绵，所述明胶海绵为边长0.5cm的立方体，每升所述固体培养基中放置有110个所述明胶海绵，当所述固体培养基凝固时，所述明胶海绵全部均匀浸入所述固体培养基中。
[0062]所述的战骨的组织培养方法中，所述诱导培养中，将外植体在温度为25°C，光照强度为15001UX，及光照时间为llh/d的条件下培养20d，诱导不定芽萌发，以得到无菌试管苗；
[0063]所述诱导培养中的固体培养基包含:MS,30g.L 1鹿糖，1.0mg.L 节基腺嘌呤，
0.2mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
[0064]所述的战骨的组织培养方法中，在所述诱导培养之后进行所述增殖培养，将经过所述诱导培养得到的无菌试管苗在温度为25°C，光照强度为15001uX，及光照时间为llh/d的条件下培养30d，得到大量不定芽；
[0065]所述增殖培养中的固体培养基包含:MS，30g.L—1蔗糖，1.0g.Γ1活性炭，
1.5mg.L-V苄基腺嘌呤，0.5mg.L-1萘乙酸，0.4mg.L-1吲哚乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
[0066]所述的战骨的组织培养方法中，在所述增殖培养之后进行所述壮苗培养，将经过所述增殖培养得到的不定芽在温度为25°C，光照强度为15001uX，及光照时间为llh/d的条件下培养30d，得到健壮植株；
[0067]所述壮苗培养中的固体培养基包含:MS，30g.L—1蔗糖，1.0g.Γ1活性炭，
1.0mg.L-V苄基腺嘌呤，1.0mg.L-1的萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
[0068]所述的战骨的组织培养方法中，在所述壮苗培养之后进行所述生根培养，将经过所述壮苗培养得到的健壮植株在温度为25°C，光照强度为15001uX，及光照时间为llh/d的条件下培养30d，得到带根苗；
[0069]所述生根培养中的固体培养基包含:l/2MS,30g.L—1蔗糖，1.0g.L-1活性炭，
0.4mg.L-1生根粉，1.5mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
[0070]所述的战骨的组织培养方法中，在所述诱导培养之前还包括获得无菌外植体的步骤，所述获得无菌外植体的步骤为:
[0071]步骤一、取带腋芽的茎段作为外植体，放置于烧杯中，加入质量分数为0.75%的洗洁精水溶液浸泡7min，浸泡过程中用毛笔轻轻洗刷所述外植体表面污垢，取出所述外植体后用流水冲洗17min，移至超净工作台；
[0072]步骤二、将所述步骤一中处理后的外植体在体积分数为73%的酒精中浸泡15秒，然后将所述外植体在含有重量份数为0.05份的十六烷基三甲基氯化铵、0.5份的抗菌肽和85份的无菌水的混合溶液中浸泡15min，再利用低温等离子体处理浸泡在所述混合溶液中的外植体3min,取出所述外植体后用无菌水冲洗4次,一次4min,最后用无菌吸水纸吸干所述外植体表面水分，切成0.6cm的带一个腋芽的茎段，得到无菌外植体。
[0073]所述的战骨的组织培养方法中，所述步骤二中利用所述低温等离子体处理所述外植体的步骤为:将大气压低温等离子体装置的喷嘴没入所述混合溶液液面以下，在所述大气压低温等离子体装置内通入氧气和氦气质量比为1: 20的混合气体，然后打开放电装置，放电处理3min让所述大气压低温等离子体装置产生的低温等离子体与水接触，对所述混合溶液中的外植体进行杀菌处理。
[0074]所述的战骨的组织培养方法中，在所述生根培养之后还包括炼苗移栽的步骤，所述炼苗移栽的步骤为:
[0075]步骤(I)、在温度24°C下，向所述生根培养的固体培养基中加入水使所述生根培养的固体培养基全部位于水中，并继续培养4d ；以及，
[0076]步骤(2)、洗净所述步骤(I)中处理后的试管苗的根部培养基，移栽到泥炭土与细河沙质量比为3: I的混合基质中培养35d，再移栽至大田。
[0077]实施例5:
[0078]一种战骨的组织培养方法，包括:
[0079]诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养，所述诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养在固体培养基中进行。
[0080]所述的战骨的组织培养方法中，在所述固体培养基中放入明胶海绵，所述明胶海绵为边长0.5cm的立方体，每升所述固体培养基中放置有100个所述明胶海绵，当所述固体培养基凝固时，所述明胶海绵全部均匀浸入所述固体培养基中。
[0081 ] 所述的战骨的组织培养方法中，所述诱导培养中，将外植体在温度为24°C，光照强度为15001UX，及光照时间为10h/d的条件下培养20d，诱导不定芽萌发，以得到无菌试管苗；
[0082]所述诱导培养中的固体培养基包含:MS，30g.Γ1蔗糖，1.0mg.L^6-苄基腺嘌呤，
0.2mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
[0083]所述的战骨的组织培养方法中，在所述诱导培养之后进行所述增殖培养，将经过所述诱导培养得到的无菌试管苗在温度为24°C，光照强度为15001UX，及光照时间为10h/d的条件下培养30d，得到大量不定芽；
[0084]所述增殖培养中的固体培养基包含:MS，30g.L—1蔗糖，1.0g.Γ1活性炭，
1.0mg.L-V苄基腺嘌呤，0.1mg.L-1萘乙酸，0.3mg.L-1吲哚乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
[0085]所述的战骨的组织培养方法中，在所述增殖培养之后进行所述壮苗培养，将经过所述增殖培养得到的不定芽在温度为24°C，光照强度为15001UX，及光照时间为10h/d的条件下培养30d，得到健壮植株；
[0086]所述壮苗培养中的固体培养基包含:MS，30g.L—1蔗糖，1.0g.Γ1活性炭，0.5mg.L-V苄基腺嘌呤，0.1mg.L-1的萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
[0087]所述的战骨的组织培养方法中，在所述壮苗培养之后进行所述生根培养，将经过所述壮苗培养得到的健壮植株在温度为24°C，光照强度为15001UX，及光照时间为10h/d的条件下培养30d，得到带根苗；
[0088]所述生根培养中的固体培养基包含:l/2MS,30g.L—1蔗糖，1.0g.L-1活性炭，
0.3mg.L-1生根粉，1.0mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
[0089]所述的战骨的组织培养方法中，在所述诱导培养之前还包括获得无菌外植体的步骤，所述获得无菌外植体的步骤为:
[0090]步骤一、取带腋芽的茎段作为外植体，放置于烧杯中，加入质量分数为0.05%的洗洁精水溶液浸泡5min，浸泡过程中用毛笔轻轻洗刷所述外植体表面污垢，取出所述外植体后用流水冲洗15min，移至超净工作台；
[0091]步骤二、将所述步骤一中处理后的外植体在体积分数为70%的酒精中浸泡10-20秒，然后将所述外植体在含有重量份数为0.01份的吐温-20、0.1份的抗菌肽和70份的无菌水的混合溶液中浸泡lOmin，再利用低温等离子体处理浸泡在所述混合溶液中的外植体
1.0min,取出所述外植体后用无菌水冲洗3次,一次2.0min,最后用无菌吸水纸吸干所述外植体表面水分，切成0.5cm的带一个腋芽的茎段，得到无菌外植体。
[0092]所述的战骨的组织培养方法中，所述步骤二中利用所述低温等离子体处理所述外植体的步骤为:将大气压低温等离子体装置的喷嘴没入所述混合溶液液面以下，在所述大气压低温等离子体装置内通入氧气和氦气质量比为1: 20的混合气体，然后打开放电装置，放电处理1.0min让所述大气压低温等离子体装置产生的低温等离子体与水接触，对所述混合溶液中的外植体进行杀菌处理。
[0093]所述的战骨的组织培养方法中，在所述生根培养之后还包括炼苗移栽的步骤，所述炼苗移栽的步骤为:
[0094]步骤(I)、在温度23°C下，向所述生根培养的固体培养基中加入水使所述生根培养的固体培养基全部位于水中，并继续培养3d ;以及，
[0095]步骤(2)、洗净所述步骤(I)中处理后的试管苗的根部培养基，移栽到泥炭土与细河沙质量比为3: I的混合基质中培养30d，再移栽至大田。
[0096]实施例6:
[0097]一种战骨的组织培养方法，包括:
[0098]诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养，所述诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养在固体培养基中进行。
[0099]所述的战骨的组织培养方法中，在所述固体培养基中放入明胶海绵，所述明胶海绵为边长0.5cm的立方体，每升所述固体培养基中放置有120个所述明胶海绵，当所述固体培养基凝固时，所述明胶海绵全部均匀浸入所述固体培养基中。
[0100]所述的战骨的组织培养方法中，所述诱导培养中，将外植体在温度为26°C，光照强度为15001UX，及光照时间为12h/d的条件下培养20d，诱导不定芽萌发，以得到无菌试管苗；
[0101]所述诱导培养中的固体培养基包含:MS，30g.Γ1蔗糖，1.0mg.L_V苄基腺嘌呤，
0.2mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
[0102]所述的战骨的组织培养方法中，在所述诱导培养之后进行所述增殖培养，将经过所述诱导培养得到的无菌试管苗在温度为26°C，光照强度为15001uX，及光照时间为12h/d的条件下培养30d，得到大量不定芽；
[0103]所述增殖培养中的固体培养基包含:MS，30g.Γ1蔗糖，1.0g.Γ1活性炭，
2.0mg.L-V苄基腺嘌呤，1.0mg.L-1萘乙酸，0.5mg.L-1吲哚乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
[0104]所述的战骨的组织培养方法中，在所述增殖培养之后进行所述壮苗培养，将经过所述增殖培养得到的不定芽在温度为26°C，光照强度为15001UX，及光照时间为12h/d的条件下培养30d，得到健壮植株；
[0105]所述壮苗培养中的固体培养基包含:MS，30g.Γ1蔗糖，1.0g.Γ1活性炭，
1.5mg.L-V苄基腺嘌呤，2.0mg.L-1的萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
[0106]所述的战骨的组织培养方法中，在所述壮苗培养之后进行所述生根培养，将经过所述壮苗培养得到的健壮植株在温度为26°C，光照强度为15001UX，及光照时间为12h/d的条件下培养30d，得到带根苗；
[0107]所述生根培养中的固体培养基包含:l/2MS,30g.L—1蔗糖，1.0g.L-1活性炭，0.5mg.L-1生根粉，2.0mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
[0108]所述的战骨的组织培养方法中，在所述诱导培养之前还包括获得无菌外植体的步骤，所述获得无菌外植体的步骤为:
[0109]步骤一、取带腋芽的茎段作为外植体，放置于烧杯中，加入质量分数为0.1%的洗洁精水溶液浸泡lOmin，浸泡过程中用毛笔轻轻洗刷所述外植体表面污垢，取出所述外植体后用流水冲洗20min，移至超净工作台；
[0110]步骤二、将所述步骤一中处理后的外植体在体积分数为75%的酒精中浸泡20秒，然后将所述外植体在含有重量份数为0.1份的蔗糖酯、1.0份的抗菌肽和100份的无菌水的混合溶液中浸泡20min,再利用低温等离子体处理浸泡在所述混合溶液中的外植体5min,取出所述外植体后用无菌水冲洗5次,一次5min,最后用无菌吸水纸吸干所述外植体表面水分，切成0.8cm的带一个腋芽的茎段，得到无菌外植体。
[0111]所述的战骨的组织培养方法中，所述步骤二中利用所述低温等离子体处理所述外植体的步骤为:将大气压低温等离子体装置的喷嘴没入所述混合溶液液面以下，在所述大气压低温等离子体装置内通入氧气和氦气质量比为1: 20的混合气体，然后打开放电装置，放电处理5min让所述大气压低温等离子体装置产生的低温等离子体与水接触，对所述混合溶液中的外植体进行杀菌处理。
[0112]所述的战骨的组织培养方法中，在所述生根培养之后还包括炼苗移栽的步骤，所述炼苗移栽的步骤为:
[0113]步骤(I)、在温度25°C下，向所述生根培养的固体培养基中加入水使所述生根培养的固体培养基全部位于水中，并继续培养5d ;以及，
[0114]步骤(2)、洗净所述步骤(I)中处理后的试管苗的根部培养基，移栽到泥炭土与细河沙质量比为3: I的混合基质中培养40d，再移栽至大田。
[0115]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
【权利要求】
1.一种战骨的组织培养方法，包括诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养，其中，所述诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养在固体培养基中进行。
2.如权利要求1所述的战骨的组织培养方法，其中，在所述固体培养基中放入明胶海绵，所述明胶海绵为边长0.5cm的立方体，每升所述固体培养基中放置有100-120个所述明胶海绵，当所述固体培养基凝固时，所述明胶海绵全部均匀浸入所述固体培养基中。
3.如权利要求1所述的战骨的组织培养方法，其中，所述诱导培养中，将外植体在温度为24-26°C，光照强度为15001UX，及光照时间为10_12h/d的条件下培养20d，诱导不定芽萌发，以得到无菌试管苗； 所述诱导培养中的固体培养基包含:MS，30g.Γ1蔗糖，1.0mg.1^6-苄基腺嘌呤，0.2mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
4.如权利要求1所述的战骨的组织培养方法，其中，在所述诱导培养之后进行所述增殖培养，将经过所述诱导培养得到的无菌试管苗在温度为24-26°C，光照强度为15001UX，及光照时间为10-12h/d的条件下培养30d，得到大量不定芽； 所述增殖培养中的固体培养基包含:MS，30g.L—1蔗糖，1.0g.Γ1活性炭，1.0-2.0mg.1^6-苄基腺嘌呤，0.1-1.0mg ?Γ1 萘乙酸，0.3-0.5mg.171 吲哚乙酸和 3.5g.171琼脂，并调节初始PH值为5.8。
5.如权利要求1所述的战骨的组织培养方法，其中，在所述增殖培养之后进行所述壮苗培养，将经过所述增殖培养得到的不定芽在温度为24-26°C，光照强度为15001uX，及光照时间为10-12h/d的条件下培养30d，得到健壮植株； 所述壮苗培养中的固体培养基包含:MS，30g.L-1蔗糖，1.0g.L-1活性炭，0.5-1.5mg.L-V苄基腺嘌呤，0.l_2mg.L-1的萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为 5.8。
6.如权利要求1-5任一项所述的战骨的组织培养方法，其中，在所述壮苗培养之后进行所述生根培养，将经过所述壮苗培养得到的健壮植株在温度为24-26°C，光照强度为15001UX，及光照时间为10-12h/d的条件下培养30d，得到带根苗； 所述生根培养中的固体培养基包含:1/2MS，30g.Γ1蔗糖，1.0g.Γ1活性炭，0.3-0.5mg.L-1生根粉，1.0-2.0mg.L-1萘乙酸和3.5g.L-1琼脂，并调节初始pH值为5.8。
7.如权利要求1所述的战骨的组织培养方法，在所述诱导培养之前还包括获得无菌外植体的步骤，其中，所述获得无菌外植体的步骤为: 步骤一、取带腋芽的茎段作为外植体，放置于烧杯中，加入质量分数为0.05% -0.1%的洗洁精水溶液浸泡5-10min，浸泡过程中用毛笔轻轻洗刷所述外植体表面污垢，取出所述外植体后用流水冲洗15-20min，移至超净工作台； 步骤二、将所述步骤一中处理后的外植体在体积分数为70% -75%的酒精中浸泡10-20秒，然后将所述外植体在含有重量份数为0.01-0.1份的表面活性剂、0.1-1.0份的抗菌肽和70-100份的无菌水的混合溶液中浸泡10-20min，再利用低温等离子体处理浸泡在所述混合溶液中的外植体l-5min,取出所述外植体后用无菌水冲洗3_5次,一次2_5min,最后用无菌吸水纸吸干所述外植体表面水分，切成0.5-0.8cm的带一个腋芽的茎段，得到无菌外植体。
8.如权利要求7所述的战骨的组织培养方法，其中，所述步骤二中所述表面活性剂为吐温-20、蔗糖酯和十六烷基三甲基氯化铵中的任意一种或几种。
9.如权利要求7所述的战骨的组织培养方法，其中，所述步骤二中利用所述低温等离子体处理所述外植体的步骤为:将大气压低温等离子体装置的喷嘴没入所述混合溶液液面以下，在所述大气压低温等离子体装置内通入氧气和氦气质量比为1: 20的混合气体，然后打开放电装置，放电处理l_5min让所述大气压低温等离子体装置产生的低温等离子体与水接触，对所述混合溶液中的外植体进行杀菌处理。
10.如权利要求1所述的战骨的组织培养方法，在所述生根培养之后还包括炼苗移栽的步骤，其中，所述炼苗移栽的步骤为: 步骤(I)、在温度23-25°C下，向所述生根培养的固体培养基中加入水使所述生根培养的固体培养基全部位于水中，并继续培养3-5d ;以及， 步骤(2)、洗净所述步骤(I)中处理后的试管苗的根部培养基，移栽到泥炭土与细河沙质量比为3: I的混合基质中培养30-40d，再移栽至大田。
【文档编号】A01H4/00GK104429968SQ201410788077
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月18日 优先权日:2014年12月18日
【发明者】韦荣昌 申请人:广西壮族自治区药用植物园