一种老年便秘动物模型的构建及其用途的制作方法

文档序号：22836330发布日期：2020-11-06 16:30阅读：417来源：国知局

本发明属于模型的构建及验证技术领域，具体涉及一种老年便秘动物模型的构建及其用途。

背景技术：

便秘（constipation）是老年人常见的一种消化道疾病，既可单独出现，又是某些疾病的伴发症状，或成为其他疾病的诱因。随着年龄增长慢性便秘的患病率逐渐增高。据调查，60～64岁年龄段的老年人便秘发生率为8.7%，≥85岁的老年人便秘发生率高达19.5%。长期反复不愈的慢性便秘不仅使老年人精神压力过大，且与下消化道肿瘤、老年性精神障碍及结肠癌等疾病的发生密切相关。因此，老年便秘是一个具有巨大潜在危害性的疾病，值得临床及科研工作者的深入研究。

构建与临床病证相符的病理模型是探讨疾病发病机制、揭示药物药效和研发新药的关键所在。现代研究多应用现代医学的理论方法复制便秘模型，模拟与人类近似的病因、发病机制等特征，用于临床和药物研究中。但是，应用现代医学的理论方法复制的便秘模型并不能较好的模拟老年便秘患者的临床特点。

根据老年便秘的病因、病机理论，老年便秘通常可分为胃肠积热证、气机郁滞证、阴寒凝滞证、气血阴阳不足证。老年人便秘以虚性便秘为主，其中阳虚便秘是其他便秘的最终发展结果。因此，本发明在d-半乳糖诱导的衰老基础上，复合了阳虚便秘因素，构建了一种阳虚型老年便秘模型。

除此之外，模型的评价也缺乏有效的方式，亟待改进与发展。目前便秘模型复制成功与否的判断主要根据行为学结果，如排便的时间长短，粪便形态的观察等，生化指标，如生长抑素、胃泌素、胃动素等以及病理组织学检查，如肠内粘膜、粘膜下层、肌层和外膜的损伤情况等进行评价。但是仍然存在一些不足：(1)主观性：粪便的形态直接观察指标有粪便的颜色，硬度，光泽等，这种评价方法存在很大的主观性和不确定性；(2)片面性：通过便秘相关调控因子评价模型存在一定的片面性，只能反映个别的生化功能，缺乏整体系统的评价标准；(3)灵活性差：多种评价指标，如小肠推进率、结肠组织病理等，需要处死实验动物获得实验样本，不利于动态观察疾病的发展变化。

建立科学可靠的老年便秘动物模型是进行其机理研究的基础。为进一步深入探究老年便秘的本质、研发其有效治疗药物，很有必要进行老年便秘动物模型的研究。

技术实现要素：

本发明为了解决现有的便秘模型不能较好模拟临床老年便秘的状态和便秘模型评价方法主观性强、片面性高、灵活性差的技术问题，本发明提供一种老年便秘动物模型的构建及其用途。所述老年便秘动物模型是在中医理论指导下的阳虚型老年便秘模型。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种老年便秘动物模型的构建，每日对模型组大鼠皮下注射300mg/kg的d-半乳糖，从第7周开始，按首剂量5ml/只灌胃给予大鼠白醋，此后单双日交替灌喂白醋和活性炭冰水混合物，白醋的剂量是3ml/200g，活性炭冰水混合物的剂量是5ml/200g；其中白醋的总酸度g/100g为6度，活性炭冰水混合物中含有16.67mmol/l活性炭，连续5周；造模周期共为11周；

造模完成后，收集动物粪便进行核磁共振分析和多元统计分析，得到20生物标志物，具体为：alanine、asparagine、aspartate、betaine、butyrate、citrate、creatinine、glucose、glutamate、glutamine、isobutyrate、isoleucine、lactate、leucine、methionine、phenylalanine、propionate、pyruvate、scyllo-inositol、threonine；

结合20个生物标志物的含量统计学分析，若模型大鼠血清中：

模型大鼠粪便中betaine、butyrate、glucose、scyllo-inositol含量显著下调，具体含量变化如下：

betaine的积分面积均数从正常鼠的0.576916±0.138669317下降到0.364879±0.055045628，p<0.001；

butyrate的积分面积均数从正常鼠的2.054152125±1.132002605下降到0.845627875±0.406826504，p<0.05；

glucose的积分面积均数从正常鼠的0.163973388±0.055315766下降到0.050115913±0.033780499，p<0.001；

scyllo-inositol的积分面积均数从正常鼠的0.237631667±0.087895853下降到0.129596283±0.025747797；p<0.05；

模型大鼠粪便中alanine、asparagine、aspartate、citrate、creatinine、glutamate、glutamine、isobutyrate、isoleucine、lactate、leucine、methionine、phenylalanine、propionate、pyruvate、threonine含量显著上调，具体含量变化如下：

alanine的积分面积均数从正常鼠的0.6795905±0.115019777上升到1.2881475±0.177238037，p<0.001；

asparagine的积分面积均数从正常鼠的0.232976833±0.048197673上升到0.4311975±0.158855282，p<0.05；

aspartate的积分面积均数从正常鼠的0.035562423±0.020726677上升到0.07794175±0.029437469，p<0.001；

citrate的积分面积均数从正常鼠的0.038760118±0.021153991上升到0.075742038±0.02374747，p<0.001；

creatinine的积分面积均数从正常鼠的0.341087375±0.078463115上升到0.460051625±0.098886616，p<0.05；

glutamate的积分面积均数从正常鼠的0.36414925±0.079438783上升到0.566018875±0.091630705，p<0.001；

glutamine的积分面积均数从正常鼠的0.069941167±0.021113785上升到0.123925833±0.012650315，p<0.001；

isobutyrate的积分面积均数从正常鼠的0.075706625±0.032514476上升到0.115289063±0.035502651，p<0.05；

isoleucine的积分面积均数从正常鼠的0.27580575±0.099119943上升到0.431931125±0.077826814，p<0.01；

lactate的积分面积均数从正常鼠的0.8101775±0.338191577上升到1.20282325±0.279287306，p<0.05；

leucine的积分面积均数从正常鼠的0.79796525±0.231204982上升到1.150439125±0.181783288，p<0.001；

methionine的积分面积均数从正常鼠的0.281667±0.050065168上升到0.385737±0.046516487，p<0.001；

phenylalanine的积分面积均数从正常鼠的0.140056375±0.018575142上升到0.193468±0.022584819，p<0.001；

propionate的积分面积均数从正常鼠的1.066754333±0.142348045上升到1.537661667±0.331000035，p<0.05；

pyruvate的积分面积均数从正常鼠的0.28044325±0.063398877上升到0.422089375±0.062680524，p<0.001；

threonine的积分面积均数从正常鼠的0.785947±0.120669645上升到1.26176±0.151115543，p<0.001；

则表明阳虚型老年便秘动物模型造模成功，模型稳定。

所述大鼠为spraguedawley大鼠，体重为180~200g；将实验大鼠置于饲养笼中自由摄食和饮水。

所述20个生物标志物获取的具体方法为：在动物模型构建完成后，分别收集空白对照组大鼠与模型组大鼠的粪便，并对其分别进行核磁共振分析，得到空白对照组与模型组大鼠的¹hnmr谱图；使用mestrenova软件对所有的¹hnmr谱图进行总面积归一化处理得到积分数据，然后对空白对照组与模型组大鼠的¹hnmr谱图积分数据矩阵进行多元统计分析，得出空白对照组与模型组的大鼠粪便内源性代谢物的轮廓图，应用多元统计分析方法对代谢轮廓进行表征，采用主成分分析法对数据进行代谢轮廓分析，考察各组数据分离情况，得到阳虚型老年便秘大鼠模型的代谢轮廓图和有显著差异的生物标志物，结合统计学分析，得到空白对照组与模型组大鼠粪便生物标志物的积分均值及变化趋势。

具体分析方法为：对核磁数据进行模式识别，得到空白对照组与模型组的主成分分析图，即pca图，当模型组偏离正常对照组，且两组在第一主成分轴上的分离效果明显，证明阳虚型老年便秘模型构建成功；

在pca的基础上，利用正交偏最小二乘-判别分析法和排列测试对正常对照组和模型组大鼠粪便进一步分析，测试验证模型的适应度和预测能力；

最后，利用变量重要性(vip)值>1.0，s-plot相关性绝对值>0.58并结合统计学p<0.05获得潜在的生物标志物；从对照组与模型组中找到含量变化显著的变量，然后对空白对照组与模型组大鼠粪便进行核磁分析，并按照总面积归一化积分的方法对得出核磁图谱进行积分，得出20个生物标志物的含量变化。

所述空白对照组大鼠构建方法为：在造模期间每日皮下注射与模型组大鼠等量的生理盐水，从第7周开始，每日灌喂与模型组大鼠等量的蒸馏水。

本发明所述方法用大鼠构建的阳虚型老年便秘模型，操作简单、成本低廉、成功率高、病理改变稳定、可重复性强，具备突出的实质性特点。

通过空白对照组与模型组大鼠粪便代谢轮廓和内源性代谢产物的变化来验证所构建的阳虚型老年便秘模型。胃肠道功能病变是老年便秘发生的重要病因之一。粪便是胃肠道的代谢产物，可以更直接反映机体生物功能的状态。粪便代谢轮廓及其内源性代谢物的变化，可以更灵敏地揭示老年便秘动物的机体状态。

核磁共振(nmr)是代谢组学研究中应用最为广泛的分析技术之一，具有灵敏度高、重复性好、选择性高等优点。因此，应用nmr能更加广泛全面地表征老年便秘大鼠的代谢轮廓，更加准确评价模型的构建情况，具有高效、快速、准确等优点。

筛选到的生物标志物为20个，分别为：alanine、asparagine、aspartate、betaine、butyrate、citrate、creatinine、glucose、glutamate、glutamine、isobutyrate、isoleucine、lactate、leucine、methionine、phenylalanine、propionate、pyruvate、scyllo-inositol、threonine。上述指标的变化，能整体、系统地评价老年便秘模型的成功性，克服了其他便秘相关评价指标的片面性。

与单维筛选方法比较，多元统计分析方法可以筛选去除很多干扰，获得与老年便秘直接相关的差异变量(生物标志物)。此外，生物机体内代谢物彼此关联，相应的变量之间也存在相互联系，有些变量甚至只有和其他变量结合在一起时才具有统计学意义或生物学意义。因此，多维统计方法能够很好地捕捉到这些单维分析认为没有意义的变量。

老年便秘会导致机体内源性代谢轮廓的异常，进而引发相应代谢物含量的变化。这些代谢物在空白对照组和模型组之间的显著性变化，可整体地、动态地评价大鼠从正常状态向便秘状态的转变。

本发明采用基于nmr技术的代谢组学方法，通过分析空白对照组与模型组大鼠粪便中内源性代谢产物的变化，获得代谢轮廓图谱。同时，使用mestrenova软件对所有的核磁谱图进行总面积归一化处理得到积分数据，并结合20个生物标志物的含量统计学分析，发现空白对照组与模型组大鼠粪便中的20个生物标志物积分均值的变化一定程度上反应了老年便秘动物粪便代谢物含量的变化趋势，从而针对性地评价老年便秘的模型。代谢产物处于生物机体中的终端，上游基因和蛋白质的微小变化都会在代谢物上得到放大。因而，代谢产物可更加灵敏地表征生命现象，能忠实地反应机体在外界干预下代谢网络调控过程发生的微观变化。且迄今为止，未见代谢组学方法用于老年便秘模型的评价。

相对于现有技术，本发明皮下注射d-半乳糖可诱导衰老，而灌胃白醋和活性炭冰水混合物可以使胃肠动力发生变化，出现便秘症状，二者复合获得老年便秘动物模型。所构建的动物模型不仅体现了衰老和便秘两个特性，更能体现临床上老年便秘的特征，模拟临床老年人便秘症状，适应于治疗老年便秘的中药筛选，可为发展相关的新药研发提供实验依据。

所述方法较以往的模型评价相比更加全面、综合系统的体现出空白对照组与模型组大鼠机体的代谢轮廓，也体现出模型复制的合理性和科学性，可以为药效作用研究、作用机制探讨、新药研发提供一种可靠的阳虚型老年便秘模型的评价方法，具有高效、快速、特异性强的优点。

附图说明

图1为空白组大鼠粪便¹hnmr的代谢物指纹图谱；

图2为模型组大鼠粪便¹hnmr的代谢物指纹图谱；

图3为空白组和模型组粪便pca轮廓图；图中：横坐标及纵坐标分别表征第一主成分和第二主成分。nc：空白对照组；sg：老年便秘模型组；

图4为空白组和模型组的排列验证图；

图5为空白组和模型组的粪便s-plot图；

图6为空白组和模型组的morris水迷宫测试的轨迹图；

图7为空白组和模型组的morris水迷宫测试的逃逸潜伏期图；图中："*"代表与空白对照组相比，*p<0.05。nc：空白对照组；sg：老年便秘模型组；

图8为空白组和模型组的morris水迷宫测试的穿越平台次数图；图中："*"代表与空白对照组相比，*p<0.05。nc：空白对照组；sg：老年便秘模型组；

图9为空白组和模型组的首次排黑便时间图；图中："*"代表与空白对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。nc：空白对照组；sg：老年便秘模型组；

图10为空白组和模型组的胃排空率图；图中："*"代表与空白对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。nc：空白对照组；sg：老年便秘模型组；

图11为空白组和模型组的小肠推进率图，图中："*"代表与空白对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。nc：空白对照组；sg：老年便秘模型组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。需要说明的是，只要不构成冲突，本发明中的实施例以及实施例中的各个特征可以相互结合，所形成的技术方案均在本发明的保护范围之内。

实施例1：一种老年便秘动物模型的构建方法，包括以下步骤：

每日上午8点皮下注射d-半乳糖溶液300mg/kg，即浓度为300mg/ml（0.1ml/100g）。从第7周开始，按首剂量5ml/只给予白醋，此后单双日交替给予大鼠白醋（3ml/200g）和16.67mol/l的活性炭冰水混合物（5ml/200g），连续5周后得到老年便秘动物模型。造模时间共计为11周。

空白对照组大鼠，具体构建方法为：每日上午8点皮下注射同模型组等量的生理盐水。从第7周开始，灌胃和模型组的等量的蒸馏水，造模时间共计为11周。

实施例2：对所构建的老年便秘动物模型进行验证，应用多元统计分析方法对代谢轮廓进行表征，采用主成分分析法对数据进行代谢轮廓分析，考察各组数据分离情况。

具体方法是在动物模型构建完成后，分别收集空白对照组与模型组大鼠的粪便，并对其进行核磁分析，得出空白对照组与模型组大鼠的核磁谱图，结果见图1和图2；然后，对空白对照组与模型组大鼠的核磁谱图积分数据矩阵进行多元统计分析，得出空白对照组与模型组的大鼠粪便内源性代谢物的轮廓图，结果见图3，从图3可以看出第11周时，模型组偏离正常对照组，且两组在第一主成分轴上的分离效果明显，证明阳虚型老年便秘模型构建成功。通过对比空白对照组与模型组大鼠粪便中内源性代谢产物的变化情况，进一步验证老年便秘模型。

在pca的基础上，利用正交偏最小二乘-判别分析法和排列测试对正常对照组和模型组大鼠粪便进一步分析，测试验证模型的适应度和预测能力，结果见图4。排列验证的结果表明构建的老年便秘模型的适应度（r²=0.938）和预测能力（q²=0.890）良好。

利用变量重要性(vip)值>1.0，s-plot相关性绝对值>0.58并结合统计学p<0.05获得潜在的生物标志物，从空白对照组与模型组中找到含量变化差异显著的变量。这些变量涉及到的代谢通路参与老年便秘的发生、发展过程。s-plot分析结果见图5。

从空白对照组与模型组中找到20个含量变化差异显著的变量的生物标志物为：

alanine、asparagine、aspartate、betaine、butyrate、citrate、creatinine、glucose、glutamate、glutamine、isobutyrate、isoleucine、lactate、leucine、methionine、phenylalanine、propionate、pyruvate、scyllo-inositol、threonine。

分析得出20个生物标志物的含量变化，与空白对照组大鼠相比，在模型构建第11周时的20个生物标志物的含量变化如下：

模型大鼠粪便中betaine、butyrate、glucose、scyllo-inositol含量显著下调，具体含量变化如下：

betaine的积分面积均数从正常鼠的0.576916±0.138669317下降到0.364879±0.055045628，p<0.001；

butyrate的积分面积均数从正常鼠的2.054152125±1.132002605下降到0.845627875±0.406826504，p<0.05；

glucose的积分面积均数从正常鼠的0.163973388±0.055315766下降到0.050115913±0.033780499，p<0.001；

scyllo-inositol的积分面积均数从正常鼠的0.237631667±0.087895853下降到0.129596283±0.025747797，p<0.05。