本发明涉及一种提高花椰菜小孢子出胚率的培养基配方及其培养方法，属于植物组织培养
技术领域：
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背景技术：
：花椰菜含有丰富的蛋白质、碳水化合物、纤维及各种维生素及矿物质等营养物质，且味道鲜美而在世界各地普遍栽培。但是，传统选育花椰菜杂交新品种的育种周期一般需6-8年，其中选育亲本材料就需5-6年。为缩短其育种时间并提高其出胚率，有研究人员利用游离小孢子培养技术培育花椰菜再生植株，即待小孢子胚长产生时，转到温度25℃、光照4000lx、光周期12－16hr/d的光照条件下培养，将转绿后的胚转移到含蔗糖3％的ms无激素固体培养基上继续培养，直至幼苗长成；在含蔗糖3％的ms无激素固体培养基中添加激动素、6苄基嘌呤和萘乙酸三种生长素。另，有研究人员以花椰菜的花药为材料，按无菌操作要求接种，进行花药诱导愈伤组织培养、愈伤组织分化培养、分化苗生根培养等步骤完成花椰菜新种苗的育成。通过花药培养可以保特亲本的纯度稳定，加快杂种后代的选择效果。对于加快培育优良的椰菜品种具有很好的应用价值。但是，上述培养方式随对出胚率有一定提高作用，但是还远远达不到预估水平，本发明即是在上述技术方案的基础上进行的改进。技术实现要素：针对上述情况，本发明的目的在于提供一种提高花椰菜小孢子出胚率的培养基配方及其培养方法。为解决
背景技术：
的相关问题，本发明提供一种提高花椰菜小孢子出胚率的培养基配方，各组分在每升培养基中所含重量为：(1)花蕾预处理培养基：nln-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/l+0.05-0.2％秋水仙碱+1-3％dmso+1-2％维生素b+1-2％维生素e，ph5.6-6.0，过滤灭菌；(2)胚状体诱导培养基：ms基础培养基+ba1.0-2.0mg/l+iaa0.5-1.0mg/l+秋水仙碱4.0-5.0mg/l+30g/l蔗糖或白糖+9g/l琼脂，ph5.8，灭菌；(3)胚状体分化培养基：ms基础培养基+ga0.5-1.0mg/l+ba1.0-2.0mg/l+naa0.05mg/l+agno34.0-5.0mg/l+30g/l蔗糖或白糖+9g/l琼脂，ph5.8，灭菌；(4)胚状体再分化培养基：ms基础培养基+agno34.0mg/l+30g/l蔗糖+10-11g/l琼脂，ph5.8，灭菌；(5)胚状体生根培养基：1/2ms基础培养基+iaa1.0mg/l+30g/l蔗糖+9g/l琼脂，ph5.8，灭菌。其中，所述灭菌的方式可以为高温灭菌或过滤灭菌中的一种。本发明还在于公开一种利用上述培养基配方培养花椰菜小孢子的方法，主要包括以下步骤：(1)供体植株与花蕾的选择：选择植株与花蕾生长健康的花椰菜作为供体植株；并从中选择花瓣与花药长度比在0.6-1.0之间，处于单核中晚期的花蕾；(2)花蕾灭菌：用5.2％活性氯次氯酸钠50ml/l+95％酒精100ml/l+吐温20100μl配制成灭菌液；在摇床上将花蕾放入灭菌液中进行表面消毒18分钟，再在超净台上用无菌水清洗5次后，备用；(3)花蕾预处理培养：将灭菌后花蕾置于花蕾预处理培养基上，在4℃下培养1-5d；(4)花蕾小孢子的分离、混配与分装：在超净台上将预处理培养后的花蕾置于无菌烧杯中，加入10ml胚状体诱导培养基，用平头玻棒压碎花蕾、搅成悬浮液；将该悬浮液用40μm无菌尼龙滤网过滤于离心管中，按1000rpm离心3分钟，弃上清液；再加10ml胚状体诱导培养基按同样方法离心并弃上清液；加入胚状体诱导培养基至平均每6ml培养基中含1.5个花蕾后，再按每4ml培养基中加入0.05ml活性炭混合液混配成小孢子悬浮液；将该悬浮液分装于直径为6cm或9cm的无菌培养皿中，加盖后用parafilm膜封口，备用；(5)小孢子胚状体的培养：将分装好的培养皿置于31-33℃恒温培养箱中，暗培养24-72小时；后置于25℃恒温培养箱，暗培养1-2周至胚状体出现；再在25℃黑暗下50rpm振荡培养1-2周，至子叶型胚状体形成；(6)再生植株的分化与萌发培养：在超净台中将子叶型胚状体，平放于半流动的胚状体分化培养基上，在每天光照16小时、25℃下培养5-10d至胚状体膨大并呈现浅绿色；后转移至相同条件下的萌发培养基中进行再生植株的萌发培养至形成新叶；(7)再生植株的生根培养与移栽：切取萌发有正常生长点的再生植株插于生根培养基中，在每天光照16小时、25℃下进行生根培养；将生根后的再生植株移入含泥炭与珍珠岩按体积2:1配制的基质中，浇透水，覆盖塑料膜后在25℃下培养1周；(8)再生植株的倍性检测：取移栽成活再生植株的嫩叶，用分析仪检测该再生植株的dna倍性；并从中选择出二倍体的再生植株作为亲本材料用于育种。其中，步骤(4)中活性炭混合液由ms-13液体培养基+琼脂糖3-5g/l+活性炭1g/l配制，经高温灭菌制成。本发明创造的有益效果为：本发明通过改良培养基的成分及成分的用量，实现对小孢子出胚率的提高，其中维生素b及维生素e的加入对于小孢子的出胚有明显促进作用；且，培养基中添加的秋水仙碱及agno3均可对胚芽的褐化现象有所减轻即反向促进了芽诱导率的提高。具体实施方式下述实施例中的花椰菜小孢子均按照如下步骤进行培养：(1)供体植株与花蕾的选择：选择植株与花蕾生长健康的花椰菜作为供体植株；并从中选择花瓣与花药长度比在0.6-1.0之间，处于单核中晚期的花蕾；(2)花蕾灭菌：用5.2％活性氯次氯酸钠50ml/l+95％酒精100ml/l+吐温20100μl配制成灭菌液；在摇床上将花蕾放入灭菌液中进行表面消毒18分钟，再在超净台上用无菌水清洗5次后，备用；(3)花蕾预处理培养：将灭菌后花蕾置于花蕾预处理培养基上，在4℃下培养1-5d；(4)花蕾小孢子的分离、混配与分装：在超净台上将预处理培养后的花蕾置于无菌烧杯中，加入10ml胚状体诱导培养基，用平头玻棒压碎花蕾、搅成悬浮液；将该悬浮液用40μm无菌尼龙滤网过滤于离心管中，按1000rpm离心3分钟，弃上清液；再加10ml胚状体诱导培养基按同样方法离心并弃上清液；加入胚状体诱导培养基至平均每6ml培养基中含1.5个花蕾后，再按每4ml培养基中加入0.05ml活性炭混合液混配成小孢子悬浮液；将该悬浮液分装于直径为6cm或9cm的无菌培养皿中，加盖后用parafilm膜封口，备用；(5)小孢子胚状体的培养：将分装好的培养皿置于31-33℃恒温培养箱中，暗培养24-72小时；后置于25℃恒温培养箱，暗培养1-2周至胚状体出现；再在25℃黑暗下50rpm振荡培养1-2周，至子叶型胚状体形成；(6)再生植株的分化与萌发培养：在超净台中将子叶型胚状体，平放于半流动的胚状体分化培养基上，在每天光照16小时、25℃下培养5-10d至胚状体膨大并呈现浅绿色；后转移至相同条件下的萌发培养基中进行再生植株的萌发培养至形成新叶；(7)再生植株的生根培养与移栽：切取萌发有正常生长点的再生植株插于生根培养基中，在每天光照16小时、25℃下进行生根培养；将生根后的再生植株移入含泥炭与珍珠岩按体积2:1配制的基质中，浇透水，覆盖塑料膜后在25℃下培养1周；(8)再生植株的倍性检测：取移栽成活再生植株的嫩叶，用分析仪检测该再生植株的dna倍性；并从中选择出二倍体的再生植株作为亲本材料用于育种。其中，步骤(4)中活性炭混合液由ms-13液体培养基+琼脂糖4g/l+活性炭1g/l配制，经高温灭菌制成。实施例1培养基的配置：(1)花蕾预处理培养基：nln-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/l+0.1％秋水仙碱+2％dmso，ph5.6-6.0，过滤灭菌；(2)胚状体诱导培养基：ms基础培养基+ba1.5mg/l+iaa0.8mg/l+秋水仙碱4.5mg/l+30g/l蔗糖或白糖+9g/l琼脂，ph5.8，灭菌；(3)胚状体分化培养基：ms基础培养基+ga0.8mg/l+ba1.5mg/l+naa0.05mg/l+agno34.5mg/l+30g/l蔗糖或白糖+9g/l琼脂，ph5.8，灭菌；(4)胚状体再分化培养基：ms基础培养基+agno34.0mg/l+30g/l蔗糖+10.5g/l琼脂，ph5.8，灭菌；(5)胚状体生根培养基：1/2ms基础培养基+iaa1.0mg/l+30g/l蔗糖+9g/l琼脂，ph5.8，灭菌。实施例2培养基的配置：(1)花蕾预处理培养基：nln-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/l+0.1％秋水仙碱+2％dmso+1.5％维生素b，ph5.6-6.0，过滤灭菌；(2)胚状体诱导培养基：ms基础培养基+ba1.5mg/l+iaa0.8mg/l+秋水仙碱4.5mg/l+30g/l蔗糖或白糖+9g/l琼脂，ph5.8，灭菌；(3)胚状体分化培养基：ms基础培养基+ga0.8mg/l+ba1.5mg/l+naa0.05mg/l+agno34.5mg/l+30g/l蔗糖或白糖+9g/l琼脂，ph5.8，灭菌；(4)胚状体再分化培养基：ms基础培养基+agno34.0mg/l+30g/l蔗糖+10.5g/l琼脂，ph5.8，灭菌；(5)胚状体生根培养基：1/2ms基础培养基+iaa1.0mg/l+30g/l蔗糖+9g/l琼脂，ph5.8，灭菌。实施例3培养基的配置：(1)花蕾预处理培养基：nln-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/l+0.1％秋水仙碱+2％dmso+1.5％维生素b+1.5％维生素e，ph5.6-6.0，过滤灭菌；(2)胚状体诱导培养基：ms基础培养基+ba1.5mg/l+iaa0.8mg/l+秋水仙碱4.5mg/l+30g/l蔗糖或白糖+9g/l琼脂，ph5.8，灭菌；(3)胚状体分化培养基：ms基础培养基+ga0.8mg/l+ba1.5mg/l+naa0.05mg/l+agno34.5mg/l+30g/l蔗糖或白糖+9g/l琼脂，ph5.8，灭菌；(4)胚状体再分化培养基：ms基础培养基+agno34.0mg/l+30g/l蔗糖+10.5g/l琼脂，ph5.8，灭菌；(5)胚状体生根培养基：1/2ms基础培养基+iaa1.0mg/l+30g/l蔗糖+9g/l琼脂，ph5.8，灭菌。实施例4培养基的配置：(1)花蕾预处理培养基：nln-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/l+2％dmso+1.5％维生素b+1.5％维生素e，ph5.6-6.0，过滤灭菌；(2)胚状体诱导培养基：ms基础培养基+ba1.5mg/l+iaa0.8mg/l+30g/l蔗糖或白糖+9g/l琼脂，ph5.8，灭菌；(3)胚状体分化培养基：ms基础培养基+ga0.8mg/l+ba1.5mg/l+naa0.05mg/l+30g/l蔗糖或白糖+9g/l琼脂，ph5.8，灭菌；(4)胚状体再分化培养基：ms基础培养基+30g/l蔗糖+10.5g/l琼脂，ph5.8，灭菌；(5)胚状体生根培养基：1/2ms基础培养基+iaa1.0mg/l+30g/l蔗糖+9g/l琼脂，ph5.8，灭菌。上述四个实施例的出胚率及褐化现象如下表所示：表1实施例序号出胚率褐化现象198％无290％一般369％一般471％严重以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。当前第1页12