专利名称：用于珍珠生产的活化珠贝血细胞的制剂和使用这种制剂生产珍珠的方法
技术领域：
本发明是有关在珍珠养殖中，将活化珠贝血细胞的制剂用于核植入术中并用这个制剂生产珍珠的方法。本发明提供了一个有用的和崭新的技术以提高珍珠养殖业的产率。
更准确的说，本发明的制剂在生产珍珠中活化珠贝核植入术中创伤部位的血细胞，因此促进了供体外壳切片的组织生长，供体是其它的珍珠贝(这个切片以后称为“移植片”(Piece))，这个移植片植入后，与核一起在核周围形成优良珍珠囊。因此使用本制剂能使珍珠产量得到提高。
珍珠养殖技术首先在日本得到肯定，并发展为日本特有的重要行业。最近，这个技术已传播到国外，例如东南亚。
在珍珠养殖业中，核植入术是重要的一步，是通过切开贝类的性腺部分进行的，这些贝如牡蛎马氏珠贝(Pinctadamartensii)，马西珠贝(Pinctadamaxima)或淡水珍珠贻贝(Hyriopsisschlegeli)，在切开处相互紧密的植入(1)加工美国淡水贝粗壳制得的球形核，(2)把供体外壳部分切成2～3毫米的方形移植片。
粒状血细胞(granularbloodcells)和非粒状血细胞(agranularbloodcells)存在于游动状态即所谓贝类体液中的血细胞，其作用与巨噬细胞和淋巴细胞在脊椎动物中的作用相似。并认为像脊椎动物的巨噬细胞和淋巴细胞的作用一样，这些细胞组织群称为无脊椎动物的血细胞或游动细胞，其体液被看做为血液。
血细胞，特别是非粒状血细胞沿着核植入术的切口部位里面聚集并在核表面形成一片血细胞。移植片的组织细胞沿着这个片的部分繁殖，逐渐围绕核形成珍珠囊，在核表明的这些囊内形成珍珠质层。植入移植片的目的是形成珍珠囊，以在该核表面分泌珍珠质。
由前面叙述可以了解到，血细胞在植入术的局部聚集越快，手术伤口愈合越早则形成珍珠囊的可能性越大。同时珍珠产生的速度增加，产率提高。在珍珠培养中重要的是各步消耗低廉，产率优良，技术的发展使这大有希望。
许多因素影响珍珠的质量，例如核植入术时，移植片与核接触不好，可能形成缺乏珍珠质层的核(Shiradama舍拉达玛)或仅部分被珍珠质覆盖的核(Kuzudama库祖达玛)，这两种情况都没有任何商业价值。为了帮助确证这种密切接触，长期的经验是用海水稀释红汞、阿克蒂佐(actiaol)曙红Y，食色红或类似的东西染色移植片。
此外利用药理学的作用，进行了许多尝试以便生产高质量的珍珠。为此使用了蛋黄卵磷脂、光敏感染料、抗菌素等。据说蛋黄卵磷脂活化细胞，光敏感染料有象活化细胞，促使创伤愈合以及消毒等生理活性、抗菌素主要用于消毒和抑菌。
以光敏感染料为主要成分的制剂实例，那可提到普拉克新(Proxin)(KKNipponKankoShikisoKenkyusho制造，其中普拉特宁(Pratonin)和牛新(Neoxim)相复合)，和米诺1号(Minol)№1(日本KKKankoShikisoKenkyusho制造)。抗菌素类象金霉素、氯四环素等已被使用。而且用做偶氮染料的偶氮胺(HeiwaSeiyakuKK)4已在市场出售。偶氮胺是一个含有磺硫基偶氮萘酚二磺酸和对氨基苯磺酰胺为偶氮染料的制剂，具有消毒抗炎的活性，与软骨素硫酸酯钠盐或牛磺酸钠盐配合为一个活化细胞剂。除具有药理作用以外，还可用该偶氮染料移植片。
所有在市场上出售的这些试剂在使用时，都用海水稀释到预定浓度，然后用于染移植片，例如用滴管把稀释液滴在切成小块的移植片上，用刷子或类似的东西把稀释液刷于移植小片上，或者切割以前将整个移植片浸泡在稀释液里。
现将这些有效技术例举于下。这些来源于Uemoto等珍珠养殖(ShinjunoYoshokn)由NipponShinjuShinkoKai，东京，出版pp29-30(1987)。Takaoka(1957)报告说，效果产生于蛋氨酸和依流米诺RⅡ(IlluminolRⅡ)而得到更高优良珍珠出现率。Yamashita(1961)等报告说，在用Pratonin或Neoxin为光敏感染料时，产生的珍珠有极少的CH载体的瑕疵。他们的见解仅基于2或3个贝而且由于试验例数太少，所以难以评价。Miyanchi(1962)报告说，曙红Y是较为无害的，与红汞相比珍珠出现的较快，品位也高，通过将移植片用氯四环素(“金霉素”)和红汞混合液染色，并用该液浸泡贝类以及在核植入前后，将所使用的仪器浸泡在氯四环素溶液中，这样使高品位珍珠出现的速度变高，缺少珍珠质层(Shiruduma)的核出现速度变低，同时核植入后死亡速度降低。Machii(1965)报告的结论为蛋黄卵磷脂、金霉素和品克洛龙(pincchloron)分别与对照组相比得到较好的结果而说明有效，这些好的结果为，以蛋黄卵磷脂的试验，20个试验中12个较好，金霉素是14个组中8个较好，品克洛龙(Pincchloron)的情况是33个组中19个较好，这些试验是每组用100～300个贝进行的。然而，Machii也提请注意祁祖达玛(Kizudama)(核失去一些珍珠质或有隆凸物)使商业价值受到限制)和库祖达玛(Kuzudama)现象产生的速度在许多组增高。此外，Machii(1967)发现以蛋黄卵磷酯和品克洛龙(Pincchloron)一起应用，蛋黄卵磷酯和金霉素一起应用都有效，并说在这种情况，虽然祁祖达玛(Kizudama)和库祖达玛(Kuzudama)现象均未降低，但由于植物毒性使库祖达玛(Kuzudama)数增加的问题消除了。
此外，发现偶氮胺处理的组收获的高品位珍珠的产率比对照组高，但不能肯定这种发现是否可信。
由在养殖场实际应用得到的坏的结果可预料，这些制剂不能提高主要的产率，因此，就希望增加优质珍珠的产量。为形成珍珠囊，植入移植片的组织切割必须有规则的进行，为此，前提条件是贝体内的许多非粒状血细胞围绕着植入核聚集并成光滑状态。这样，必须通过活化血细胞，促进移植片的活性而使之形成优质珍珠囊。
由前述的观点看，是希望对实际应用进一步改善传统的技术。很明显的是前述情况为，已知的方法留下了关于它的效果等问题。
本发明在非常有趣的发现的基础上已经完成，即已知为一个细胞动力学因子的促细胞分裂剂可能是活化珠贝血细胞的一个活性成分。
更明确的说，本发明涉及活化珠贝血细胞的制剂，该制剂含有促细胞分裂剂为有效成分。
“促细胞分裂剂”对诱导和促进细胞动力学的物质是一个一般的术语。典型的促细胞分裂剂包括脂多糖(以下称为LPS)它广泛存在于构成格兰氏阴性菌的胞壁成分中;含于某些蔬菜种子内的植物血凝素;衍生于象结核耐酸菌的纯化蛋白衍生物(以下简称为PPD)。由于其促有丝分裂和其他生物活性，这些物质在传统上用于生物和生化研究。所有这些典型促细胞分裂剂在商业出售的都是纯化制剂。
作为获得脂多糖的方法，有Westphal等的方法，即将这种细胞悬浮于热的酚水中提取LPS(VanOffWestphaletal.，ZNaturforsch.，7B148-155(1952);Boivin等的方法，即这种细胞以二氯醋酸提取(Biovin，Aetal.，CompRendSocBiol.，113，490(1933)和128，5(1938)等。现在本发明者发现，所有LPS制剂都能活化养殖的珠贝血细胞的活性，这些制剂是按上述方法由各种格兰氏阴性菌细胞如埃希杆菌属(Escherichia)、沙雷菌属(Serratia)，沙门菌(Salmonella)、志贺菌(Shigella)，弧菌(Vibrio)和假单孢菌属(Pseudomonas)制备的，而且发现该LPS制剂可广泛用于本发明的方法。为得到用于含LPS制剂的细胞，没有什么特殊的、不可缺少的培养条件。
由耐酸菌衍生的PPD是一个纯化的蛋白衍生物，是由在扫通⊿auton)介质中肉汤培养的结核杆菌得到的，可用于本发明的方法。类似活性的物质可由其他耐酸菌得到(象PPD的物质)。
植物血凝素类(Lectins)是从植物，特别是从豆科植物种子得到的促细胞分裂剂。植物血凝素是一个一般的蛋白术语，这个蛋白能辨认专一的糖链结构并与之结合。这些植物血凝素可以被纯化，例如用交联葡聚糖做为特殊的载体的亲合层析法来纯制。植物血凝素有广泛的生物活性。其中能促进淋巴球分裂的典型植物血凝素是产生于蚕豆的伴刀豆球蛋白A(ConA)、菜豆植物血凝素(PHA)，美国商陆植物血凝素(PWM)和凝聚素(agglutinin)。所有这些物质都能活化养殖的珠贝血细胞并可用于本发明的方法而得优良的结果。
本发明中显示促细胞分裂剂活性的其他物质要求或多或少的包括含有LPS的灭活的微生物细胞和含这种细的灭活液体培养基。许多格兰氏阴性菌如埃希杆菌属、沙雷菌属、沙门菌、志贺菌、弧菌、假单孢菌属等任何适于制备LPS制剂的微生物都可被利用并且不限特定品种。此外，只要适合于微生物生长的任何介质，任何培养方法都可用这些微生物的培养。
有趣的是，辅助物质的一起存在，对进一步提高本发明的促细胞分裂剂活化血细胞的活性是有效的。铝佐剂如钾铝凝胶、氢氧化铝凝胶、磷酸凝胶全是有效的佐剂、显示佐剂活性的其他物质也可使用。这些包括胞壁酰基二肽(muramyldipeptide)和许多其他能提高免疫活性的物质。
甚至单独使用一个促细胞分裂剂就显示示本发明要求的效果，而单独使用一个佐剂则效果极小。使用佐剂处理的促细胞分裂剂产生最有希望的活性。
生理盐水、林格液、人工海水等在制备本发明的制剂时，用于悬浮液的液体(为稀释和制剂用的液体)是更可取的。天然的海水也可用于此目的。此外，缓冲液也使用，只要控制pH在5～7的范围就可以。
本发明中，LPS制剂浓度调到0.5～100ng/ml，10～50ng更好，植物血凝素制剂浓度调到1～2000ng/ml，10～100ng/ml更好，PPD制剂浓度调到1～1000ng/ml，10～100ng/ml更好，灭活菌制剂浓度调到106-9/ml，107-8/ml更好，稀释用的盐溶液如生理盐水或林格液或缓冲液。加铝凝胶在pH5～7的范围进行佐剂处理是进一步的希望。
铝凝胶的浓度加到0.005～1mg/ml是适宜的，加至0.01～0.1mg/ml更好(以Al2O3，计最终浓度)。
在用灭活菌制备制剂时，将微生物细胞悬浮于诸如生理盐水，林格液等里面到预先决定的细胞浓度，然后在55℃规定的温度加热处理1小时，或加福尔吗啉至浓度为5v/v%处理30分钟。关于以上步骤，灭活的任何传统方法都可利用。
将由大肠杆菌衍生的含10ng/mlLPS的林格悬浮液和0.03mg/ml钾铝凝胶作为较好的制剂，用于珠贝核植入术中移植片的浸泡处理时，发现局部创伤部位血液中所含血细胞的数目明显增加了。在植入术后24小时珠贝的血细胞数达到最大值，血细胞的数目为未处理珠贝的1.6倍或者更高。另外，用灭活菌制剂，例如用钾铝凝胶处理的阿基诺弧菌(V.alginolyticus)灭活菌细胞悬浮液，使血细胞的数目增加80%。植入术后24小时血细胞数达到高峰，以后血细胞数保持恒定或降低。应当考虑的是，这种局部血细胞的活化促进了珍珠囊的形成。
这些促细胞分裂剂不仅单个可用，而且也可合并使用。例如可使两种或多种LPS和植物血凝素合并应用，或者分别选择LPS，植物血凝素和PPD中的一些合并使用。灭活菌的类似的合并使用也是可能的。
现在对养殖业所利用的制剂，当然应当是无菌制备。这种制剂可以防腐，如果封入适宜的器皿如小玻璃瓶，在传统的冷暗储存条件下保存，就可长期保持所希望的活性。然而，本发明的制剂加铝凝胶可在冷冻条件下储存，这通常是加铝凝胶的制剂储存条件。
为本发明制剂主要成分的促细胞分裂剂和佐剂，希望在纯的状态使用，因为这能重现本制剂的质量，能提供性能和状态方面都非常稳定的制剂。本制剂可在工业规模制备，不管任何时间和地点，都是反映出珍珠养殖场的需要。
促细胞分裂剂对哺乳动物细胞的作用和作用机制是已知的。尤其明了的是ConA，PHA等刺激T细胞，LPS刺激B赴约癙WM刺激T和B细胞的作用与机制。更进一步知道，当这些促细胞分裂剂加入试管的淋巴细胞并接着培养时，这些淋巴细胞变成大量有分裂能力的幼稚细胞，在这一步各种淋巴激活素和单核激活素产生并分泌。
促细胞分裂剂对无脊椎动物，特别是对牡蛎包括其血细胞的作用知道的很少，还不清楚促细胞分裂剂对这些贝类的作用是否类似于对哺乳动物细胞的作用。本发明者发现了珠贝等的血细胞受到诸如LPS，植物血凝素，PPD或灭活菌等促细胞分裂剂的活化，此外，这种活化作用由于佐剂的共存而进一步提高，这被认为是一个新发现。
正如最近的实例证实的，由于使用本发明的制剂，排核的数目减少，相当数量的有商业价值的珍珠的质量和产量都提高了。因此，本发明提供了一个生产珍珠的有用的方法。可以预料，这个方法将大大促使养殖珍珠的产率增加。
本发明的制剂能用于珠贝类，并且对这些贝类的生长没有不良影响。此外，通过试验证明，没有异常的毒性，甚至在这些制剂漏入自然环境时，也是没有危险的。也就是说，分别由大肠杆菌衍生的LPS加钾铝凝胶，由阿基诺弧菌(Valginolyticus)衍生的LPS加钾铝凝胶，ConA加钾铝凝胶或单独钾铝凝胶;或高浓度的溶液稀释10倍的溶液，以腹膜给药红鳟鱼(BW，5g)，幼鲱(BW，20g)，ddy鼠(BW，20g)，哈特雷荷兰猪(Hartleyguineapigs)(BW，200g)，每组5个动物，各组的剂量分别为0.2ml，0.5ml，0.5ml或3.0ml。这些动物与不给上述制剂的对照组动物一起观察2周。在体重或其他一般状况均未见异常。
本发明的制剂用做促细胞分裂剂主要成分，已知为自然界微生物和植物的正常构成成分，此外，在显示本发明的效果所需这些成分的浓度和剂量都是很低的。因此，应当相信，本制剂的安全是没有问题的。
本发明透过实例进一步叙述如下，但并不限于此。
实例1LPS制剂(1)通过类似于Westphal等的方法，参照早期用大肠杆菌在普通琼脂介质中经过25℃24小时培养。湿细胞(10g)以90w/v%热酚水提取，提取物进行反向蒸馏水渗析。然后在100000Xg离心2小时，得到的沉淀被离心干燥，干重12mgLPS制剂。
(2)粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)象实例1～(1)中一样的方法进行培养，得到的湿细胞(10g)用象实例1～(1)同样的方法处理得到18mg干重的LPS制剂。
(3)阿基诺弧菌(V.algionolyticus)在含有2w/v%NaCl的普通液体培养基中，在25℃培养24小时。由培养的细胞中用类似于Boivin等较早期的方法制备LPS。湿细胞(5g)用0.5N三氯醋酸水溶液提取，提取液在6000Xg离心30分钟。将冰冷到-15℃的乙醇加到上清液，这种混合物在4℃放置过夜。然后这种混合物在6000Xg离心30分钟。沉淀用乙醇-乙醚洗涤后溶于蒸馏水渗析。溶液进一步在27000Xg离心30分钟，上清液冷冻干燥，得到8mg干重的LPS制剂为白色粉末。
实例2活化珠贝血细胞制剂(下称为本制剂-ThePresentpreparation)(1)将按实例1～(1)的方法制备的由大肠杆菌衍生的LPS溶于林格液(通过溶解8.6g NaCl，0.3g KCl，0.33g CaCl2于1000ml纯水中制备的)至浓度分别为1，5，100，500，1000，5000和10000ng/ml。将10w/v%的钾铝凝胶加到每一个溶液至最终铝浓度为0.5w/v%，将混合物的pH调到0.5。混合物在3000rpm离心20分钟。沉淀物分别再悬浮于10倍于第一次用量的林格液，得到本制剂总量500mg分别含0.1，0.5，10，50，100，500和1000ng/ml LPS本制剂。
(2)分别含有1，10，50和100ng/mlLPS(衍生于V.alginolyticus该菌是按实例1～(3)的方法得到的)的总量为500mg的本制剂是按实例2～(1)相同的方法得到的。
此外，将LPS溶于500ml林格液至10mg/ml，然后在搅拌下加氢氧化铝凝海 w/v%以Al2O3计)至最终铝浓度为0.03mg/ml。此时该制剂的pH为5.8。这样就得到含10ng/ml LPS的500ml本制剂。
(3)照实例1～(1)的方法得到由大肠杆菌衍生的LPS以氢氧化铝凝胶按实例2～(2)的方法处理，得到100ml最终浓度含0.03mg/ml铝，10ng/mlLPS的本发明制剂。另外，含有最终浓度为0.03mg/ml铝和10ng/mlLPS的100ml本制剂，通过重复以上步骤而得到(除了以磷酸铝代替氢氧化铝)。
(4)应用按实例1～(1)得到的由大肠杆菌衍生的LPS，通过类似于实例2～(1)的步骤制得总量100ml的本制剂，不同的是代替林格液做为稀释剂的是用生理盐水和PBS(由溶解8.0g NaCl，0.2g KCl，1.15g Na2HPO4和0.2gK2HPO4按此顺序到纯水1000ml制得)和人工海水(由溶解26.75gNaCl，10.75gKCl，3.42g MgCl2，2.1g MgSO4和0.51g CaCl2按此顺序到1000ml纯水中制得;KiyoharuKokubo，“KaiyoSeibutsugaku”(海洋生物学)pp227-228，KoseiShaKoseikaku(东京)出版，1968)(5)将购于FunakoshiYakuhin有限公司的ConA，PHA和PWM分别溶于林格液，该溶液按类似于实例2～(1)的方法制得总量500ml分别含植物血凝素的本制剂。
(6)应用类似于“SeibutsugakutekiSeizaiKijun”-生物制剂规范(在药事局和福利部监督下编辑，由SaikinSeizaiKyokai，东京，出版，pp57-61，1985)的方法，由培养的结核杆菌扫通(Sauton)介质中得到的培养滤液制备冷冻干燥的结核菌干燥蛋白粉即PPD。这种PPD溶于林溶液，随后按实例2～(1)的方法处理，得到100ml含PPD的本制剂。
(7)将阿基诺弧菌(V.algionlyticus)在普通琼脂介质中培养24小时。产生的细胞悬浮于林格液至细胞浓度为107/ml，然后在55℃加热1小时灭活。为用佐剂处理将钾铝凝胶加到该细胞悬浮液中至铝含量为0.03mg/ml(以Al2O3计)得到以钾铝凝胶处理的本制剂500ml细胞悬浮液，其中V.alginolyticus是用加热灭活的。
实例3应用结果应用本发明制剂的结果列于下。通过将移植片分别浸泡于本制剂进行试验，每个珠贝植入两个核和两个移植片。每个移植片使用0.05ml本制剂。未处理组为对照。按照传统的方法测定血细胞的数目，即以注射器由植入核的附近抽取血样0.1ml，以林格液稀释到原体积的10倍，再用一个薄刊一特克(Burken-Turk)血细胞计数板测定血细胞数。在每个测定中，每组10个贝的每个贝0.1mm3血的血细胞数的平均数列于表1。
(1)对按实例2～(1)和含有由大肠杆菌衍生的LPS的本制剂以及钾铝凝胶处理的和按实例2～(7)方法加热灭活V.alginolyticus细胞悬浮液制备的本制剂这两种情况，观察了核植入的局部伤口部位的血细胞数的变化。参比试验单独用LPS或钾铝凝胶进行。术后观察24，48和72小时。
结果列于表1。由该表明显的看到，所有试验组的血细胞数都高于未处理的对照组。这种趋势在用本发明制剂的试验组特别显著。
表1核植入术后局部血细胞数术后时间组24小时48小时72小时衍生于大肠杆菌的LPS10ng/ml1，1991，1271，065铝凝胶1，1441，2251，103衍生于大Ω司腖PS0.1ng/ml+铝凝胶1，2161，1819610.5ng/ml+铝凝胶1，3761，2851，13110ng/ml+铝凝胶1，5111，4781，28450ng/ml+铝凝胶1，6581，3971，509100ng/ml+铝凝胶1，7011，4812，072500ng/ml+铝凝胶1，5681，2181，2411000ng/ml+铝凝胶1，4761，3661，800V.alginolyticus细胞悬浮液+铝凝胶1，2171，3451，685对照1，0751，091882
(2)对按照实例2～(3)和含由大肠杆菌衍生的LPS制备的本发明制剂以及按照实例2～(7)制备的钾铝凝胶和加热灭活V.alginoltyicus的细胞悬浮液制备的本发明制剂这两种情况，进行了各种佐剂在核植入术后对局部血细胞的作用。
由列于表2的结果明显的看到，术后24小时试验组的血细胞数大于对照组，这种超势在11个佐剂都看到了。这种趋势在48和72小时是不明显的。实例3～(1)和3～(2)表明，本制剂的效果可通过测定术后24小时的血细胞数最快最准确的确定。因此，在这里只讨论了持续24小时试验所表明的结果。
表2核植入术后局部血细胞数术后时间组24小时48小时72小时由大肠杆菌衍生的LPS10ng/ml+铝凝酸1，105892918由大肠杆菌衍生的LPS10ng/ml+氢氧化铝凝胶1，250913946由大肠杆菌衍生的LPS10ng/ml+磷酸铝凝酸1，273851917阿基诺弧菌(V.alginolyticus)细胞悬浮液+1，115905931铝凝胶对照9767171，017
(3)稀释和制剂用的各种溶液对核植入术后局部血细胞数的作用，以按实例2～(4)的方法和含有由大肠杆菌衍生的LPS制备的本制剂进行了研究。在对照试验组用林格液制备了单独的钾铝凝胶溶液。
从表3的结果明显的看到，在所有试验组中血细胞数都大于对照组，因此，用来稀释和本制剂用的溶液可用于本发明制剂。
表3核植入术后局部血细胞数组术后时间24∈ 由大肠杆菌衍生的LPS10ng/ml+铝凝胶林格液1，227生理盐水1，443PBS1，058人工海水1，287铝凝胶1，017对照929(4)由各种格兰氏阴性菌衍生的LPS制备的本制剂，对核植入术后局部血细胞的作用已经研究过了。表4中的本制剂(1)和(5)是分别按照实例1～(1)和2～(2)制备的。本制剂(2)、(6)和(7)是用按实例1-(2)得到的LPS新制备的，本制剂(3)和(4)是用商业LPS(Difco公司制)新制备的。
正如从表4的结果看到的，所有试验组的血细胞数大于对照组的，因此，所有LPS都可用于本发明制剂。
表4核植入术后局部血细胞数组术后时间24小时(1)大肠杆菌1，048(2)粘质沙雷氏菌1，136(3)肠炎沙门氏菌1，211(4)弗氏志贺氏菌1，049(5)阿基诺弧菌(V.aginolyticus)1，171(6)副溶血弧菌1，248(7)绿脓杆菌1，163对照915衍生于上面微生物的LPS10ng/ml+铝凝胶(5)用PPD和各种植物血凝素制备的本发明制剂对核植入术后局部血细胞数的作用进行了研究。本发明制剂是根据实例2～(5)和2～(6)制备的。
正如由表5的结果看到的，所有试验组的血细胞数都大于对照组的，因此，这些PPD和各种植物血凝素都可以用作本发明制剂。
表5核植入术后局部血细胞数组术后时间24小时PPD100ng+铝凝胶1，602ConA100ng+铝凝胶1，541ConA1000ng+铝凝胶1，681PHA100ng+铝凝胶1，570PWM100ng+铝凝胶1，521衍生大肠杆菌的LPS10ng/ml+铝凝胶1，804铝凝胶1，414对照1，085(6)核植入术是在每组100个珠贝，使用按照实例2～(1)和(3)及含由大肠杆菌衍生的LPS制备的局萍两械摹酥踩牒 5天，为比较覆盖珍珠的质和量进行开贝试验(打开贝壳以测定珍珠质量)。将珍珠分成无瑕疵，一个瑕疵和大量瑕疵并数每类的数目。
正如由表6看到的，所有试验组的结果好于对照组的。更明确地说，在试验组无瑕疵珍珠较多，大量瑕疵的珍珠较少。此外，在试验组排核数较少珍珠总数较大。甚至在比较核植入的产率时，试验组的结果也超过对照组的。
按如下方法计算产率。首先，假定每个无瑕珍珠的值是200元，有一个瑕疵的珍珠为50元，有大量瑕疵的珍珠为10元来计算覆盖珍珠的总值。这个总值除以开贝的总数得到每个贝的平均值。这个结果确定为产率。在其它例子里做产率的类似计算。
表6通过开贝试验比较珍珠质量珍珠数产率组无瑕疵一个瑕疵大量瑕疵总数元/珠贝大肠杆菌LPS1ng/ml+铝凝胶52524114512910ng/ml+铝凝胶39456615010350ng/ml+铝凝胶44685216412510ng/ml+氢氧化铝凝胶376853158112对照22347212866(7)核植入术每组用100个珠贝进行，所用的本制剂是按照实例2～(1)并含由大肠杆菌衍生的LPS的制剂，以及钾铝凝胶处理的，和按实例2～(7)制备的加热灭活的V.alginolyticus细胞悬浮液制剂。术后21天进行开贝试验，比较覆盖珍珠的质与量。
表7的结果是明显的，所用试验组的结果，都超过对照组的。
表7通过开贝试验比较珍珠质量珍珠数产率组无瑕疵一个瑕疵大量瑕疵总数元/珠贝大肠杆菌LPS10ng/ml476750164129+铝凝胶V.alginolytius细胞悬浮液+铝凝胶347947160112对照22568015880(8)每组用100个珠贝进行核植入术，所使用的本发明制剂是按照实例2～(2)和含由V.alginolyticus衍生的LPS制剂以及按照2～(7)制备灭活的V.alginolylicus细胞悬浮液制剂制备的。核植入后27天进行开贝试验，并比较覆盖珍珠的质和量。
正如由表8看到的，无瑕珍珠的数目在使用本发明制剂的所有试验组都大于对照组的，因此，核植入的产率是试验组超过对照组。
表8通过开贝试验比较珍珠质量珍珠数产率组无瑕疵一个瑕疵大量瑕疵总数元/珠贝V.alginolyticusLPS1ng/ml+铝凝胶3832391099010ng/ml+铝凝胶44434313010950ng/ml+铝凝胶4632481261071ng/ml+氢氧化铝凝胶454543133112V.alginolyticus细胞悬浮液+铝凝胶28465613083对照27335511573(9)按照实例2～(5)制备的含ConA的本制剂的效果与含钾铝凝胶的对照试验的比较。核植入术每组用100个珠贝进行。核植入22天进行开贝试验，比较覆盖珍珠的质与量。
正如在表9看到的，所有试验的结果都超过对照试验组和对照组的。
表9通过开贝试验比较珍珠质量珍珠数产率组无瑕疵一个瑕疵大量瑕疵总数元/珠贝ConA100ng/ml+铝凝胶37405513296ConA1000ng/ml+铝凝胶33485013193铝凝胶29585314091对照29346312678(10)对按照实例2～(1)制备的含有由大场杆菌衍生的LPS的本发明制剂，根据收获结果进行了研究。每组用10000个珠贝进行核植入术。核植入后157天收获，对覆盖珍珠的质、量和产率进行测定和比较。将珍珠分成5等高级，中级，低级，(Siradama舍拉达玛)和(Kuzudama库袒达玛)。用级和大小(6mm或5mm)进行评价。
这一结果列入表10。核植入贝的存活数，试验组为78.9%，对照组为79.8%，这样两者之间几乎没有什么差别。然而，关于覆盖的珍珠，在试验组高品位珍珠数量是4，545，高品位加中级加低级珍珠总数是11，346，而对照组高品位珍珠数为3，376，高品位珍珠加中级加低级珍珠数是10，398。应当特别注意高品位珍珠数(具有高的价值)在试验组比对照组多，这种差别很重要。
此外，为比较产率，采用6mm高品位珍珠单位市场价3000元，5mm高品位珍珠1500元，6mm中级珍珠1000元5mm中级珍珠500元计算核植入的产率。在此基础上，试验组的产率是156元，对照组是107元，这样就增加了产率，降低了排核数。
表10比较收获珍珠的质量(大肠杆菌LPS10ng/ml+铝凝胶)大小质量品级总数mm高中低(舍拉达玛)(库袒达玛)高+中高+中+低试60.470.440.09验(476)(429)(905)组50.110.120.23(48)(95)(143)小0.580.560.30.080.091.141.44结(524)(524)(286)(1，048)(1，334)对60.280.370.65照(274)(329)组50.140.070.21(110)(55)小0.420.440.440.110.10.861.3结(384)(384)(440)(768)(1，208)
(11)对按实例2～(5)的方法和含ConA制备的本发明剂效果根据收获的结果进行了研究。核植入术每组用10000个珠贝进行。核植入后117天进行收获，用与实例3～(10)相同的方法测定和比较珍珠的质，量和产率。
表11列出了结果。高品位的珍珠数及高品位加中级加低级珍珠之总数，在试验组大于对照组，也证明了排核数减少的作用。
表11比较收获珍珠的质量质量品级高高+中+低试验组3，87811，411对照组3，26910，97权利要求
1.用于珍珠生产的活化珠贝血细胞的制剂，其含促细胞分裂剂为有效成分。
2.权利要求1的制剂，其中促细胞分裂剂选择于脂多糖，植物血凝素，衍生于耐酸菌的纯化蛋白衍生物和含有脂多糖的灭活菌。
3.权利要求2的制剂，其中脂多糖是通过传统的方法由格兰氏阴性菌得到的。
4.权利要求2的制剂，其中植物血凝素是产生于蚕豆的伴刀豆球蛋白A(ConA)，菜豆植物血凝素，美国商陆植物血凝素或凝聚素。
5.权利要求2的制剂，其中耐酸菌是结核杆菌。
6.权利要求2的制剂，其中含脂多糖的灭活菌是格兰氏阴性菌。
7.权利要求1的制剂，其中促细胞分裂剂是用佐剂处理过的。
8.权利要求7的制剂，其中佐剂是铝佐剂。
9.用于珍珠生产的活化珠贝血细胞的制剂由促细胞分裂剂的溶液或悬浮液组成。
10.权利要求9的制剂，其中溶液或悬浮液另外含铝凝胶。
11.权利要求9或10的制剂，其中促细胞分裂剂是在盐溶液或缓冲液中的溶液或悬浮液。
12.权利要求9或10的制剂含有促细胞分裂剂脂多糖0.5～100ng/ml，植物血凝素1～2000ng/ml，衍生于耐酸菌的纯化蛋白衍生物101111000ng/ml或含脂多糖的灭活菌10/ml。
13.权利要求10的制剂另外含有铝凝胶，其量以Al O计为0.005～1mg/ml。
14.权利要求1或9的制剂，其中珠贝是珍珠牡蛎，金属贝(goldlip)或淡水珍珠贻贝。
15.通过珠贝核植入术生产珍珠的方法，包括用促细胞分裂剂处理植入术供体外壳部分的移植片。
16.权利要求15的方法，其中促细胞分裂剂选于脂多糖，植物血凝素，衍生于耐酸菌的纯化蛋白衍生物和含脂多糖的灭活菌。
17.权利要求16的方法，其中促细胞分裂剂是用佐剂处理的。
18.权利要求17的方法，其中佐剂是铝佐剂。
19.权利要求15的方法，其中通过浸泡供体外壳部分的移植片在含促细胞分裂剂的溶液或悬浮液中来进行促细胞分裂剂的处理。
20.权利要求17的方法，其中通过浸泡供体外壳部分的移植片在含促细胞分裂剂和佐剂的溶液或悬浮液中来进行促细胞分裂剂的处理。
全文摘要
用于珍珠生产的活化珠贝血细胞的制剂含有促细胞分裂剂做为有效成分，通过珠贝核植入术生产珍珠的方法包括用促细胞分裂剂处理植入供体外壳部分的移植片。通过用本发明制剂处理，由于核植入术伤口部位的血细胞被活化，促进了供体外壳部分的移植片组织生长，围绕核形成优良珍珠囊，结果是，排核数减少，珍珠质量和产量都增加。
文档编号A01K61/00GK1037065SQ8810488
公开日1989年11月15日 申请日期1988年8月5日 优先权日1988年4月23日
发明者前田治久, 辻川章, 进贞夫 申请人:化学及血清疗法研究所