专利名称：：农作物花粉的贮藏方法农作物花粉的贮藏方法涉及作物的栽培方法，尤其是作物的杂交育种制种方法。一般来说，花粉成熟从花药裂出后，如得不到适宜的萌发条件，就会很快丧失生活力，如水稻成熟花粉离开花药后，大约5～10分钟萌发力就大为降低，15分钟后花粉的萌发力几乎全部丧失；这在常规作物生产中没有成为制约因素。自从我国杂交水稻三系配套成功并应用于生产以来，在杂交制种时，常常出现父母本的花期与花时不遇，从而造成花粉量不足，异交结实率低，产量不高甚至失收的情况。解决水稻杂交制种低产的途径是将水稻的父母本相间栽种，并调节父母本的花期，如美国专利4305225公开的是水稻的父母本相间种植，然后用控制田间水量和使用赤霉素来调节父母本抽穗和授粉的同步以达到花期相遇的目的；CN92106819.0公开的是在父本散粉高峰期统一赶粉和提高母本柱头外露率，创造最佳异交态势以及使母本剑叶角度改变，排除授粉障碍，毋需调节父母本花时而达到高产制种的方法；CN92111766.3公开的是一套较完整的全面调节花时，提高花粉利用率、实现高产制种方法。但是如何从根本上解决杂交制种父母本的花期、花时相遇，同时减少如赶粉、父母本间种等人工繁琐制种程序以达到稳定高产制种，走利用贮藏花粉的道路是一条有效的途径。本发明旨在提出一整套的花粉贮藏技术，以延长花粉寿命，使贮藏一段时间的花粉不仅有萌发力，而且具有授精能力，授粉后能正常结实；更是为建立一个“世界作物花粉库”，随时为育种家们供应世界各地的优良性状或有利基因的品种花粉提供科学的技术参数。实现本发明目的的技术方案是将采集的花粉置于下列条件中贮藏，(1)低温贮藏，花粉的短期贮藏的贮藏温度为0～5℃，长期贮藏时贮藏温度为-196℃，(2)湿度控制花粉短期贮藏时，温度为30～35％，长期贮藏时，湿度为25～30％，(3)避光贮藏离开花药的花粉必须立即置于绝对黑暗中避光贮藏直至使用，(4)花粉贮藏时使用1～5ppm的放线菌素(Actinomycin)0作花粉呼吸抑制剂，(5)贮藏时的花粉厚度应控制在5mm以下；在超低温度中长期贮藏的花粉在贮藏前需预冷处理，即先将花粉置于0℃温度条件下1～2小时，再置于-80℃温度条件下3～4小时，再进入超低温(-196℃)贮藏；同时，在超低温中长期贮藏的花粉，贮藏时，使用2～5％DMSO4(二甲基亚矾)或5％葡萄糖加2～5％DMSO4作防冻剂；对于贮藏花粉育性的检测，采用的人工萌发培养基配方为淀粉0.05g/ml蔗糖40～50％MnSO48～10-5琼脂0.5～1.0％H3BO350～100ppmPH5.6～6.0下面以水稻为例进一步详述本发明。待贮藏的水稻花粉，采集时期应为父本盛花期，采集时间为上午10～12点，下午1～3点，花粉离开花药后要立即进入低温瓶内(温度为0℃左右)，并处于黑暗条件中；注意机械采粉后的花粉萌发率不低于40％。采集的花粉贮藏前用筛或人工方法除去杂物，如花药、颖托收其它杂质；并将萌发率在40％以上的金黄色花粉与萌发率较低的花粉分类贮藏；在机械采粉过程中，有时由于采粉机械的转速过快，使花粉运动过烈，造成暂时“休克”，但只要花粉粒未破裂，经恢复性处理，即在黑暗条件下从低温转入25℃常温条件下在3—4小时内能萌发的，仍可贮藏作为授粉用。花粉的低温贮藏分为普通低温贮藏和超低温贮藏二种，当花粉贮藏的时间在7～15天时，可采取普通低温贮藏，即置于0～5℃的冰箱中贮藏，而对于需贮藏60天以上的花粉，即可置于液氮罐(-196℃)内贮藏；在液氮罐内保存了60天的花粉，各品种花粉萌发率和萌发花粉的花粉管长度，几乎保持了新鲜花粉的水平，而置于5～7℃冰箱内的花粉，60天后的花粉萌发率大多比新鲜花粉的萌发率降低了30～40％，有的降低了一半以上(见表1)。表1低温贮藏对花粉萌发的影响(贮藏时间60天)在低温条件下，花粉的生活力是随贮藏时间的延长而逐渐降低。在2～5℃条件下，在贮藏的前60天，花粉生活力下降降显著，以后下降速度减低，经180天后还可保持约10％以下的萌发率，贮藏时间365天后，所有品种的花粉生活力全部丧失。然而在液氮罐(-196℃)中贮藏花粉的生活力保持更好，贮藏180天的花粉，萌发率仅比新鲜花粉降低约20％左右，365天后仍具有较高的萌发率，相当于新鲜花粉的70％左右(见表2)。表2超低温(-196℃)贮藏的花粉生活力<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="720">品种威优35威优642.6窄早余赤236-8农虎6号IR26项目(贮藏时间)萌发率(％)相对的百分数萌发率(％)相对的百分数萌发率(％)相对的百分数萌发率相对的百分数萌发率相对的百分数萌发率相对的百分数新鲜花粉(28-30℃)38.6410040.9410041.0010041.4210041.8610032.95100液氮内(180天)29.7577.3534.4184.0435.5286.6333.2080.1562.6077.8728.3085.88液氮内(365天)26.5569.0328.6670.0029.7072.4327.7466.9729.3270.0424.2073.44</table></tables>温度对花粉生活力的影响，主要是高温会使花粉的酶活性迅速降低，而低温有利于酶活性特别是有利于细胞色素氧化酶活性的保持。贮藏的花粉必须是干燥的，才能保持较长时间的生活力，而且授粉时萌发率较高，育性好。因此采集的花粉，在25℃左右温度、相对湿度60％的大气中晾干2～3小时，或经过Cacl2和硅胶脱水干燥，使花粉含水量降低才能贮藏，短期贮藏的花粉，湿度控制在30～35％，而长期贮藏的花粉，湿度应控制在25～30％。贮藏的花粉，从采集下来就应立即置于黑暗条件下，贮藏的全过程不能见光，绝对避光，一直至花粉使用时为止；黑暗贮藏花粉也是提高贮藏花粉生活力的重要条件，因为水稻花粉对光辐射比较敏感，即使微弱的光辐射对花粉的生活力也有破坏作用，主要表现在抑制花粉的萌发和花粉管的伸长。贮藏花粉时，使用1～5ppm放线菌素O(Actinomycin0)可以降低花粉呼吸强度，以延长花粉寿命，这是因为放线菌素0是mRNA转录抑制剂，而花粉萌发需要新转录的mRNA，因此花粉贮藏使用低浓度的放线菌素0是延长花粉寿命的措施之一。贮藏花粉层的厚度控制在5mm以下是为了防止花粉层过厚引起的花粉“自热”现象，造成局部温度高而影响花粉寿命。对于超低温(-196℃)液氮罐中长期贮藏的花粉，为了防止快速降温的冷冲击，应进行预冷处理，即先在0℃温度中预冷1～2小时，再进入-80℃温度条件下3～4小时，最后移入液态罐中贮藏，同时为了防止低超温贮藏引起的冻害，可使用2～5％DMSO4或5％葡萄糖+2～5％DMSO4作防冻剂。花粉育性的检测是花粉贮藏技术中不可缺少的部分，以前曾报导过一种水稻花粉萌发培养基，但花粉在该培养基上的萌发率仅5％左右，而柱头上的花粉萌发率高达60～70％，因此这种培养基不能用作花粉的育性检测。本发明提出的育性检测培养基，其花粉萌发率接近柱头上的花粉萌发率，因此可以用作花粉的育性检测。用IR26花粉在人工培养基上作萌发试验，同时在IR26柱头上进行授粉观察，结果表明，新鲜花粉和离开花粉5分钟内的花粉在人工培养基上的萌发率分别为40.61％和31.52％与柱头上的萌发率50.60％比较接近。贮藏花粉的目的是为了提高杂交水稻育种和制种的结实率。研究表明，水稻花粉贮藏2个月以上的还有较高的萌发率，一年内仍能保持一定的萌发水平。然而真正反映花粉育性是授粉试验，87～88年的贮藏花粉育性试验表明，经贮藏2个月的花粉，除籼×粳交的结实率稍低(6.25％)外，都在10％以上，说明贮藏花粉保持了较好的育性，达到了与新鲜花粉授粉的结实率水平(见表3)。表3贮藏花粉(60天)的育性鉴定(1987年长沙)结实率(％)常菲22A×79—85(籼)11.5常菲22A×混合花粉(品种)14.0常菲22A×岳农2号(粳)6.25常菲22A×混合花粉(新鲜花粉)12.08(C.K)四个品种的花粉在2～5℃低温贮藏7天后进行田间授粉试验，结实率平均为9.41％，其中同品种的花粉授粉率高达18.81％(见表4)。表4贮藏花粉的育性鉴定(1988)杂交组合的亲本不同，授粉的结实率有一定差异，一般同品种杂交比异品种杂交的结实率要高。88年8月在杂交水稻制种田进行的贮藏花粉育性实验，结果如下(见表5)，表5贮藏(贮藏七天)花粉的育性鉴定以龙阳A为母本，授以不同恢复系的贮藏花粉，结实率平均达到9.81％。特别要提出的是，当时正值湖南罕见的秋汛，一般的制种田的自然异交率接近于零，几乎失收，而利用贮藏花粉授粉可获得较高的结实率，证明本发明的贮藏方法是可靠的，同时也说明贮藏花粉不仅可用于杂交育种，也可用于制种，提高制种产量。小麦开花时气温较低，因此花粉贮存时，可以不加呼吸抑制剂；同时由于花粉采集时，田间相对湿度在70～80％，因此进入贮藏时，花粉含水量可以稍高些，但贮藏后应继续脱水，使含水量保持在30％以下。经低温条件下(0—7℃)贮藏的小麦花粉的结实率(见表6)。表6小麦贮藏花粉的结实率小麦花粉对H3BO3不敏感，因此小麦贮藏花粉的育性检测中采用的人工萌发培养基不必加H3BO3。在0～5℃温度条件下贮藏的油菜花粉，贮藏16天后，花粉萌发率仍可达53.2％(见表7)。表7油菜花粉的贮藏时间与萌发率油菜在花瓣全展时，花粉的成熟度高，此时采集的油菜花粉活力强，萌发率高。玉米花粉在液态罐中(-196℃)贮藏15—18天，花粉的萌发率在55～65％。农作物花粉的贮藏方法可以应用于各种作物的花粉贮藏，因此对提高农作物的杂交育种制种结实率开辟了新的途径，并为农作物花粉库的建立打下了坚实的基础。权利要求1.一种与杂交制种技术配套的农作物花粉贮藏方法，其特征在于将采集的花粉置于下列条件下贮藏(1)花粉短期贮藏的贮藏温度为0—5℃，长期贮藏时，贮藏温度为-196℃，(2)、湿度控制，花粉短期贮藏时，湿度为30—35％，长期贮藏的湿度为25～30％。(3)、避光贮藏，离开花药的花粉必须立即置于绝对黑暗中避光贮藏直至使用。(4)、贮藏时使用1—5ppm的放线菌素(Actinomycin)0用作花粉呼吸抑制剂，(5)、贮藏时花粉层厚度控制在5mm以下。2.按权利要求1所述的农作物花粉贮藏方法，其特征在于超低温度中长期贮藏的花粉在贮藏前需预冷处理，即先将花粉置于0℃温度条件下1—2小时，再置于-80℃条件下3—4小时，最后再进入超低温贮藏。3.按权利要求1、2所述的农作物花粉贮藏方法，其特征在于超低温长期贮藏时，用2—5％DMSO4(二甲基亚矾)或5％的葡萄糖+2—5％DMSO4作防冻剂。4.一种专门用于贮藏花粉育性检测的方法，其特征在于采用的人工萌发培养配方为淀粉0.05g/ml蔗糖40～50％MnSO48～10-5琼脂0.5～1.0％H3Bo350～100ppmPH56～6.0全文摘要农作物花粉的贮藏方法涉及作物的栽培方法，尤其是作物的杂交育种、制种方法。本发明提出的花粉贮藏技术是将采集的花粉置于低温和超低温度中黑暗条件下贮藏，并控制贮藏湿度在25～35％，贮藏时使用花粉呼吸抑制剂放线菌素0，并控制好贮藏花粉厚度在5mm以下，在超低温中长期贮藏的花粉在贮藏前应进行预冷处理，贮藏时使用DMSO文档编号A01H1/02GK1118650SQ9411116公开日1996年3月20日申请日期1994年9月15日优先权日1994年9月15日发明者周广洽,李训贞,谭周镃,陈良碧申请人:湖南师范大学