用于制备干的、贮存稳定的血小板的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于制备干的、贮存稳定的血小板的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及保存血小板的方法。还提供了其使用的方法和由其得到的组合物。还提供了用于保存、贮存和重新悬浮血小板的包装袋。
背景技术：
血小板是参与维持止血的复杂成分的一种。当血管壁受损时，血小板附着到由胶原蛋白、微丝和基膜组成的暴露的表面上。附着的血小板促进了其它血小板的聚集形成一种叫做止血血小板栓子(hemostaticplatelet plug)的聚集体。其结果是激活了提供稳定血小板栓子和减少流血的网络的凝固蛋白质，使组织修复得以开始。
血小板被输入病人体内用于许多临床适应症。例如，血小板输入被用于纠正由创伤、疾病或药物引起的功能失常所引起的循环血小板的缺陷或功能失常。那些经受特发性血小板减少症和进行烧蚀化疗的病人进行血小板输入处理。用于多种恶性肿瘤的烧蚀化疗使用的日益增多已经导致对替代血小板疗法的需求不断增加。
使用分离的血小板中的主要困难是它们的贮藏寿命短。血小板仅仅被食品与药品管理局(FDA)批准以液体状态在室温下贮存至多五天，在这期间其功能性质很快被破坏。这在民用和军事医学中引起许多后勤上的问题。
以液体状态贮存血小板的另一缺点包括需要相当大的贮存空间，并需要在特别制作的可透气塑料的包装袋内保证持续的摇动。一般地，血小板贮存在体积为45至65毫升的悬浮血浆中。最近，有研究报告液体贮存的最小血浆体积为30至50毫升。Home等(1994)，输血(Transfusion)，3439；和Ali等(1994)，输血，3444。但是这种贮存方法仍然需要相当大的空间，而且贮藏寿命不超过大约五天。液体贮存的主要问题是血小板需要贮存在20℃以上，因为在贮存过程中即使短时间暴露到低温下也会导致其体内和体外性质显著改变。Moroff G.等(1994)，输血，34317。因为这种贮存通常还需要在大约20至24℃贮存时在葡萄糖存在下时常摇动血小板，这就为细菌生长提供了最适条件，这是液体血小板贮存的主要问题。
为了减小细菌生长的问题，已建议在4℃冷藏贮存或在-80℃冷冻贮存。但是，这需要防止所贮存的血小板冷激活的方法，并且已建议使用抗冻糖蛋白用于保存血小板。Tablin等(1996)，输血医学中的冷冻血小板和血小板替代物，Uniformed Services University of the HealthSciences(Bethesda会议)。但是这种方法需要在治疗应用前彻底洗涤血小板，去除抗冻蛋白质。这个缺点还存在于冷冻血小板的方法中，该方法使用DMSO，在治疗应用前也需要彻底洗涤血小板。Bock等(1995)，输血，53921。通过冷冻干燥贮存血小板的方法已有描述。Bateson等(1994)，输血医学，4213，EPA 0356257。在冷冻干燥过程中血小板被激活，并只能用作血液学标准，而且所保存的血小板的动电性质与相应的新鲜血小板的性质不同。Oliver等，Bethesda会议。关于冷冻干燥血小板的其它努力已得到接近最适的结果。Bode(1993a和b)，第一和第二个三年报告，(分别地)用于输血的血小板干燥贮存的评价生理学完整性与止血功能性。DNR基金No.N00014-92-J-1244。在冷冻干燥前固定血小板可提高其功能，但这些冷冻干燥的血小板需要被冷冻贮存在-80℃。Read等(1995)，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)，92397。
在Bethesda会议上，提出了下列关于血小板的想法。防止出血长达24小时；24小时后20％输入的血小板进入循环；在冷冻箱或冷藏箱外长期贮存；重量轻、耐久并容易运输；使用方便不需离心；非免疫原性；无菌；并且三个月后能够检查供血者。会议同时强调，缺乏评价大多数正在研制的人血小板制品的体内模型及其体内评价的数据。一个例外是Blajchman的网状内皮系统阻断型血小板减少症兔模型(RES-阻断模型)，该模型使得能够在动物模型中评价人血小板的效能。Ali等(1994)，输血，3444，Blajchman等(1994)，英国血液学杂志(Brit.J.Haematol.)，86347。
血小板产品也已被提议用作血小板替代物和独立治疗剂。这些产品也比完整的血小板具有更长的贮藏寿命。已通过一些方法制备得到血小板膜泡，并且在兔模型中表现出减少流血时间。Chao等(1996)，输血，36536-542；及美国专利5,428,008和5,332,578。干燥、粉状的血小板膜也已被制备作为免疫吸附剂。EP 141939。
实现许多上面列举的目标十分有用。建立一种能够在环境温度下贮存血小板超过五天的方法特别有用。这些标准立即了淘汰了所有目前的液体和低温冷藏的血小板制品。长期贮存干血小板的方法将更具优越性，特别是解决了关于液体贮存时细菌生长的问题。干血小板的贮存与以液体或冷冻的固态血小板贮存相比需要较少的空间，因为其体积减小了，并且不需要在液体状态下连续的摇动，因此会大大节省贮存和运输费用会。这还使得世界上那些不具备足够的贮存和运输设备的地区也能够使用血小板。还可以建立HLA-匹配的干血小板库用于异源免疫病人的治疗中。
海藻糖，D-吡喃葡萄糖D-吡喃葡萄糖苷，是一个自然发生的非还原性二糖，最初发现它与某些植物和动物中脱水伤害的防止有关，它们可以没有伤害地脱水并当再水化时复活。已经显示海藻糖可用于蛋白质、病毒和食品在干燥和随后的贮存时防止变性。参考美国专利4,891,319；5,149,653；5,026,566；Blakeley等(1990)，柳叶刀(Lancet)，336854；Roser(1991年7月)，食品科技发展趋势(Trends in Food Sci.and Tech.)，第166-169页；Colaco等(1992)，国际生物技术(Biotechnol.Internat.)，第345-350页；Roser等(1991)，生物药学(BioPharm.)，447；Colaco等(1992)，生物技术(Bio/Tech.)，101007；及Roser等(1993年5月)，新科学家(New Scientist)，第25-28页。
在自然界中，海藻糖在各种逆境条件下稳定细胞膜。海藻糖与酵母细胞在完全脱水时的生存能力相关。Eleutherio等(1993)，生物化学与生物物理学通报(Biochim Biophys Acta)，1156263。还已知海藻糖能够稳定冷冻干燥的蛋白质，例如甲醇脱氢酶(Argall和Smith(1993)，国际生物化学与分子生物学(Biochem Mol.Biol.Int.)，30491)，并且为来自酵母的酶提供热保护。Hottiger等(1994)，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)，219187。
海藻糖已被用于稳定冷冻干燥的肌质网和脂质体。Crowe，J.等(1983)，生物化学与生物物理学进展(Arch.Biochem.Biophys.)，220470-484；和Crowe，L.等(1984)，生物化学与生物物理学通报，769141-150。在这两个例子中，将海藻糖加入到膜或脂质体悬浮的溶液中，将混合物冷冻并冷冻干燥。发现海藻糖可以防止膜相转变。海藻糖已被建议用于血小板的冷藏；通过冷冻诱导的膜相转变对这些血小板的充填已被报导可防止在冷冻过程中的冷诱导的激活。Oliver等Bethesda会议。但是，这些血小板需要被冷冻贮存在-80℃，而且冷藏时DMSO的使用需要在治疗应用前彻底洗涤血小板。Oliver等和Crowe，L.等(1996)Bethesda会议。尽管多种碳水化合物已被建议用于冷冻干燥红细胞，人们发现海藻糖和蔗糖都不适合。EP356,257。
此处描述的方法提供了通过干燥保存血小板的方法和由此得到的组合物。干燥的血小板可以被不确定时期地贮存在环境温度下。在贮存过程中血小板的功能性质不变。
发明简述本发明提供了稳定血小板的方法。为贮存而稳定血小板的方法包括用有效数量的海藻糖充填血小板，并在有效数量的海藻糖存在下干燥所处理的血小板。本发明还包括含有干血小板的组合物(“QuadroCytesTM”)和从干燥制品中重构的血小板。
在本发明的另一方面，提供了根据本发明的干燥的血小板组合物。血小板在一不确定的时期内是贮存稳定的，在环境温度及高于环境温度下至少6周是稳定的，而且重构后，适合用于任何用到新鲜血小板的适应症上。
在本发明的另一方面，提供了重构的、干燥的血小板。重构的血小板适合用于任何用到新鲜血小板的适应症上。重构的、干燥的血小板适合的适应症包括但不限于，输血。
在本发明的另一方面，提供了递送治疗剂的方法。适当的治疗剂包括但不限于，具有止血、促进伤口愈合和抗结疤活性的生物活性剂。在本发明的另一方面，提供了递送这些药剂到达止血活性位点或网状内皮系统的方法。
在本发明的另一方面，提供了制备适合于血小板因子纯化的血小板的方法。此方法包括按上述处理血小板，以及干燥和回收血小板。回收的血小板再用于血小板因子的纯化。
在本发明的另一方面，提供了包装QuadroCytesTM的无菌包装袋。此包装袋适合于QuadroCytesTM的无菌干燥和贮存，并且特别适合于QuadroCytesTM的无菌再水化。此方法还允许立即输入重构的血小板而不需要转移到另外的容器中，因而减小了污染的危险。例如，通过从自封闭入口管注射再水化介质，并直接从包装袋输入含有干血小板的标准输血包提供了血小板的无菌来源。
附图简述


图1是一个柱状图，描绘静脉大量注射载体(vehicle)(中空柱)、血小板(中度灰色柱)或再水化的QuadroCytesTM(深灰色柱)后1小时和4小时后的血小板数。
图2是一个柱状图，描绘静脉注射血小板(中度灰色柱)或再水化的QuadroCytesTM(深灰色柱)后的百分回收率和短期血小板“存活率”。回收率定义为1小时后能够从血液中回收的血小板占全部注射的血小板的百分比。短期存活率定义为施用后经过另外3个小时的循环后血液中仍然存在的血小板占给药后1小时在血液中存在的所注射血小板的百分比。
图3是一个柱状图，描绘在静脉大量注射血小板(中度灰色柱)或再水化的QuadroCytesTM(深灰色柱)后1小时和4小时后由割耳引起流血后测定的流血时间。
图4是一个柱状图，描绘用血小板(中度灰色柱)或再水化的QuadroCytesTM(深灰色柱)处理的兔的流血时间。星号代表血液中血小板的数目和再水化的QuadroCytesTM的数目相当时的时间。
图5是一个柱状图，描绘静脉大量注射载体(白色柱)、血小板(中度灰色柱)或再水化的QuadroCytesTM(深灰色柱)后1小时和4小时后从割耳损失的血液的量。
实施本发明的最佳方式本发明包括保存血小板的方法。该方法包括在有效引入血小板一定数量的内部海藻糖的条件下处理分离的血小板，海藻糖的量在随后的操作过程中能够有效地保护血小板，以及在一定数量的能够在干燥时有效保护血小板的外部海藻糖存在下干燥血小板。这样得到的组合物命名为QuadroCytesTM。
该方法包括通过任何本领域已知的方法获得血小板悬浮液。一般地，血小板是通过将血液收集至适当的抗凝剂中，然后通过任何本领域已知的方法得到血小板富集血浆(PRP)获得的。通过离心从PRP获得血小板沉淀后，将血小板沉淀以一定数量并在导致海藻糖有效吸收到血小板中的条件下重新悬浮在生理学允许的溶液中。
将海藻糖通过任何本领域已知的方法引入血小板中。合适的方法包括但不限于，电透化(electropermeabilisation)、膜的相转变、渗透法如利用有机渗压剂和胞饮作用、瞬间裂解法如酸激和可逆交联，以及利用可透膜的、酯酶不稳定的海藻糖衍生物。电透化的有效方法如在实施例中和在Hughes和Crawford(1989)，生物化学与生物物理学通报，981277-287，及Hughes和Crawford(1990)，第634次会议，Bath，生物化学学会会议，871-873中所述。用于血小板充填海藻糖的膜相转变的有效方法在例如Oliver等Bethesda会议中被描述。胞饮作用的有效方法在例如Okada和Rechsteiner(1982)，细胞(Cell)，2933；和Rechsteiner(1987)，酶学方法(Methods in Enzymology)，14942中被描述。瞬时裂解的有效方法在例如Magnani等(1992)，美国国家科学院院报，896477；Ihler和Tsang(1987)，酶学方法149221；以及Dale(1987)，酶学方法，149229中被描述。
优选地，内部海藻糖的浓度约为10-125mM。更优选地，内部海藻糖的浓度约为30-100mM。甚至更优选地，内部海藻糖的浓度约为50-75mM。
然后将血小板重新悬浮在含有稳定剂的干燥缓冲液中。重新悬浮在干燥缓冲液中之前可以将血小板加以浓缩。任何合适的方法都可以用于浓缩血小板，包括但不限于差速离心。优选地，将处理后的血小板离心形成沉淀，并将沉淀重新悬浮在含有稳定剂的干燥缓冲液中。稳定剂可以是任何使干燥的血小板稳定的碳水化合物。优选地，稳定剂是海藻糖。其它合适的稳定剂包括但不限于，提高干燥制剂的玻璃转变温度的多羟基试剂，例如血清白蛋白、haemocell、酪蛋白水解物、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟乙基淀粉(HES)。优选地，稳定剂是非还原性碳水化合物。更优选地，稳定剂是海藻糖。优选地，重新悬浮/干燥缓冲液是含有至少1％海藻糖和1％血清白蛋白(SA)的缓冲的盐水。
优选地，在干燥缓冲液中海藻糖的浓度约为1至30％，血清白蛋白的浓度约为0.5％至5％。更优选地，海藻糖的浓度约为1至10％，SA的浓度约为1至2.5％。稳定剂的这个“外部”浓度是任何在干燥后提供有效保护的浓度。在重新悬浮过程中，外部稳定剂的浓度应该高于内部海藻糖的浓度以避免血小板裂解。海藻糖的内部浓度和稳定剂的外部浓度的有效组合可以根据这里提供的实施例经验性地加以确定。干燥缓冲液还可任选地含有抗凝剂如柠檬酸和高分子量的、形成玻璃的羟基聚合物如PVP和HES。
或者，如果在最终充填反应混合物中海藻糖的浓度高于1％，血小板可以不经浓缩和重新悬浮直接被干燥。优选地，海藻糖的浓度约为1至25％，而SA的浓度约为0.5％至5％。
然后血小板被干燥。用于干燥的合适体积依赖于所采用的干燥方法。例如，在真空干燥时，100微升至500微升等份是优选的。可以采用任何适用于干燥生物材料的方法，包括但不限于，真空、空气、喷雾和冷冻干燥。优选地，采用的方法是真空干燥。在一个示范性的真空干燥方案中，真空以逐步递减方式减小到最终真空度在30mTorr的范围内，维持样品的温度在20℃以上、38℃以下。2-12小时的初级干燥后，将架温(shelftemperature)每分钟升高0.2℃直到60℃，并且在60℃次级干燥3-6小时。任选地，干燥的血小板可加以末段(terminally)灭菌，例如90℃12-24小时。末段灭菌被描述于例如在英国血友病中心的研究组，通过浓缩物监视病毒传播的说明(1988)柳叶刀10月8日，第814-816页。
干燥血小板的容器可以是在本领域中使用的任何容器。标准的无菌输血包或静脉盐水或肠胃外的营养包特别适合用于QuadroCytesTM的干燥和贮存，因为它们允许进行无菌加工和再水化。输血包还允许直接输入重构的QuadroCytesTM而不需要转移到另一个容器中，因此减小了污染的危险。输血袋是特别适合的，因为它们允许通过入口进行无菌的重构。本发明因此包括含有QuadroCytesTM的这种包。
干血小板可以在环境温度下贮存较长的时间。干血小板在袋中37℃贮存至少6周内是稳定的，而在玻璃瓶中可达8个月。“环境”温度或条件是在给定的环境下在任一给定的时间的那些温度或条件。一般地，环境室温为22℃，环境大气压和环境湿度可方便地测定并且将根据每年的时间、天气条件、海拔等而改变。
干血小板可以通过重新悬浮在生理学允许的缓冲液中加以重构。为了治疗的应用，缓冲液是无菌的。缓冲液可以是任何具有适当pH的缓冲液。优选地，缓冲液含有一种或几种表现出高胶体渗透压的物质，包括但不限于，聚乙二醇(PEG)和羟乙基淀粉(HES)。优选地，缓冲液是1-5％的人血清白蛋白(HSA)盐水溶液。
本发明进一步包括含有通过这里描述的方法获得的血小板的组合物。组合物包括但不限于，干血小板；以及重构的干血小板。
组合物可以进一步含有任何药学上允许的载体或赋形体。例如，干血小板特别适合于递送治疗剂到达网状内皮系统和止血活性位点。干血小板还适合于掺入到局部使用的膏、霜如剃须膏、凝胶和药膏中。
适合局部使用的药学级的有机载体和/或稀释剂在本领域是众所周知的。干血小板特别适合于掺入到促进伤口愈合的局部施用处理中，特别是作为具有不结疤和清疮活性的生物活性物质的递送载体中。本发明进一步包括含有重构的血小板和载体的组合物，组合物包括但不限于，粉、膏、霜和凝胶。为了用于伤口愈合，干血小板可以通过掺入到聚合物中，包括合成聚合物或天然聚合物如胶原蛋白，而掺入到绷带中。
重构的血小板特别适合用于血小板替代治疗的输血中。因此，一个特别优选的组合物是重构的干血小板在适合用于静脉输血的缓冲液中的悬浮液。血小板浓度及载体的选择在本领域的技术人员知识范围内，并且取决于所治疗的适应症。
正如这里所显示的，重构的血小板保留了新鲜血小板的性质，如体内血小板更新、对流血时间的影响，和对血液损失的影响。另外，重构的血小板和新鲜的血小板的体外比较显示出多种性质具有很好的相关性。这些结果简要列于表1中。
表 1体外QuadroCytesTMGP1b存在 ++膜唾液酸 ++干燥/再水化后血小板数的回收率70-80％*对胶原蛋白的附着 ++前凝血剂(PF3)活性 +++聚集 +与小量正常血小板的聚集 ++与小量正常血小板的血块凝缩 ++*没有回收的血小板已经变成由小到大的片段和微粒。在所有的体外和体内实验中，这些血小板被通过离心去除了。
本发明进一步包括单独递送血小板或者作为治疗剂的递送载体递送血小板的方法。通过首先制备充填了至少一种根据这里描述的方法获得的治疗剂的血小板而递送治疗剂。通过任何本领域已知的方法充填生物活性剂到血小板中，方法是在用海藻糖充填血小板的同时或过程中充填。例如，通过电透化充填血小板已被Hughes和Crawford(1990)描述。血小板然后施用于个体。血小板或者在充填化合物后马上施用，或者在施用前被干燥并掺入到生理学允许的载体或在溶液中重构。干血小板特别适合于将治疗剂递送到网状内皮系统和止血活性位点。干血小板特别适合作为生物活性物质，例如那些在伤口愈合用途中具有不结疤和清疮活性的物质的递送载体。
治疗剂可以是用于预防的物质。这在本领域是众所周知的并包括多种药物。血小板还可以充填生物活性化合物。合适的生物活性化合物的例子包括但不限于，稳定剂、示踪物、荧光标记物和其它显像物质如放射标记物、抗冻剂、核酸以及生物活性材料。适合掺入到血小板中的生物活性材料包括但不限于，止血效应子、伤口愈合因子、细胞因子和药物。合适的生物活性材料还包括治疗和预防剂。生物活性材料的例子包括但不限于，蛋白质和肽(合成的、天然的或拟态的)、寡核苷酸、病毒载体、血液治疗剂、抗癌药物、抗炎药物、凝血调节剂、免疫调节剂等等。
本发明还提供了制备适合于纯化血小板因子的血小板的方法。按上述制备血小板，然后可从由此产生的血小板中分离到血小板因子。血小板因子的例子包括但不限于，PDGF、肿瘤坏死因子、血小板球蛋白和血小板反应蛋白。血小板因子可以通过本领域已知的任何蛋白质纯化技术分离到。本领域已知的蛋白质纯化技术的合适的方法包括但不限于，亲和层析、免疫亲和层析、分子排阻层析、HPLC和FPLC。任何基本上不导致蛋白质降解的纯化方案都适用于本发明。
下列实施例旨在解释而不是限制本发明。
实施例实施例1用海藻糖充填血小板血小板是从标准的1-3天龄血小板浓缩物中分离的，血小板浓缩物由收集到CPDA(16mM柠檬酸钠，29mM D-葡萄糖，3.1mM柠檬酸，2.9mM磷酸钠，0.36mM腺嘌呤)的血液中制备。加入0.8μM前列腺素I2和0.2u/ml腺苷三磷酸双磷酸酶(或用柠檬酸调节到pH6.5)后，通过在Damon/lEC Centra 4R离心机中以1200×g离心15分钟收集血小板。用塑料巴斯德吸管小心地将上清液移去，保证移去所有的上清液而不破坏血小板沉淀。
为了引入海藻糖，将血小板在高钾(75-130mM)、低钠(1-20mM)的充填缓冲液中重新悬浮到每毫升1-10×1012个细胞的浓度，缓冲液中含有30-60mM的海藻糖、7mM氯化镁、5mM葡萄糖、5mM ATP，并在BioradGene Pulser中以5-7kV/cm和3.0mF(以10-30秒的间隔2-5次脉冲)进行电穿孔。电穿孔后，在离心和重新悬浮在干燥缓冲液中之前使血小板在37℃重新封闭30-60分钟。
通过利用放射性标记的糖或通过HPLC分析估计充填血小板的海藻糖的含量评价海藻糖的充填。示于表2的这些实验结果说明上述处理透过膜并用海藻糖充填了血小板。血小板的形态学(血小板的分布图及血小板的平均体积)通过CoulterMicrodiff18血液学分析仪分析。电穿孔充填海藻糖之前的血小板的血小板形态学(MPV6.4-7.7，PDW15.7-17.2)和之后的形态学(MPV7.0-7.3，PDW16.3-18.3)没有改变，并且海藻糖充填的血小板对拮抗剂胶原蛋白、凝血酶或U46619的ATP释放反应和血小板聚集反应也在正常水平之内。
表 2血小板的海藻糖充填充填缓冲液中海藻糖的浓度14C HPLC30mM 21mM 21mM60mM 41mM 45mM实施例2用海藻糖充填的血小板的干燥如实施例1用海藻糖充填血小板，将重新封闭的血小板用柠檬酸调节到pH6.5并在室温下以1100×g离心7分钟，使血小板沉淀。用塑料巴斯德吸管小心地将上清液移去，将血小板沉淀重新悬浮在pH7.4的干燥缓冲液中，使最终血小板数达到每升1-2×1012，缓冲液中含有100-130mM氯化钠、5mM氯化钾、1mM氯化镁、5mM ATP、1-5％(w/v)血清白蛋白和30-100mM海藻糖。为了在玻璃药瓶中干燥，将血小板浓度调节至每升1-2×1012，将300微升重新悬浮的血小板小心地吸入3毫升的玻璃瓶中，在经改进的FTS Systems冷冻干燥器中进行真空干燥。为了在袋中干燥，将血小板浓度调节至每升2-4×1012，将20-25毫升等份注射到标准的输血袋中并在经改进的FTS Systems冷冻干燥器中进行真空干燥。
真空干燥是通过将下列初始设置程序置于FTS中进行的架温，37℃；真空度，30Torr。开始运行前将样品的温度平衡到大约35℃。在运行过程中压力逐步减小使得样品的温度不低于20℃。调整下列方案以干燥含有300±1产品的12个3毫升小瓶真空度 时间 架温 产品的大概温度(mTorr)(分钟) (℃) (℃)30,0004 372925,0005 602720,0003 602415,000 11 602010,0003 6024(产品干燥)2,0002 20413008 204430 过夜3039为进行重构，小瓶中重新加入600±1缓冲的氯化钠(75mM)溶液中的1-5％SA(生物产品实验室)，轻轻地混合，得到再水化的血小板等渗溶液。再水化的血小板通过CoulterMicrodiff18血液学分析仪和光学显微镜分析。血小板的功能通过研究对下列拮抗剂的聚集反应检测凝血酶 1.0单位/毫升(最终浓度)
胶原蛋白 10±克/毫升(最终浓度)瑞斯托菌素1.5毫克/毫升(最终浓度)ADP 10.6±M(最终浓度)U466190.2±(最终浓度)干燥和再水化后血小板的总数和形态学经光学显微镜和CoulterMicrodiff18血液学分析仪检测没有改变，并且经贮存7天后形态学没有变化。通过血小板平均体积(MPV7.4-8.7)和血小板分布图(PDW17.8-19.3)评价，即使在环境温度下贮存28天后血小板也维持正常的形态学。当用上面列出的拮抗剂处理时重构的血小板表现出聚集止血功能。
实施例3干血小板的末段灭菌QuadroCytesTM用30-90mM的海藻糖通过电穿孔充填，按实施例1和2的描述在玻璃瓶中干燥。封口的玻璃瓶在80℃加热24、48和72小时。重构末段灭菌的样品，按实施例2中的描述用多种拮抗剂测试聚集止血功能。重构的QuadroCytesTM即使在80℃72小时后通过光学显微镜评价仍显示正常的形态学，在CoulterMicrodiff18血液学分析仪上仍显示出正常的细胞大小分布(末段灭菌前MPV7-7.3、PDW16.3-18.3，末段灭菌后MPV7.4-8.7、PDW17.8-18.3)。重构的QuadroCytesTM当用拮抗剂处理时表现聚集止血功能，并且在所研究的三个时间点的末段灭菌的血小板之间均未观察到显著的差别。
实施例4重构的QuadroCytesTM的表面性质的分析按实施例2中的描述制备了在小瓶和袋中干燥的QuadroCytesTM。总的和对唾液酸苷酶不稳定的唾液酸按Crook和Crawford(1988)，英国血液学杂志，69265的描述通过硫代巴比妥酸法的改进法进行估计。获得的结果示于表3。表3QuadroCytesTM总和及对唾液酸苷酶不稳定的QuadroCytesTM唾液酸血库血小板瓶子 袋子(nmol/109血小板) (n＝7)(n＝12)(n＝20)总含量4049 30对唾液酸苷酶不稳定的 2431 24实施例5再水化的QuadroCytesTM的胞质整合性功能分析按实施例2中的描述制备在小瓶和袋中干燥的QuadroCytesTM。胶原蛋白诱导的聚集通过显微镜评价；再水化的QuadroCytesTM(2×1011血小板/升)与荧光团PKH26(Sigma化学公司)标记的新鲜血小板(4×109血小板/升)在10微克/毫升胶原蛋白存在下搅动。标记新鲜血小板的分布是随机的，并且聚集的大部分是由未标记的再水化的QuadroCytesTM构成的。
功能性环加氧酶和血栓烷A2合酶活性的保护是通过检测由与50μM花生四烯酸温育的再水化QuadroCytesTM形成的血栓烷B2来评价的。血栓烷B2的形成是通过一种商业化ELISA试剂盒(Cayman化学公司)检测的。血栓烷B2从其活性前体物血栓烷A2的形成表示对干QuadroCytesTM中功能性环加氧酶和血栓烷A2合酶活性的保护。
实施例6铟标记再水化的QuadroCytesTM用于体内研究按实施例2中的描述制备在小瓶和袋中干燥的QuadroCytesTM。将再水化的QuadroCytesTM(2×1011血小板/升)或洗涤的新鲜血小板在含有1％血清白蛋白和111InO(0.925Mbq/109血小板)的等渗盐水中在室温下重新悬浮30分钟。再水化的QuadroCytesTM的标记效率与新鲜洗涤的血小板的标记效率相当(都是约10％)，当放射标记的血小板在血浆中温育2小时没有观察到放射活性标记的损失，确证干的、再水化的QuadroCytesTM的胞质完整性。
实施例7重构的血小板的体内测试按实施例2中的描述制备在小瓶中干燥的QuadroCytesTM，在运输前在环境温度下贮存2-6周，在正常的非制冷空气货车条件下从英格兰的剑桥(Cambridge，England)运输到加拿大的安大略(Ontario，Canada)，在那里测试其体内存活率和止血功能。重构的QuadroCytesTM的功能用Blajcham建立的RES-阻断型溶栓兔模型进行评价。Ali等(1994)。静脉大量注射2-4×1010血小板后重构的QuadroCytesTM的回收率和存活率分别示于
图1和图2，显示1小时后的回收率为约30％，3小时循环后的短期存活率为约63％。重构的QuadroCytesTM对流血时间和体积的影响分别示于图3和图4，显示重构的血小板具有显著的止血功能。
通过对在Blajcham的RES-阻断型溶栓兔模型中对血液损失的影响的评价，在4-30℃的温度范围贮存3-4个月后，干燥至含水量＞6％的QuadroCytesTM显示其体内功能活性没有损失。
尽管为了清楚地理解，已经通过图表和实施例的形式较详细地描述了前面的发明，对于本领域的技术人员来说很明显可以进行某些改变和改进。因此，这些描述和实施例不应该被曲解为限制由所附权利要求描绘的本发明的范围。
权利要求
1.一种保存血小板的方法，包括在有效引入血小板一定数量的内部海藻糖的条件下处理分离的血小板，海藻糖数量在随后的操作中能够有效地保护血小板，以及在一定数量的能够在干燥时有效保护血小板的外部稳定剂存在下干燥血小板。
2.根据权利要求1的方法，其中内部海藻糖的浓度为5-150mM。
3.根据权利要求1的方法，其中内部海藻糖的浓度为10-39mM。
4.根据权利要求1的方法，其中内部海藻糖的浓度为20-60mM。
5.根据权利要求1的方法，其中外部海藻糖的浓度为1-30％。
6.根据权利要求1的方法，其中外部海藻糖是在干燥缓冲液中。
7.根据权利要求6的方法，其中干燥缓冲液还含有血清白蛋白。
8.一种根据权利要求1的方法获得的组合物。
9.一种贮存干血小板的设备，包括根据前述权利要求获得的干血小板和输血袋、静脉盐水包或非肠道营养包。
全文摘要
本发明提供用于干燥血小板以得到组合物的方法,该组合物在宽的温度范围内经过长时间贮存是稳定的。本发明还提供由此得到的组合物和用于此的设备。
文档编号A01N1/00GK1246778SQ9880235
公开日2000年3月8日 申请日期1998年2月6日 优先权日1997年2月7日
发明者V·C·曼尼斯, D·J·菲普斯, L·M·格兰德芝, B·J·罗泽 申请人:扇形支撑剑桥有限公司