一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法

1.本发明属于植物病毒学技术领域，特别是涉及猕猴桃病毒的脱除方法。


背景技术：

2.猕猴桃属于猕猴桃科(actinidiaceae)，猕猴桃属(actinidia)，中国是猕猴桃的起源与分布中心。猕猴桃的营养价值高，其果实和根部广泛应用于食品和医疗领域，栽培地遍布世界各地。近年来，中国的猕猴桃产业发展迅速，在猕猴桃种植面积和产量上都有着极大的提升。陕西省作为中国猕猴桃的主要生产省份，为中国和世界猕猴桃产量作出了巨大的贡献，分别占中国猕猴桃总产量的60％和世界猕猴桃总产量的40％。近年来，随着猕猴桃种植面积的不断扩大以及猕猴桃的大范围连片种植，造成猕猴桃易于发生多种病害。猕猴桃是多年生果树，一旦被病毒侵染便会终生带毒，并且会通过不同的途径向周围的植株传播病毒。多年来，人们常常关注溃疡病对猕猴桃的危害，确忽略了病毒病对猕猴桃的潜在危害，造成田间大量猕猴桃植株被多种病毒混合侵染，严重影响了猕猴桃的产量和品质。
3.猕猴桃一旦被病毒感染便会终生带毒，没有较好的治疗方法，推广使用脱毒苗是解决猕猴桃病毒危害最经济有效的方法。然而，目前没有关于猕猴桃脱毒方法的报道，市场上也缺乏猕猴桃脱毒苗。


技术实现要素：

4.本研究针对我国猕猴桃病毒病害发生的现状，发明了一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法。
5.本发明可通过如下技术方案实现：一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法，具体包括以下步骤：
6.剥离2mm左右的猕猴桃茎尖在继代培养基上培养1天后转入含有甘油和蔗糖的液体培养基上再培养1天，将茎尖转入pvs2中在冰上处理40分钟后转到灭菌铝箔条上的小滴中，然后浸入液氮中进行冷冻处理1h，再将铝箔条快速取出并浸入液体蔗糖培养基中进行解冻。解冻20min后取出茎尖，用滤纸吸干表面的水分，移入继代培养基中进行再生培养，前3天黑暗处理，第4天开始10μmol s-1
m-2
弱光培养，再生一周后茎尖转入新的继代培养基中在正常光照下进行再生。
7.所述的继代培养基成为：ms+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂+0.5mg/l 6-ba+0.1mg/l naa，ph5.8。
8.所述的含有甘油和蔗糖的培养基配方为：ms+2.0m甘油+0.8m蔗糖。
9.所述的液体蔗糖培养基配方为：ms+1.2m蔗糖。
10.本发明小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法具有操作简单、耗时短、脱毒率高、再生率高的优点，具有较好的技术效果和应用前景。
附图说明
11.图1是4种病毒的rt-pcr检测结果：a-d分别为猕猴桃病毒2(acv2)、猕猴桃黄化病毒1(acyv1)、猕猴桃黄化病毒2(acyv2)和猕猴桃黄化环斑病毒(ayrspv)的检测结果；m：dna分子量标准；1-10分别为10个茎尖超低温脱毒后再生的猕猴桃苗；其中对于acv2，2-5、9和10号样品均脱除了该病毒；对于acyv1，1-5和8-10号样品均脱除了该病毒；对于acyv2，2-6、9和10号样品均脱除了该病毒；对于ayrspv，1、2、5、6和8-10号样品均脱除了该病毒。
12.图2是经过茎尖超低温脱毒后再生的徐香猕猴桃组培苗。
具体实施方式
13.为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但下述实施例并不限制本发明。
14.本发明提供了一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法，具体包括以下步骤：剥离2mm左右的猕猴桃茎尖50个，在继代培养基(ms+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂+0.5mg/l 6-ba+0.1mg/l naa，ph5.8)上培养1天后转入ms+2.0m甘油+0.8m蔗糖培养基上再培养1天，将茎尖转入pvs2中在冰上处理40分钟后转到灭菌铝箔条上的小滴中，然后浸入液氮中进行冷冻处理1h，再将铝箔条快速取出并浸入液ms+1.2m蔗糖培养基中进行解冻。解冻20min后取出茎尖，用滤纸吸干表面的水分，移入继代培养基中进行再生培养，前3天黑暗处理，第4天开始10μmol s-1
m-2
弱光培养，再生一周后茎尖转入新的继代培养基中在正常光照下进行再生。再生一周后统计成活幼苗数，计算成活率。结果50个茎尖最终成活34个，成活率为68％。
15.对成活的幼苗继续进行光照培养，3周后需要继代培养一次，继代后再培养4周，进行acv2、acyv1、acyv2和ayrspv4种猕候桃病毒的rt-pcr检测。检测引物由北京奥科生物科技有限公司合成，具体引物名称和序列见表1。
16.表1 4中猕猴桃病毒的检测引物
[0017][0018]
具体检测步骤包括样品总rna的提取，rt-pcr和琼脂糖凝胶电泳检测。检测后统计以上4种病毒的脱毒率，结果acv2的脱毒率为67.6％，acyv1的脱毒率为76.5％，acyv2的脱毒率为73.5％，ayrspv的脱毒率为64.7％。


技术特征：
1.一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：剥离2mm左右的猕猴桃茎尖在继代培养基上培养1天后转入含有甘油和蔗糖的液体培养基上再培养1天，将茎尖转入pvs2中在冰上处理40分钟后转到灭菌铝箔条上的小滴中，然后浸入液氮中进行冷冻处理1h，再将铝箔条快速取出并浸入液体蔗糖培养基中进行解冻。解冻20min后取出茎尖，用滤纸吸干表面的水分，移入继代培养基中进行再生培养，前3天黑暗处理，第4天开始10μmol s-1
m-2
弱光培养，再生一周后茎尖转入新的继代培养基中在正常光照下进行再生培养。2.根据权利要求1所述的小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法，其特征在于：所述的继代培养基配方法：ms+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂+0.5mg/l 6-ba+0.1mg/l naa，ph5.8。3.根据权利要求1所述的小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法，其特征在于：所述的含有甘油和蔗糖的培养基配方为：ms+2.0m甘油+0.8m蔗糖。4.根据权利要求1所述的小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法，其特征在于：所述的液体蔗糖培养基配方为：ms+1.2m蔗糖。

技术总结
本发明公开了一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法，属于猕猴桃脱毒技术领域。所述的小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法，具体包括以下步骤：取感染病毒的猕猴桃外植体、切取茎尖、预培养、小滴玻璃化处理并投入液氮、解冻、恢复培养、植株再生和继代培养。本发明小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法具有操作简单、耗时短、脱毒率高、再生率高的优点，具有较好的技术效果和应用前景。具有较好的技术效果和应用前景。


技术研发人员：赵磊
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：2020.06.08
技术公布日：2021/12/23