专利名称：马铃薯淀粉分支酶Ⅱ的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型马铃薯淀粉分支酶。更具体地说，本发明涉及马铃薯的第二种淀粉分支酶(SBE II)的氨基酸序列和它的片段以及它们相应的DNA序列。并且，本发明涉及含有这种DNA序列的载体、产生转基因马铃薯的方法和所说的马铃薯在产生淀粉方面的用途。
淀粉是一种不同分子形式的复杂混合物，所说的分子在葡萄糖链的聚合和分支程度上不同。淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，其中直链淀粉由本质上线型的α-1，4-葡聚糖组成，支链淀粉由彼此通过α-1，6-键连接的α-1，4-葡聚糖组成，这样，形成了分支的多葡聚糖。因此，淀粉不是均一的原材料。
淀粉是通过至少三种酶促反应合成的，其中涉及到ADP葡萄糖磷酸化酶(EC 2.7.7.27)、淀粉合成酶(EC 2.4.1.21)和淀粉分支酶(EC 2.4.1.18)。淀粉分支酶(SBE，也称为Q-酶)具有两种不同的酶促活性。它催化α-1，4-糖苷键的水解以及在淀粉的分支成分合成期间形成α-1，6-糖苷键，即支链淀粉。
植物淀粉是一种有价值的可再生原材料的来源，例如用于化学工业(Visser和Jacobsen，1993)。然而，淀粉的质量必须满足加工工业的要求，其中，结构的均一性是一项重要的指标。为了便于在工业上应用，要求植物分别只含有直链淀粉和支链淀粉。
已经提出了改变淀粉中直链淀粉/支链淀粉比例的方法。例如，WO95/04826中描述了编码脱支酶的DNA序列，此酶能够减少或者增加转基因植物(如马铃薯)中的支链淀粉的分支程度。
在WO92/14827中描述了包含DNA序列的质粒，所说的DNA序列在插入到植物的基因组中后，能够使再生的植株的碳水化合物浓度和碳水化合物的组成发生变化。这些变化是由于位于这些质粒中的分支酶序列引起的。这种分支酶可用来改变植物(特别是商业上使用的植物)中淀粉的直链淀粉/支链淀粉的比例。
WO92/14827中描述了迄今为止马铃薯中唯一已知的淀粉分支酶，在本领域中还不知道其它的淀粉分支酶是否与马铃薯分支淀粉的合成有关。
在分子基因遗传学(1991)225289-296(Visser等)中描述了通过反义构建体来抑制与颗粒结合的淀粉合成酶基因的表达。在马铃薯块茎淀粉中此酶的抑制作用可达100％，因此可以提供不含直链淀粉的淀粉。
然而，现有的抑制支链淀粉的方法还不成功，因此还非常需要抑制支链淀粉的替代性方法(Mülller-Rber和Koβmann，1994；Martin和Smith，1995)。
本发明的目的在于改变马铃薯淀粉中的支链淀粉的分支程度和支链淀粉/直链淀粉的比例。
按照本发明，其目的是通过提供一种新型的编码第二种淀粉分支酶(SBE II)的分离的DNA序列和它的片段来达到的，将所说的DNA序列插入到植物的基因组后，可以使再生植株的淀粉分支程度和比例发生变化。
SBE II的氨基酸序列和它的片段也包括在本发明的范围内。
另外，由于遗传密码的简并性而产生的上述DNA序列的变体也包括在本发明的范围内。
所说的编码SBEII的新型DNA序列(包含3074个核苷酸)以及相应的氨基酸序列(包含878个氨基酸)如SEQ ID No.1所示。一段上述DNA序列的1393个核苷酸长的片段(相当于SEQ ID No.1 DNA序列的核苷酸1007至2399)以及相应的氨基酸序列(包含464个氨基酸)如SEQ ID No.2所示。
此外，本发明提供了包含所说的分离的DNA序列和在马铃薯中有活性的调节元件的载体。可以将所说的DNA序列以相对于正好在此DNA序列上游的启动子有意义或反义(相反)方向插入到此载体中。
此外，本发明也提供了产生转基因马铃薯的方法，所说的马铃薯支链淀粉的分支程度降低，这种方法包括下列步骤a)将按照权利要求的载体转移并掺加到马铃薯细胞的基因组中；和b)由转化细胞再生完整的植株。
最后，本发明提供了所说的转基因马铃薯在产生淀粉方面的用途。
结合实验部分和附图来更详细地描述本发明，其中
图1为由正常马铃薯(A道)和转基因马铃薯(B道)淀粉提取的蛋白质的SDS聚丙烯酰胺电泳。箭头表明切除的蛋白质带。M道分子量标记蛋白质(kDa)。
图2为来源于马铃薯块茎淀粉消化的蛋白质的4种肽序列。
实验部分从马铃薯块茎分离淀粉田间种植马铃薯(Solanum tuberosum)。4℃下，将栽培种EarlyPuritan或实质上缺乏与颗粒结合的淀粉合酶I(Svalf Weibull AB，国际申请PCT/SE91/00892)的转基因马铃薯系的去皮块茎在水果榨汁器中匀浆。向含有大部分淀粉的“汁液组分”中，立即加入Tris-HCl(pH 7.5)、连二亚硫酸钠和乙二胺四乙酸(EDTA)，其终浓度分别为50mM、30mM和10mM。使淀粉颗粒沉降30分钟，然后用10倍于柱床体积的洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM EDTA)洗涤4次。最后用3倍于柱床体积的丙酮将淀粉(即每次洗涤之间在+4℃下静止30分钟沉淀下来的淀粉)洗涤3次，过夜空气干燥，并贮存在-20℃。从块茎淀粉中提取蛋白质85℃下，通过移液管吸打将贮存的淀粉(20g)与200毫升提取缓冲液((50mM Tris-HCl，pH 7.5，2％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，5mM EDTA)充分混合，直到淀粉成为胶状。然后将样品在-70℃下冷冻1小时。50℃下解冻后，10℃下将样品以12,000xg离心20分钟。收集上清液，以3,000xg再离心15分钟。将最后的上清液通过0.45μ的滤膜过滤，并加入2.25倍体积冰冷的丙酮。4℃下温育30分钟后，通过离心(4℃下，以3,000xg离心30分钟)收集蛋白质沉淀，然后溶解在50mM Tris-HCl，pH7.5中。按照Laemmli(1970)通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每种制剂的等份样品(
图1)。通过三氯乙酸(10％)沉淀来浓缩余下制剂中的蛋白质，然后在8％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离这些蛋白质(Laemmli，(1970))。用考马斯亮蓝R-250(在20％甲醇、0.5％乙酸和79.5％ H2O中含有0.2％)将凝胶中的蛋白质染色。肽在凝胶上的消化和测序切下
图1中箭头表明的染色的带(相当于表观分子量大约为100kDa)，并于35℃下，在0.2M NH4HCO3的50％乙腈溶液中在不断搅拌下洗涤20分钟，洗涤两次。每次洗涤后，除去液体，使凝胶块在通风橱中通过蒸发干燥。然后将完全干燥的凝胶块分开放置在石蜡膜上，并加入2μl 0.2MNH4CO3和0.02％ Tween-20。使凝胶块吸收改良的胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)(2μl中含有0.25μg)，之后加入0.2M NH4CO3，每次5μl，直到凝胶块恢复到原来的大小。然后将凝胶块分成3块，并转移到Eppendorf管中。加入0.2M NH4CO3(200μl)，37℃下将凝胶块中所含的蛋白质过夜消化(Rosenfeld等，1992)。完全消化后，加入三氟乙酸至终浓度为1％，倒出上清液并保存。在37℃下，将所说的凝胶块用60％乙腈、0.1％三氟乙酸(200μl)在连续震荡的情况下再提取两次，每次20分钟。将这两次的上清液与第一次的上清液合并。最后用60％乙腈、0.1％三氟乙酸、0.02％ Tween-20(200μl)洗涤凝胶块。此外，将这些上清液与其它的上清液合并，蒸发使体积减少到50μl。将提取的肽在用μRPC C2/C18SC2.1/10柱装备的SMART色谱系统(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上分离。用梯度为0-60％的乙腈水溶液/0.1％三氟乙酸以100μl/分钟的流速洗涤肽60分钟。根据厂商的说明在应用生物系统470A气相测序仪(带有联机PTH-氨基酸分析器(120A))或者在476A类型(应用生物系统，Foster城，CA，美国)上对此肽进行测序。
四个测序的肽很容易给出可翻译的序列(图2)。数据库检索表明这四种肽与淀粉分支酶具有相似性，更有趣的是与马铃薯的淀粉分支酶相比，这些肽与其它植物的淀粉分支酶更相关。编码肽1和2的寡核苷酸的构建如上所述，分别合成编码肽1和2的简并寡核苷酸作为正向和反向引物寡核苷酸15′-gtaaaacgacggccagt-TTYGGNGTNTGGGARATHTT-3′(肽1的残基2-8)寡核苷酸25′-aattaaccctcactaaaggg-CKRTCRAAYTCYTGIARNCC-3′t(肽2的残基2-8，反义链)其中H是A，C或T，I是肌苷；K是G或T；N是A，C，G或T；R是A或G；Y是C或T；小写形式的碱基以尾序列加入。马铃薯块茎中mRNA的纯化、cDNA的合成和对应于马铃薯淀粉分支酶II的cDNA片段的PCR扩增如上所述(Logemann等，1987)从成熟马铃薯块茎(S.tuberosum cv.Amanda)中分离总RNA。使用2μg的总RNA和作为下游引物的60pmol寡-dT30合成第一条cDNA。所说的引物在60℃下与mRNA的polyA退火5分钟。使用RiboclonecDNA合成系统M-MLV(H-)(Promega)按照制造厂商的技术手册完成cDNA的延伸。
使用根据肽1和2(参见上文)设计的两种简并引物在下列条件下于Perlin-Elmer GeneAmp9600 PCR热循环仪(Perkin-Elmer Cetus仪器，CT，美国)上扩增编码本发明的新型淀粉分支酶II的cDNA1mM dNTP，每种引物1μM，1份上文描述的cDNA，总反应体为20μl，其中含有1×AmpliTaq缓冲液和0,8U的AmpliTaq(Perkin-Elmer Cetus)。循环条件为96℃，1分钟；当加入酶时以80℃作为热起始(大约15分钟)，非故意降低到25℃；5个循环94℃，20秒；45℃，1分钟；然后是72℃，1分钟和72℃，2分钟；30个循环94℃，5分钟；45℃，30秒；72℃，(每个循环2秒+2分钟)并在冷却到4℃之前以72℃，10分钟结束反应。
使用下列循环条件重新扩增所说的反应样品(0.1μl)96℃，1分钟；当加入酶时以80℃作为热起始(大约5分钟)；5个循环94℃，20秒；45℃，1分钟；然后是72℃，2分钟；25个循环94℃，5秒；45℃，30秒；72℃(每个循环2分钟+2秒)并在冷却到4℃之前以72℃，10分钟结束反应。PCR扩增完成后，将反应物加入到1.5％Seakem琼脂糖凝胶(FMC生物产品，Rockland，ME，USA)上。电泳并用溴化乙锭染色后，切下表观大小为1500bp的主带，然后在水(200μl)中震荡洗脱此片段1小时。使用相当于所说的尾序列(在寡核苷酸1和2中)的引物重新扩增此片段、如上所述通过琼脂糖凝胶电泳纯化、使用Qiaex凝胶提取试剂盒按照厂商的说明(DIAGEN GmbH，Hilden，德国)从凝胶中提取此片段，之后，在测序反应中将此片段作为模板。使用DyeDeoxy终止子循环测序试剂盒(Perkin-Elmer Cetus仪器)和尾序列及内部引物完成所说的测序反应。在应用生物系统373A DNA测序仪上按照厂商的方案分析此测序反应。编辑此序列，其包含1393bp。
为了确定淀粉分支酶II的序列，由如上所述的总RNA，使用1393bp序列的特异引物，通过cDNA末端快速扩增方法(RACE)扩增所说的全长cDNA的5’和3’端。在3’端扩增过程中，使用对应于多聚A尾的寡T29G引物，在5’端扩增过程中，使用Boehringer Mannheim的5’/3’RACE试剂盒(产品号1734792)。以上述同样的方法使用内部和末端引物对扩增的片段进行测序。将两个末端的序列一起与1393bp序列比较，得到组成型全长cDNA序列。由此序列设计引物，以便扩增第一部分的整个编码区。扩增的编码cDNA的部分测序确认了相当于组成型序列的cDNA的存在。全长cDNA是3074bp，翻译的序列包含878个氨基酸。成熟蛋白质包含830个氨基酸。
比较EMBL与GenBank数据库的共有序列表明所说的序列与马铃薯淀粉分支酶I具有68％的等同性，与其它植物种的淀粉分支酶II具有80％的等同性。因此，本发明提供了由新的分支酶序列编码的酶(马铃薯淀粉分支酶II)。马铃薯植株的转化将分离的全长马铃薯淀粉分支酶II的cDNA和其它大小为50-3074bp范围内的功能活性片段以反向克隆到在马铃薯块茎中有活性的启动子的后面。术语“功能活性”的意思是指能够影响马铃薯块茎中直链淀粉/支链淀粉比例的片段。按照本发明的SBE II的DNA和氨基酸序列以及所说的DNA的一个片段和相应的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和2所示。
例如可以从patatin启动子、与马铃薯颗粒结合的淀粉合酶I基因的启动子或者由马铃薯淀粉分支酶I和II基因中分离的启动子中选择所使用的启动子。
将所说的构建体通过本领域公知的技术克隆到适合于根癌土壤杆菌介导的马铃薯转化的双元Ti-质粒载体，或者克隆到适合于使用基因枪技术或电激进行直接转化的载体中。有意义(参见下文)和反义构建体必须包含所有的必需调节元件。
转基因马铃薯植物可以在块茎中特异性地转录反向淀粉分支酶II构建体，导致此酶的反义抑制。因此，在马铃薯块茎中支链淀粉的分支模式减少并发生变化，同时淀粉中的直链淀粉/支链淀粉比例发生变化。
马铃薯淀粉分支酶II的反义构建体也可以与马铃薯淀粉分支酶I、与马铃薯颗粒结合的淀粉合酶II、马铃薯可溶性淀粉合成酶II和III、马铃薯淀粉歧化酶(D-酶)、或者马铃薯淀粉脱支酶的反义构建体结合使用，来转化马铃薯以改变支链淀粉的分支程度和直链淀粉/支链淀粉的比例。这样可以为淀粉加工业提供新的有价值的原料。
将不同构建体中的编码此酶的全长cDNA序列以有意义方向克隆到一个或多个上述提到的启动子的后面，并将所说的构建体转移到上述合适的转化载体中，以便用于转化马铃薯。再生的转化马铃薯植株将在块茎中产生过量淀粉分支酶II，导致支链淀粉的分支程度增加和分支模式发生变化，或者由于共抑制作用抑制了内源淀粉分支酶II的转录物的转录，结果使支链淀粉的分支降低。参考文献1.Müller-Rber，B.，Koβmann，J.，(1994)影响转基因植物中淀粉数量和淀粉质量的方法。植物细胞环境学17，601-613。
2.Martin，C.，Smith，A.(1995)淀粉的生物合成。植物细胞7，971-985。
3.Laemmli，U.K.(1979)噬菌体T4头部装配过程中结构蛋白质的切割。自然227，680-685。
4.Logemann，J.，Schell，J.和Willmitzer，L.(1987)从植物组织中分离RNA的改进的方法。分析化学163，16-20。
5.Rosenfeld，J.，Capdeville，J，Guillemot，J.C.，Ferrara，P.(1992)在单向或双向凝胶电泳后为了进行内部序列分析在凝胶上进行蛋白质消化。分析化学203，173-179。
6.Visser，R.G.F.，Jacobsen，E.(1993)改良植物以改变淀粉的含量和组成。TibTech 11，63-68。SEQ ID No.1测序的分子cDNA名称solanum tuberosum(马铃薯)的beII基因(分支酶II)序列长度3074bpAAACCTCCTC CACTCAGTCT TTGTTTCTCT CTCTCTTCAC GCTTCTCTTG GCGCCTTGAA 60CTCAGCAATT TGACACTCAG TTAGTTACAC TNCCATCACT TATCAGATCT CTATTTTTTC 120TCTTAATTCC AACCAAGGAA TGAATAAAAA GATAGATTTG TAAAAACCCT AAGGAGAGAA 180GAAGAAAG ATG GTG TAT ACA CTC TCT GGA GTT CGT TTT CCT ACT GTT CCA 230Met Val Tyr Thr Leu Ser Gly Val Arg Phe Pro Thr Val Pro-45 -40 -35TCA GTG TAC AAA TCT AAT GGA TTC AGC AGT AAT GGT GAT CGG AGG AAT 278Ser Val Tyr Lys Ser Asn Gly Phe Ser Ser Asn Gly Asp Arg Arg Asn-30 -25 -20GCT AAT NTT TCT GTA TTC TTG AAA AAG CAC TCT CTT TCA CGG AAG ATC 326Ala Asn Xaa Ser Val Phe Leu Lys Lys His Ser Leu Ser Arg Lys Ile-15 -10 -5TTG GCT GAA AAG TCT TCT TAC AAT TCC GAA TCC CGA CCT TCT ACA GTT 374Leu Ala Glu Lys Ser Ser Tyr Asn Ser Glu Ser Arg Pro Ser Thr Val1 5 10GCA GCA TCG GGG AAA GTC CTT GTG CCT GGA ACC CAG AGT GAT AGC TCC422Ala Ala Ser Gly Lys Val Leu Val Pro Gly Thr 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Tyr Tyr Asp Pro Pro Glu Glu Glu Arg Tyr Ile Phe Gln His50 55 60CCA CGG CCA AAG AAA CCA AAG TCG CTG AGA ATA TAT GAA TCT CAT ATT 241Pro Arg Pro Lys Lys Pro Lys Ser Leu Arg Ile Tyr Glu Ser His Ile65 70 75 80GGA ATG AGT AGT CCG GAG CCT AAA ATT AAC TCA TAC GTG AAT TTT AGA 289Gly Met Ser Ser Pro Glu Pro Lys Ile Asn Ser Tyr Val Asn Phe Arg85 90 95GAT GAA GTT CTT CCT CGC ATA AAA AAG CTT GGG TAC AAT GCG GTG CAA 337Asp Glu Val Leu Pro Arg Ile Lys Lys Leu Gly Tyr Asn Ala Val Gln100 105 110ATT ATG GCT ATT CAA GAG CAT TCT TAT TAT GCT AGT TTT GGT TAT CAT 385Ile Met Ala Ile Gln Glu His Ser Tyr Tyr Ala Ser Phe Gly Tyr His115 120 125GTC ACA AAT TTT TTN GCA CCA AGC AGC CGT TTT GGA ACN CCC GAC GAC 433Val Thr Asn Phe Xaa Ala Pro Ser Ser Arg Phe Gly Thr Pro Asp Asp130 135 140CTT AAG TCT TTG ATT GAT AAA GCT CAT GAG CTA GGA ATT GTT GTT CTC 481Leu Lys Ser Leu Ile Asp Lys Ala His Glu Leu Gly Ile Val Val Leu145 150 155 160ATG GAC ATT GTT CAC AGC CAT GCA TCA AAT AAT ACT TTA GAT GGA CTG 529Net Asp Ile Val His Ser His Ala Ser Asn Asn Thr Leu Asp Gly Leu165 170 175AAC ATG TTT GAC GGC ACA GAT AGT TGT TAC TTT CAC TCT GGA GCT CGT 577Asn Met Phe Asp Gly Thr Asp Ser Cys Tyr Phe His Ser Gly Ala Arg180 185 190GGT TAT CAT TGG ATG TGG GAT TCC CGC CTC TTT AAC TAT GGA AAC TGG 625Gly Tyr His Trp Met Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr Gly Asn Trp195 200 205GAG GTA CTT AGG TAT CTT CTC TCA AAT GCG AGA TGG TGG TTG GAT GAG 673Glu Val Leu Arg Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Arg Trp Trp Leu Asp Glu210 215 220TTC AAA TTT GAT GGA TTT AGA TTT GAT GGT GTG ACA TCA ATG ATG TAT 721Phe Lys Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met Met Tyr225 230 235 240ACT CAC CAC GGA TTA TCG GTG GGA TTC ACT GGG AAC TAC GAG GAA TAC 769Thr His His Gly Leu Ser Val Gly Phe Thr Gly Asn Tyr Glu Glu Tyr245 250 255TTT GGA CTC GCA ACT GAT GTG GAT GCT GTT GTG TAT CTG ATG CTG GTC 812Phe Gly Leu Ala Thr Asp Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Met Leu Val260 265 270AAC GAT CTT ATT CAT GGG CTT TTC CCA GAT GCA ATT ACC ATT GGT GAA 865Asn Asp Leu Ile His Gly Leu Phe Pro Asp Ala Ile Thr Ile Gly Glu275 280 285GAT GTT AGC GGA ATG CCG ACA TTT TNT ATT CCC GTT CAA GAT GGG GGT 913Asp Val Ser Gly Met Pro Thr Phe Xaa Ile Pro Val Gln Asp Gly Gly290 295 300GTT GGC TTT GAC TAT CGG CTG CAT ATG GCA ATT GCT GAT AAA TGG ATT 961Val Gly Phe Asp Tyr Arg Leu His Met Ala Ile Ala Asp Lys Trp Ile305 310 315 320GAG TTG CTC AAG AAA CGG GAT GAG GAT TGG AGA GTG GGT GAT ATT GTT1019Glu Leu Leu Lys Lys Arg Asp Glu Asp Trp Arg Val Gly Asp Ile Val325 330 335CAT ACA CTG ACA AAT AGA AGA TGG TCG GAA AAG TGT GTT TCA TAC GCT1057His Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp Ser Glu Lys Cys Val Ser Tyr Ala340 345 350GAA AGT CAT GAT CAA GCT CTA GTC GGT GAT AAA ACT ATA GCA TTC TGG1105Glu Ser His Asp Gln Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Ile Ala Phe Trp355 360 365CTG ATG GAC AAG GAT ATG TAT GAT TTT ATG GCT CTG GAT AGA CCN TCA1153Leu Met Asp Lys Asp Met Tyr Asp Phe Met Ala Leu Asp Arg Pro Ser370 375 380ACA TCA TTA ATA GAT CGT GGG ATA GCA TTG CAC AAG ATG ATT AGG CTT1201Thr Ser Leu Ile Asp Arg Gly Ile Ala Leu His Lys Met Ile Arg Leu385 390 395 400GTA ACT ATG GGA TTA GGA GGA GAA GGG TAC CTA AAT TTC ATG GGA AAT1249Val Thr Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Met Gly Asn405 410 415GAA TTC GGC CAC CCT GAG TGG ATT GAT TTC CCT AGG GCT GAA CAA CAC1297Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Ile Asp Phe Pro Arg Ala Glu Gln His420 425 430CTC TCT GAT GGC TCA GTA ATT CCC GGA AAC CAA TTC AGT TAT GAT AAA1345Leu Ser Asp Gly Ser Val Ile Pro Gly Asn Gln Phe Ser Tyr Asp Lys435 440 445TGC AGA CGG AGA TTT GAC CTG GGA GAT GCA GAA TAT TTA AGA TAC CGT1393Cys Arg Arg Arg Phe Asp Leu Gly Asp Ala Glu Tyr Leu Arg Tyr Arg450 455 460
权利要求
1.一种淀粉分支酶II(SBE II)的氨基酸序列，所说的氨基酸序列包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
2.淀粉分支酶II(SBE II)的氨基酸序列的片段。
3.按照权利要求2的片段，所说的片段具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
4.一种分离的编码马铃薯淀粉分支酶II(SBE II)的DNA序列，这种DNA序列包含SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和由于遗传密码的简并性而形成的它的变体。
5.一种分离的编码马铃薯淀粉分支酶II(SBEII)的DNA序列的片段。
6.按照权利要求5的片段，所说的片段包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
7.一种载体，这种载体包含权利要求4-6之任一项所要求的分离的DNA序列的全部或功能活性部分以及在马铃薯中有活性的调节元件。
8.按照权利要求7的载体，其中所说的DNA序列与正好位于其上游的启动子呈相反(反义)方向。
9.一种产生转基因马铃薯的方法，所说的马铃薯的支链淀粉的分支程度增加或减少，其特征在于该方法包括下列步骤a)将按照权利要求7的载体转移并掺加到马铃薯细胞的基因组中；和b)由转化细胞再生完整的植株。
10.一种产生转基因马铃薯的方法，所说的马铃薯的支链淀粉的分支程度降低，其特征在于该方法包括下列步骤a)将按照权利要求8的载体转移并掺加到马铃薯细胞的基因组中；和b)由转化细胞再生完整的植株。
11.按照权利要求10的方法，其中所说的载体也包含淀粉分支酶I(SBE I)的反义构建体。
12.按照权利要求10或者11的方法，其中所说的载体也包含马铃薯颗粒结合淀粉合成酶II的反义构建体。
13.按照权利要求10-12的一个或多个的方法，其中所说的载体也包含马铃薯可溶性淀粉合成酶II和III的反义构建体。
14.按照权利要求10-13一个或多个的方法，其中所说的载体也包含马铃薯淀粉歧化酶(D-酶)的反义构建体。
15.按照权利要求10-14的一个或多个的方法，其中所说的载体也包含马铃薯淀粉脱支酶的反义构建体。
16.一种转基因马铃薯，这种马铃薯是通过权利要求9-15任一之方法获得的。
17.按照权利要求16的转基因马铃薯在产生淀粉方面的用途。
全文摘要
本发明涉及马铃薯第二种淀粉分支酶的氨基酸序列(SBEⅡ)和它的片段以及相应的分离的DNA序列。并且,本发明涉及含有这种分离的DNA序列的载体、产生转基因马铃薯的方法和所说的马铃薯在产生淀粉方面的用途。所获得淀粉的支链淀粉的分支模式发生变化,并且直链淀粉/支链淀粉的比例发生变化。
文档编号A01H5/00GK1207125SQ9619951
公开日1999年2月3日 申请日期1996年11月28日 优先权日1995年11月29日
发明者B·爱克, J·科斯努迪, C－T·拉森, H·拉森, L·拉斯克 申请人:阿迈罗基因公司