本发明涉及植物培养方法，具体为提高长春花植物体中长春碱含量的栽培方法。
背景技术：
长春碱(vinblastine)又称长春花碱是由夹竹桃科植物长春花(catharanthusroseus)中提出的一种生物碱，为细胞周期特异性抗肿瘤药。作用于g1、s及m期，并对m期有延缓作用。能干扰增殖细胞纺锤体的形成，使有丝分裂停止于中期。并有免疫抑制作用。对何杰金氏病(hodgkinslymphoma)、绒毛膜上皮癌疗效较好，对急性白血病、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、头颈部癌、口咽部癌、单核细胞白血病均有一定疗效。对淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤、肾母细胞瘤、恶性黑色素瘤也有效。
目前主要是从天然植物中提取长春碱，虽然利用化学合成和半合成的方法可以得到长春碱及其衍生物，也有人研究通过组织培养的途径获得，但都不理想，不适合生产。组织培养的方法不能合成长春碱的前体之一文多灵，可能是因为组织培养体系不能产生合成文多灵所需的某种酶，这样组织培养就不能大规模地生产长春碱。所以从植物体中直接提取长春碱就显得尤为重要，如何提高植物体中长春碱的含量也成为研究的热点之一。
技术实现要素：
为了达到提高长春花植物体中长春碱含量的目的，本发明采用一种新的长春花栽培方法，具体技术方案为：
提高长春花植物体中长春碱含量的栽培方法，将一定浓度的h2o2、乙烯利、乙酰水杨酸、色氨酸的水溶液外施于长春花幼苗或成熟植株，喷洒一次或数次。处理后采收长春花的枝叶，提取其中的长春碱并检测其含量。
所述的h2o2、乙烯利、乙酰水杨酸、色氨酸水溶液，h2o2浓度在10～1000mmol/l的范围内，乙烯利浓度在0.5～50g/l的范围内，乙酰水杨酸浓度在0.5～100mg/l的范围内，色氨酸的浓度在10～2000mg/l的范围内。
所述的外施于长春花幼苗或成熟植物体，幼苗即从萌发后还未开花的植株，成熟植株即从开花后的植株。外施包括对地上植株的外施和对土壤的外施。
喷洒一次作用一定时间后进行采收，或是间隔一定时间地喷洒数次后进行采收。
在植物体中，长春碱的生物合成途径还不能确定，但根据已有的研究结果表明，它是由单萜吲哚生物碱文多灵和长春质碱耦合而成的，并且进一步的研究结果显示这种耦合作用是在过氧化物酶(pod)的作用下进行的。
pod是消除植物体内氧自由基的一种活性酶，它与超氧物歧化酶(sod)和过氧化氢酶(cat)协调一致组成保护酶系统，将植物体内的氧自由基维持在一个较低的水平。植物体内的氧自由基包括o2˙ˉ、oh˙,sod可消除这些氧自由基，而细胞中的作为一种活性氧的h2o2可降低这种效率，超氧物歧化酶(sod)和过氧化氢酶(cat)又可以分解h2o2。h2o2参与植物体内许多重要的生化过程。在正常情况下，氧自由基和清除处于动态平衡状态，氧自由基水平很低，不会伤害细胞。但当植物受到外界胁迫时，这种动态平衡就被打破。
植物体内的活性氧含量过高，能够造成细胞结构与功能的伤害：它可以引起线粒体结构的损伤，导致某些生化功能受破坏；它也可以使脂膜分子结构受干扰或破坏引起脂膜过氧化，干扰或破坏是与膜功能相关的各种生理功能；氧自由基亦可以导致蛋白质、酶和dna等生物大分子的损伤。而作为次生代谢产物的生物碱，在植物体内的生理作用是行使某种保护测略，所以长春碱的积累可能是某种逆境条件下细胞的正常代谢受到某种干扰而诱导的。
色氨酸是合成生物碱的前体之一，其在色氨酸脱羧酶的作用下首先转化为色胺，在异胡豆苷合成酶的作用下进一步合成吲哚类生物碱的共同前体异胡豆苷，运用前体饲喂色氨酸的方法可使合成长春碱的前体含量大大提高，使生物碱的代谢发生平衡流动进而提高长春碱的含量。
本发明提供的提高长春花植物体中长春碱含量的栽培方法，根据以上原理向植物体喷施h2o2或者可以诱导长春花植株体内产生更多的h2o2的植物激素，来使植物体中更多的pod酶活性的激发，从而促进文多灵与长春质碱的缔合而形成长春碱，或者运用前体饲喂的方法增加长春碱的合成速率，达到提高植物体中长春碱的含量的目的。这种栽培方法简单易行，而且效果显著，可大幅度提高长春碱的含量，较传统上的从未经处理的长春花植株内直接提取长春碱大大节省了原材料，并且传统的提取已经远远满足不了植物药市场的年需求量。因此，该方法的为长春碱的产业化提供了新方法开辟了新途径。
本发明提供的提高长春花植物体中长春碱含量的栽培方法的技术效果有：
(1)喷施一定浓度的h2o2、乙烯利、乙酰水杨酸、色氨酸等溶液，其操作简单易行，适用于大规模生产，便于实现长春碱的产业化；
(2)提高长春碱在长春花植物体中的单位产量，可大大节省原材料，并且工业生产时，还可同时获得其它种类的生物碱，提高产业化的附加值。
具体实施方式
结合实施例说明本发明的具体技术方案。
实施例1：
将浓度为10mmol/l的h2o2溶液均匀地喷施于苗龄为3个月的长春花幼苗的地上部分，培养2天后，采收长春花幼苗的枝叶，烘干后提取长春碱用高效液相法进行检测，长春碱含量为25.4μg/gdw，较一般未经处理的长春花中长春碱的含量为约20μg/gdw，有所增加，但含量增加不显著。
实施例2：
将浓度为100mmol/l的h2o2溶液均匀地喷施于苗龄为3个月的长春花幼苗的地上部分，培养2天后，采收长春花幼苗的枝叶，烘干后提取长春碱用高效液相法进行检测，长春碱含量为50.4μg/gdw，较一般未经处理的长春花中长春碱的含量约20μg/gdw，提高了1倍多。
实施例3：
将浓度为1000mmol/l的h2o2溶液均匀地喷施于苗龄为3个月的长春花幼苗的地上部分，培养2天后，采收长春花幼苗的枝叶，烘干后提取长春碱用高效液相法进行检测，长春碱含量为30.7μg/gdw，较一般未经处理的长春花中长春碱的含量约20μg/gdw，有所提高，但与100mmol/l相比含量增加较少，综合经济原因100mmol/l的h2o2溶液为最适浓度。
实施例4：
用浓度为0.5g/l的乙烯利溶液均匀地喷施于苗龄为18个月的成熟长春花植株的地上部分，7天后采收长春花枝叶，烘干后提取长春碱并用高效液相法进行检测，结果含量为较未喷施乙烯利的长春花叶片中长春碱含量增加了43.9％。
实施例5：
用浓度为25g/l的乙烯利溶液均匀地喷施于苗龄为18个月的成熟长春花植株的地上部分，7天后采收长春花枝叶，烘干后提取长春碱并用高效液相法进行检测，结果含量为较未喷施乙烯利的长春花叶片中长春碱含量增加了70.5％。
实施例6：
用浓度为50g/l的乙烯利溶液均匀地喷施于苗龄为18个月的成熟长春花植株的地上部分，7天后采收长春花枝叶，烘干后提取长春碱并用高效液相法进行检测，结果含量为较未喷施乙烯利的长春花叶片中长春碱含量增加了106.0％。
实施例7：
用浓度为0.5mg/l的乙酰水杨酸溶液均匀地喷施于苗龄为18个月的成熟长春花植株的地上部分，4天后采收长春花枝叶，烘干后提取长春碱并用高效液相法进行检测，结果含量为较未喷施乙酰水杨酸溶液的长春花叶片中长春碱含量有所增加但增加含量不显著。
实施例8：
用浓度为100mg/l的乙酰水杨酸溶液均匀地喷施于苗龄为18个月的成熟长春花植株的地上部分，4天后采收长春花枝叶，烘干后提取长春碱并用高效液相法进行检测，结果显示含量与未施加乙酰水杨酸溶液相比生物碱含量增加1.3倍。
实施例9：
用浓度为200mg/l的乙酰水杨酸溶液均匀地喷施于苗龄为18个月的成熟长春花植株的地上部分，4天后采收长春花枝叶，烘干后提取长春碱并用高效液相法进行检测，结果显示由于添加的浓度过高，对细胞生长产生了不利影响，细胞开始出现褐化现象。
实施例10：
用浓度为10mg/l的色氨酸溶液均匀地喷施于苗龄为18个月的成熟长春花植株的地上部分，5天后采收长春花枝叶，烘干后提取长春碱并用高效液相法进行检测，结果显示由于色氨酸溶液浓度较低，长春花叶片中长春碱含量虽有所增加但增加含量不显著。
实施例11：
用浓度为1000mg/l的色氨酸溶液均匀地喷施于苗龄为18个月的成熟长春花植株的地上部分，5天后采收长春花枝叶，烘干后提取长春碱并用高效液相法进行检测，结果显示喷洒过浓度为1000mg/l的色氨酸溶液的长春花叶片中长春碱含量较未喷施的长春花叶片中长春碱含量增加1倍。
实施例12：
用浓度为2000mg/l的色氨酸溶液均匀地喷施于苗龄为18个月的成熟长春花植株的地上部分，5天后采收长春花枝叶，烘干后提取长春碱并用高效液相法进行检测，结果显示喷洒过浓度为2000mg/l的色氨酸溶液的长春花叶片中长春碱含量是未喷施的长春花叶片中长春碱含量的3.14倍。