专利名称：在作物中大规模诱变的方法
技术领域：
本发明属于植物遗传学领域，并涉及在作物中进行诱变、基因鉴定和基因功能分析的改进方法。所述方法可用于所有植物种中，本文以番茄为例披露了其用途。
背景技术：
估计高等植物的基因组合有30，000—50，000个基因。仅仅阐明了几百个植物基因的功能。为了证实基因功能，通常需要分离新的基因，并对这些新分离的基因进行诱变。通过生物技术进行的作物改良取决于新分离基因的详细表征。
在过去十年中，拟南芥属模型系统对植物分子生物学领域的显著进步作出了很大贡献。拟南芥属被成功利用的主要原因是其体形小，生命周期短，以及具有较小的基因组(Leutwiler等，1984)。另外，拟南芥属可以用外源DNA方便地进行转化(Bechtold等，1993)。以上特征有利于通过选择控制感兴趣的性状的各种基因的大量的突变型，对在拟南芥属中表达的所有性状进行遗传学剖分。业已证实通过甲基磺酸乙酯(EMS)、快速中子轰击、T—DNA插入、和转座子标记进行的植物群体诱变，作为剖析植物发育的遗传学控制和基因组性状的手段对于植物生物学家来说具有很高价值(Koncz等，1992)。尽管用拟南芥属作为模型进行遗传学分析具有很多优点，但它不是作物，并且，在该物种上所获得的知识并不是总能应用于其它农业上重要的作物种。例如，拟南芥属具有荚果型果实，因此，它是十字花科成员果实发育的良好模式物种，但不适用于生长肉质、浆果型果实的植物。
另一方面，番茄(Lycopersicon esculentum)是产生肉质、浆果型果实的作物种的良好模型。番茄在遗传学上是众所周知的。番茄具有较小的二倍体基因组(n=12，C=1pg)，它含有数百个作图的性状和分子标记(Tanskley，1993)。可以用外源DNA转化番茄(McCormick等，1986)。而且，它还是新鲜蔬菜市场以及粮食加工行业中的最重要的作物(Hille等，1989；Rick和Yoder，1988)。
在番茄遗传学领域取得进一步进展的主要障碍是缺少基因鉴定所必须的大量的突变群体。番茄的有用的突变群体应当使每一个番茄基因包括至少一个突变型等位基因，这样的群体有可能在这种作物中实现饱和诱变。尽管存在用于生产突变型番茄植物的技术，但由于时间和空间的限制目前尚不能将这种技术以足够大的规模使用，以便获得其基因组被突变饱和的群体。这些限制还制约了在其它农业作物上的研究。
通过使用诸如EMS的DNA破坏剂(Hildering和Verkerk，1965；Schoenmakers等，1991；Wisman等，1991)、X—射线(Hildering和Verkerk，1965)或快速中子(Verkerk，1971)业已产生了突变型番茄植物，但与在拟南芥属上所做的努力相比，这些成果还是很有限的。业已披露了由番茄遗传学资源中心出售的数百个突变型番茄品系，但尚没有可供在新基因中选择突变的源于大的M1植物群体的诱变的M2种子的资源。
通过T—DNA标记进行的插入诱变不适用于番茄，因为转化方法仍然很烦琐。另一方面，转座子标记是在番茄和其它农业种上进行诱变和基因鉴定的有希望的途径。业已证实Ac／Ds转座因子家族能在番茄中起作用(Yoder等，1988)，并且业已披露了在该物种中Ac／Ds转座的方式(Carroll等，1995；Osborne等，1991；Lommens等，1992；Yoder等，1988)。业已生产出了含有Ds因子的番茄品系，该因子被作图于番茄基因组上(Knapp等，1994；Thomas等，1994)。这些品系有可能利用在附近位点的Ac／Ds的优势插入(Dooner和Belachew，1989；Jones等，1990)。将Ac／Ds标记系统用于标记并分离若干基因，如cf9，一个决定芽枝霉属抗性的基因座(Jones等，1994)；dwarf，编码细胞色素p450同系物的基因(Bishop等，1996)；和控制叶绿体发育的dcl(Keddie等，1996)。
反向遗传学是确定分离的基因的功能的有效方法(Benson等，1995)。例如，在玉米中，通过选择包括48，000个随机诱变植物的大型植物群体可以鉴定在感兴趣的基因上的突变。原则上讲，在所述突变群体中的每一个植物都含有由插入转座因子所导致的不同突变。通过聚合酶链式反应(PCR)分析鉴定在感兴趣的基因上含有转座因子插入的植物。将具有相当于转座子的核苷酸序列的第一种引物和具有相当于感兴趣的基因的核苷酸序列的第二引物与从推测的突变体中分离的DNA一起用于PCR反应。原则上讲，只有转座子插入感兴趣的基因上才能产生PCR产物。分析含有在PCR反应中产生PCR产物的DNA的突变型植物，确定该突变对植物生长和发育的影响，并因此确定感兴趣的基因的功能。
不过，在大多数作物种上不能采用反向遗传学，因为它需要投入很多的时间和精力，并需要大量的田间设施以便产生并容纳数以万计的T—DNA或转座子标记的植物，这些植物必须生长到成熟，以便检测感兴趣的突变型。因此，需要另一种方法来在大多数作物种上实现反向遗传学。类似地，需要一种实用方法来选择用总DNA结构转化过的大型作物群体，该方法可以检测控制基因表达的DNA因子，如启动子或增强子。
发明概述本发明的一个目的是提供用小型化作物进行突变型鉴定和表征的改进方法。
本发明的另一个目的是提供表征克隆的核苷酸序列的改进方法。
本发明的再一个目的是提供克隆核苷酸序列的改进方法。
上述目的以及其它目的是通过提供一种选择具有理想性状的突变型小型植物的方法而实现的，该方法包括以下步骤(a)提供一群小型植物，其中，所述小型植物具有下列特征(ⅰ)与同一物种的商业栽培品种相比具有较小的体形；(ⅱ)在比用于同一物种的商业植物的标准生长条件至少高10倍的种植密度下能够成熟，并产生有活力的种子或块茎；和(ⅲ)能够与同一物种的商业植物杂交；(b)通过用突变诱导剂处理所述小型植物在所述小型植物群体中产生突变型小型植物，以便产生突变型植物群体；和(c)在所述诱变的小型植物群体中选择具有所述理想性状的突变型小型植物。
在本文所披露的本发明的所有方面和实施方案中，可以通过天然或诱发突变，通过遗传工程，或通过用植物生长因子处理产生小型植物的群体。可用于本发明的小型植物的例子包括，但不限于小型番茄品种，如‘Micro—Tom’和‘Micro—Peach’。上述步骤(b)中所使用的突变诱导剂可以是化学诱变剂，如甲基磺酸乙酯(EMS)，甲基磺酸甲酯(MMS)，甲基—N—亚硝基脲(MNU)和博来霉素。另外，所述突变诱导剂可以是射线，如UV、γ—射线、X—射线、和快速中子。最后，所述突变诱导剂还可以是可动DNA序列，该序列是T—DNA或选自下列一组的转座因子自主性转座子、非自主性转座子、和自主性转座子／非自主性转座子系统，如(但不局限于)玉米Ac／Ds转座因子。所述同一物种的商业植物是用于生产粮食、纤维或花卉的植物，包括，但不限于产生浆果型果实的植物，如番茄、葡萄、李子、茄子、柑橘类果实和苹果，或茄科的植物，如马铃薯。
在另一种实施方案中，本发明提供了一种突变型小型群体，其中，所述群体的小型植物具有下列特征(ⅰ)与同一物种的商业植物相比具有较小的体形；(ⅱ)在比用于同一物种的商业植物的标准生长条件至少高10倍的种植密度下能够成熟，并产生有活力的种子或块茎；(ⅲ)能够与同一物种的商业植物杂交；和(ⅳ)具有用一种制剂诱导的突变，该制剂是化学诱变剂、射线、或可动DNA序列。
本发明的另一种实施方案提供了一种用于鉴定含有插入感兴趣的基因上的可动DNA序列的小型植物的方法，包括以下步骤(a)提供一群小型植物，其中，所述小型植物具有下列特征(ⅰ)与同一物种的商业植物相比具有较小的体形；(ⅱ)在比用于同一物种的商业植物的标准生长条件至少高10倍的种植密度下能够成熟，并产生有活力的种子或块茎；和(ⅲ)能够与同一物种的商业植物杂交；(b)通过用可动DNA序列处理所述植物，在所述小型植物群体中产生突变型植物；(c)通过PCR筛选从所述突变型植物中提取的DNA，使用具有相当于所述可动DNA序列的核苷酸序列的第一引物和具有相当于所述感兴趣的基因的核苷酸序列的第二引物；和(d)鉴定包括能在有所述第一和第二引物的条件下产生PCR产物的DNA的小型植物。
本发明的另一种实施方案提供了一种生产小型植物的突变型群体的方法，包括以下步骤(a)提供一群小型植物，其中，所述小型植物具有下列特征(ⅰ)与同一物种的商业植物相比具有较小的体形；(ⅱ)在比用于同一物种的商业植物的标准生长条件至少高10倍的种植密度下能够成熟，并产生有活力的种子或块茎；和(ⅲ)能够与同一物种的商业植物杂交；和
(b)通过用一种突变诱导剂处理所述小型植物在所述小型植物群体中产生所述突变植物。
当步骤(b)中的所述突变诱导剂是T—DNA时，用农杆菌属感染所述小型植物，由此产生多个转化体，其中，每一个转化体包括插在不同基因组位点上的T—DNA。当步骤(b)中的突变诱导剂是转座子时，所述突变型小型植物群体是从含有一种活性转座系统的小型植物的后代获得的。所述活性转座系统可以是植物天然具备的转座子或通过本领域技术人员熟知的遗传工程技术导入植物中的转座子，如自主性转座子，或通过让含有非自主转座子的植物与转座酶源或含有自主性转座子的植物杂交获得的转座因子。例如，所述转座因子是玉米Ac／Ds转座子系统。
本发明的另一种实施方案提供了鉴定控制植物基因表达的核苷酸序列的方法，包括下列步骤(a)用一种DNA结构转化一种作物的小型植物，以便产生一个随机诱变植物的群体，其中，所述DNA结构包括一个编码选择标记的基因序列，该基因缺少启动子或者含有一个最小启动子，其中，所述小型植物具有下列特征(ⅰ)与同一物种的商业植物相比具有较小的体形；(ⅱ)在比用于同一物种的商业植物的标准生长条件至少高10倍的种植密度下能够成熟，并产生有活力的种子或块茎；和(ⅲ)能够与同一物种的商业植物杂交产生随机诱变植物群体；(b)在所述植物群体中鉴定由所述DNA结构转化的并能表达所述选择标记的小型植物；和(c)克隆所述核苷酸序列，该序列可操作地连接于从在步骤(b)中鉴定的所述转化小型植物中提取的总DNA的编码所述选择标记的基因上。
所述选择标记可以是GUS或萤光素酶，所述可动DNA序列可以是T—DNA或转座因子，而所述控制所述植物基因表达的核苷酸序列可以是启动子或增强子。
在本发明的又一种实施方案中，本发明提供了生产具有理想性状的突变型群体的方法，该方法包括以下步骤(a)让按照本发明选择方法选择的具有所述理想性状的突变型小型植物与同一物种的商业植物杂交；和
(b)选择与所述商业亲本植物相似并表达所述理想性状的后代。
根据该实施方案，本发明还包括通过上述方法获得的商业植物的突变型群体。
附图的简要说明
图1表示‘Micro—Tom’对不同生长条件的反应。
图2表示‘Micro—Tom’野生型和突变表型。
图3表示转入‘Micro—Tom’中的结构的示意图。
图4表示选择含有用于转座选择的标记的植物的结果。
图5表示chlorosulfuron抗性(Chl)和潮霉素抗性(Hygr)植物的Southern印迹的结果。
图6表示质粒Ds—萤光素酶(Ds／LUC)的示意图。
图7表示Ds—萤光素酶(Ds／LUC)插入在各种植物器官中表达的基因中的结果。
发明详述本发明可以快速和大规模生产并有效选择诱变植物。这一目的是通过使用一种小型化作物实现的，这种作物能够与同一物种的商业栽培品种杂交。在所述小型植物中诱发突变，然后在突变型小型植物群体中鉴定突变体，该群体能以高密度有效生长到成熟。
用诸如番茄的大多数作物种进行反向遗传学的主要障碍是需要大量时间、精力和空间来生产并处理非常庞大的突变植物群体。例如，本发明能够快速、大规模生产并有效选择转座子诱变的植物，而这一点用现有的生产技术是无法做到的。据估计，为了生产对诸如番茄的大多数农业上感兴趣的物种进行反向遗传学的代表性植物群体，需要100，000个不同转座子诱变的植物。在作物中生产这样一种突变体文库，按照本发明可以通过采用一种小型植物来实现。本发明通过在生长在可控制的种植面积上的大的植物群体中鉴定具有插入感兴趣的靶基因的转座子的品系使几乎所有需要的基因失活。插入靶基因的转座子的鉴定是通过PCR筛选携带转座子的植物库而进行的，使用具有相当于所述靶基因的核苷酸序列的一种引物和具有相当于转座子的核苷酸序列的第二引物。只有从具有插入所述感兴趣的基因的转座子的植物突变体中提取的DNA物质才能够产生PCR产物。
本发明的方法适用于农业上感兴趣的任何植物，包括用于生产粮食、纤维或花卉的植物。所述农业作物包括，但不限于产生浆果型果实的植物，如番茄、葡萄、柑橘类果实、李子、苹果、茄子；茄科的植物，例如马铃薯；和玉米以及花卉和果树。
本发明的方法还有利于鉴定具有商业价值的基因，分离新基因，用传统育种方法导入新的基因，以及分离组织特异性启动子和增强子。具有商业价值的基因包括影响果实成熟的基因，和提高植物产量和／或品质的基因。新的基因很可能是分离的目标，包括与果实的糖份含量、矿物质摄取等相关的基因。可以通过使用在转座子中操作的“基因捕获”方法分离组织特异性启动子。
几乎所有理想基因的失活是通过将诸如转座因子的可动DNA序列插入植物基因组，在所述小型植物中进行随机诱变，并鉴定具有插入所述靶基因的转座子的植物而实现的。感兴趣的插入突变型的鉴定是通过PCR选择携带转座子的植物库而完成的，使用具有相当于所述靶基因的核苷酸序列的一种引物，和相当于转座子的第二种引物。所述小型化作物群体还可用于植物启动子的有效选择和鉴定。
用于本说明书的术语定义如下小型植物，栽培品种或作物的整体大小或生物量与相应植物、栽培品种或植物的野生型作物相比明显降低。所述小型植物、栽培品种或作物可以相应野生型植物不可能达到的种植密度生长到成熟，并产生有生活力的繁殖器官，如果实、种子、块茎等。例如，小型植物、栽培品种或作物可以比用于相同物种的商业植物的标准生长条件至少高1倍，优选5倍、10倍、50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍或更高的种植密度生长到成熟。可以高的密度生长野生型植物，但只能生长到幼苗或幼小植株阶段，不能产生果实、种子或块茎。相反，本发明的小型作物可以高的种植密度生长到成熟，具有成熟果实、种子、块茎等的发育。
转座子—能够移动或“跳动”到基因组的不同位点的天然DNA序列。通过插入基因并导致基因破坏，转座子可以在该基因中引起突变。业已在细菌、果蝇、酵母、线虫、植物和哺乳动物中发现了转座子。
转座因子—相当于转座子。
转座酶—由自主性转座子表达的蛋白，它结合在转座子的末端区，它能引起转座子切除并转座到该基因组的另一个位点。
自主性转座子—一种编码转座酶并具有由该转座酶识别以表现其催化活性的末端区的因子，因此能够自主性转座。由自主性转座子引起的突变是不稳定的。自主性转座子的例子有玉米的Ac(激活物)转座子。
非自主性转座子—一种含有被转座酶识别的末端区，但不编码这种酶的因子，因此，为了切除并转座到该基因组的另一个位点需要反式添加的转座酶。非自主性转座子的例子有玉米的Ds(解离)转座子，该转座子可以与自主性，例如，Ac转座子一起使用。
所述作物的小型栽培品种可以由天然或诱导的突变形成，通过遗传工程或通过用植物生长因子处理感兴趣的作物。矮化突变型在植物王国中是普遍存在的，并且业已在大量物种中发现。
最重要的一类矮化基因是小麦的rht(降低高度)基因(Gale和Youssefian，1985)。所述基因主要是决定绿色进化。矮化栽培品种的较短的茎杆可以“负荷”每个植株的较高的产量(较重的果穗)，并能使得该植物以高于高的栽培品种可能达到的密度生长，从而导致世界范围内的小麦产量提高。野生型小麦的高度大约为120—140厘米；一个矮化基因的存在可将其降低到90—100厘米，两个矮化基因的存在可将其降低到40—60厘米。目前，标准的小麦栽培品种包括一个或两个矮化基因。在这些植物中，降低的高度与其它植物器官(例如叶或果穗)的小型化无关，因此，不能用于大规模诱变。不过，极端矮化的小麦植物可用于在该物种上进行大规模诱变。
类似地，业已在玉米和稻的其它禾本科植物上；在诸如豌豆的豆科植物上；在诸如辣椒、茄子和番茄的蔬菜上；在诸如玫瑰的观赏植物上；和在诸如橙子和其它柑橘类的树木上发现了矮化基因，这些基因的作用模式不同。在最新的综述中披露了矮化植物的若干例子，其决定基因，及其作用模式(Hedden和Kamiya，1997)。例如，某些矮化植物在合成一种植物激素(例如赤霉素)方面是有缺陷的，而其它矮化植株能合成赤霉素但对它不敏感(例如，GAI=赤霉素不敏感突变型)。不过，对于大多数矮化植物来说，其作用模式尚不清楚。所述矮化植物，或可以操作并明显减小植物大小的克隆基因，可被本发明用于在任何作物中进行大规模诱变。
存在在多种作物中分离并表征矮化植物的通用方法。可以用能影响总体大小的分离基因转化植物。例如，可以用从拟南芥属中分离的无花瓣基因改变被转化的杨树的大小。可以用传统育种方法构建小型作物。对于栽培品种‘Micro—Tom’来说，被称为miniature和dwarf的两个主要基因决定其小型表型。
矮化或小型栽培品种植物的种植密度至少比标准大田条件高10倍，因为小型植物的体型明显减小，这有利于在小的土地面积上分析大的植物群体。如在下面的实施例部分所述，对于番茄小型栽培品种‘Micro—Tom’来说，其植物种植密度比商业栽培品种在标准大田条件下所能达到的密度高大约200倍。新的突变型包括在小型栽培品种中获得的插入突变型，可以通过与所述作物进行标准杂交，并分离小型化基因或转基因将其转移到商业背景中。
任何诱变技术均可用于获得本发明的小型栽培品种，这些技术包括，但不限于化学处理、辐射、或用本领域技术人员所熟知的技术用源于宿主植物或异源的T—DNA或转座子进行DNA插入。通过筛选大的植物群体，可以获得导致矮化的插入失活。生产小型栽培品种的化学处理可以通过已知技术进行，使用诸如甲基磺酸乙酯(EMS)，甲基磺酸甲酯(MMS)，甲基—N—亚硝基脲(MNU)，和博来霉素等的诱变剂。还可以用已知技术通过用UV—射线，X—射线和快速中子辐射实现(例如，参见Poehlman，1987或Malmbery，1993)。
可以用可动DNA序列进行基因的插入失活。所述可动DNA序列可以是T—DNA或转座子。
可以通过已知方法用农杆菌属进行T—DNA诱变(Hoekema等，1983；US5，149，645)。转座子插入诱变可以用众所周知的方法进行(Fedoroff等，1984；US4，732，856和US5，013，658)。所述转座因子可以是自主性转座子、非自主性转座子、或自主性转座子／非自主性转座子系统，例如，玉米Ac／Ds转座子系统。
筛选大的植物群体，优选至少数千个植物的群体中的突变型。突变型的鉴定可以用肉眼完成，例如，鉴定小型选择。还可以用其它方法鉴定其它类型的突变型；例如，通过植物生物学领域中已知的技术分析特殊性状，这些性状包括，但不限于对激素的反应、对矿物质的反应、对病原体的反应、和对除草剂的反应等。
在特定基因上鉴定插入现象是通过包括PCR筛选的方法进行的，使用相当于转座子或T—DNA的核苷酸序列的第一引物和相当于感兴趣的基因的核苷酸序列的第二引物。感兴趣的基因可以是分离的基因，业已测定了其部分或全部序列。另外，感兴趣的基因可以是一种表达序列标记(EST)。PCR方法是本领域中众所周知的。有关PCR的一般性描述参见Delidow等，1993。Rychlick等(1993)披露了适用于PCR方法的寡核苷酸引物序列的设计。Allen等(1993)披露了检测PCR产物的方法。
鉴定有关植物，从该植物中分离的DNA与所述第一和第二引物能产生PCR产物。对该植物进行分析，以确定转座子插入对该植物表型的影响。
可将本发明的方法用于鉴定和表征任何感兴趣的基因，包括发育和抗病基因。为了设计进行PCR分析的引物，需要感兴趣的基因的足够的核苷酸序列。一旦鉴定了特定感兴趣的基因，可以用植物育种领域中众所周知的技术将其转移到合适的商业背景中(例如，参见Poehlman，JM，大田作物育种，纽约1987)。所使用的具体方法取决于有关作物。
本发明被用于在番茄作物中建立一个突变型文库。该文库大大加强了番茄遗传学的研究和分离重要基因的能力。该突变型番茄文库是以被称为‘Micro—Tom’(小型番茄)的小型—矮化—有限番茄栽培品种为基础建立的，该品种最初是为了家庭种植目的而育成的(Scott和Harbaugh，1989)。该栽培品种特别适用于本发明，因为它能够以高达每平方米1357个植株的高密度种植，并且能在以如此高的密度种植时结果。另外，该栽培品种具有短的生活周期，从播种日开始在70—90天内就能产生成熟的果实，这有利于每年选择4代。这使得它成为选择大型诱变植物群体的有效系统，并使得能够在番茄中进行饱和诱变。
另外，还可以对该栽培品种进行方便而有效的转化。用农杆菌属介导的子叶转化可以获得高达80％的转化频率，并且，从接种子叶开始，到收获转基因果实仅需要大约100天。另外，该栽培品种与标准番茄栽培品种仅有两个主要基因的差别。由于这两个控制‘Micro—Tom’体形的基因是隐性的，可以在标准背景中用F1代分析显性性状。需要一代以上以便将隐性基因转移到标准类型中。因此，可以在‘Micro—Tom’遗传背景中方便地研究任何突变或转基因，并且如果必要，还可以用本领域技术人员所熟知的传统育种技术将其转移到标准背景中。
我们还证实，Ac／Ds转座子标记系统可用于被称为‘Micro—Peach’的另一种小型番茄栽培品种中。‘Micro—Peach’在体形上与‘Micro—Tom’类似。不过，‘Micro—Peach’具有桃色果实，而‘Micro—Tom’具有红色果实。Ac／Ds转座子在‘Micro—Peach’系统中非常活跃，可以进行大规模诱变和反向遗传学。
为了评价‘Micro—Tom’作为诱变和反向遗传学的模型系统的价值，对该栽培品种的生长条件和转化条件进行优化。然后，筛选由9，000个M1个体得到的20，000EMS诱变的M2植物。发现了具有改变了的颜色或改变了的叶片性状、花和果实的突变型。将Ac／Ds转座因子增强子捕获系统(Fedoroff和Smith，1993)和基因捕获系统(Sunadaresan等，1995)导入‘Micro—Tom’，并测定其活性。因此，使用‘Micro—Tom’栽培品种可以实现在番茄中进行饱和诱变的目的，或进行任何基因的标记或插入失活。本发明的方法可用于对感兴趣的植物种进行任何小型选择，以便快速并有效地鉴定基因。
源于EMS—诱变‘Micro—Tom’的包括14，000个体的M2植物群体可以生长在100平方米的空间内，通过这一观察结果可以了解本发明的优点。另外，仅需要一个人短短6个月的工作(M1在春季种植，而M2在同一年的夏季种植)，就能产生该群体。回收到了大量的突变型，尽管所采用的EMS诱变是相对温和的，这一点由出现的白化植株低于1％这一事实所证实。很有可能在所得到的M2群体中存在很多其它的突变型基因，这与由其它研究者报导的仅能获得有限的数百个番茄突变型相比是有利的。
所有M2家族都源于单个的M1植株，并表现出以3∶1(显性∶隐性)的比例分离的突变表型。这表明，在本文所使用的实验条件下，在‘Micro—Tom’中，配子是源于在诱变时存在于成熟种子的胚胎中的单细胞。上述结果与以前的报导吻合(Hildering和Verkerk，1965；Verkerk，1971)，有1—3个细胞在突变的番茄植物中产生孢母细胞。
尽管以前业已在番茄中披露了转座子标记系统(Carroll等，1995；Knapp等，1994；Rommens等，1992；Yoder等，1988)，但在现有文献中尚未报导该植物的增强子和基因标记系统。不过，同样根据本发明，将两种选择不连锁的转座的系统导入番茄一种系统基于NAM敏感性和卡那霉素抗性(Sundaresan等，1995)，第二个系统基于切除—插入选择(Fedoroff和Smith，1993)，该系统具有有效检测包含在Ds中的潮霉素抗性的优点。另外，使用对chlorosulfuron的抗性作为切除标记，并结合‘Micro—Tom’其它农艺特征，可以从大型推测的突变群体中筛选增强子和启动子，并用于基因分离。另外，最近披露的在番茄体细胞组织中进行位点选择插入的方法(Cooley等，1996)也可应用于‘Micro—Tom’，进行稳定的胚转座过程。在这一方面，业已证实Ac／Ds系统能在‘Micro—Tom’起作用，并且还可以通过基因剔除或插入失活进行反向遗传学。
因此，通过本发明，可将‘Micro—Tom’用于开发一种在植物中进行遗传学研究的模型系统。它加快了转基因植物的鉴定，并有利于分离突变型、启动子和基因。‘Micro—Tom’可以用作能产生浆果型果实的其它商业上重要的作物(例如，柑橘、葡萄等)的通用模型系统。在‘Micro—Tom’中所发现的果实基因、启动子、和突变型都有利于研究其它在植物学上相似果实的遗传学、生理学和代谢。类似地，‘Micro—Tom’可以用作植物发育突变和基因以及其它重要农艺基因座的通用模型系统。能有效用于小型番茄栽培品种‘Micro—Tom’的基因鉴定和分析方法能方便地应用于其它植物的其它矮化突变型，包括农业上重要的作物种。
提供下列实施例是为了说明目的，而不构成对权利要求书的限定。本领域普通技术人员可以对所披露的实施例进行各种改进，而这些改进应该包括在本发明的范围内。本说明书中所提到的所有文献和专利申请代表了本发明所属领域技术人员的水平。所有文献和专利申请在本文中以相同程度收作参考文献，就如同每一件文献或专利申请被特别和单独指明以其整体形式收作参考文献一样。
实施例例1．生长习性和遗传组成(a)方法将‘Micro—Tom’植物种子播种到苗圃用托盘或花盆中，并生长到果实成熟。为了进行种植密度试验，每一种处理相当于生长在不同的根体积中。为此目的，将植物种植在13、33、90或200毫升的商业化苗圃用分隔过的托盘或容积为465毫升的花盆中。每一种处理有两个重复，每一个重复包括84(13毫升处理)、72(33毫升)、63(90毫升)、50(200毫升)和15(465毫升)个植株，将其用于每一种性状的分析。
(b)结果在各种大小的根系容积的苗圃用托盘中让‘Micro—Tom’植物从种子生长到果实成熟，以便测定密度对植物生长以及对果实和种子成熟的影响。每平方米100—1357个植株的密度等于试验的根体积为465—13毫升。在
图1中示出了‘Micro—Tom’对不同生长条件的反应。检验过的生长性状在每一个方框中标出，在括号中给出了有关值的范围(最小—最大)。每一个性状以该性状的最大值的百分比形式给出，将其表示为根体积(底部刻度)或植物密度(上部刻度)的函数。测定了以下性状到开花的天数(从播种到开花的平均天数)；到成熟的天数(从播种到果实颜色改变的平均天数)；植株高度(从土壤表面到第一花序的高度(厘米))；叶片数(主茎上的叶片数)；植物产量(每个植株的总的果实重量(克))；果实数量(每个植株的果实数量)；果实重量(果实的平均重量(克))；和种子数量(每个植株的平均种子数量)。误差线条太小以至于不能表示。
某些性状几乎不受种植密度影响。例如，从种子播种到开花的天数为30天—40天，而从种子播种到果实成熟的天数为75—82天。当在相同条件下种植对照标准鉴定的番茄栽培品种(cv．UC82)时，在高密度(412—1357植株／米2)下它不能结实，而且在较低密度(100—226植株／米2)下仅有某些植株形成果实，其它性状，如每个植株的植物产量、果实数量或种子数量，与种植密度的改变呈线性反应，在该试验中所获得的最小和最大值之间存在10倍以上的差别。平均果实重量和植株高度的性状表现出对密度有较弱的反应，在最小和最大值之间存在2倍的差别。
在图2A和2B中示出了生长在各种密度水平下的成熟植物。图2A表示以13毫升(上左)、33毫升(上右)、90毫升(下左)、和200毫升(下右)的根体积种植的‘Micro—Tom’植物。图2B表示以90毫升容积种植的野生型‘Micro—Tom’成熟植物，具有一个尺度线条。所述植物高5—6厘米(不包括根)，果实的直径为1．5—2厘米。以226植株／米2的密度将‘Micro—Tom’植物种植在苗圃中。注意到在‘Micro—Tom’中，所有植物器官的体积都呈比例地变小了(只有种子除外，种子的大小接近正常大小)。这与其它番茄矮化突变型相反，所述矮化突变型具有紧凑的外观，并且与其整体植株体形相比，具有大的叶片。
以上结果表明，矮化栽培品种‘Micro—Tom’通常能以高达1357植株／米2的密度种植，以便用于本发明。
让‘Micro—Tom’与鉴定的栽培品种UC82和未鉴定的栽培品种VF86杂交。两种杂交的F1植株在高度方面与“高的”亲本非常相似，表明控制‘Micro—Tom’表型的基因是隐性的。在来自与UC82杂交的F2后代中，存在多种生长习性表型。在分析过的176个F2植株中有6个明确不具备‘Micro—Tom’表型，表明该表型是由2个主要隐性基因控制的，并可能具有额外的修饰基因的作用。根据‘Micro—Tom’的谱系(Scott和Harbaugh，1989)，似乎dwarf和miniature是与‘Micro—Tom’表型有关的两个基因。
以上结果表明，矮化栽培品种‘Micro—Tom’能够方便地与番茄的商业栽培品种杂交。
例2．EMS诱变(a)方法为了进行EMS试验，按照例1所述生长植物，所不同的是，这些植物生长在以色列Rehovot的魏茨曼科学研究所的防昆虫网状室中，而不是生长在温室中。
对15，000粒‘Micro—Tom’种子进行EMS—诱变。对所述种子进行诱变处理，由诱变的种子萌发的植株被称为M1代。将所述种子放在培养皿中的湿的Whatman纸上吸水9小时，转移到装有150毫升未缓冲过的0．7％EMS(Sigma)溶液的三角瓶中，并在室温(22℃下)轻缓振荡培养16小时过夜。对诱变过的种子进行彻底清洗，吹风干燥，并在当天播种到育苗托盘中。与对照组相比，诱变过的幼苗其生长推迟，并且其发芽百分比降低大约25％。大约10％的M1植物是不育的。从9000个M1植株上收获M2种子。从70个M1植株中，分别从每一个植株上单独收获M2种子，并且将每一个M1植株的10—20个M2植物种植在后代行中。其余的M2种子是统一收获的，合并来自每一个M1植株的一个果实。播种来自统一收获的大约20，000粒M2种子，并产生14，000个形成果实的M2植物。统一收获M3种子。
(b)结果在M1群体(处理的一代)中，大约1％的植物出现叶绿素花斑。
在M2群体中，总共在苗圃用托盘中生长14，000个植株，并选择突变表型，如图2C所示。图2D—H表示具有突变表型的EMS产生的M2植物。在该群体中发现了111个叶绿素突变体，包括白化、黄色(叶黄素样)和浅绿色叶片；图2G表示具有叶绿素突变表型(黄色叶片)的M2植物。还观察到了具有改变了的叶片形状，花(花瓣)和果实颜色的植株。与野生型圆形果实相比，有6个植物的所有果实都表现出改变了的果实形状，包括诸如柿子形状(图2D)和梨形(图2E)的表型。具有长椭圆形果实的植物同样具有长而且窄的叶片(图2F)。
还选择了源于单个M1植物的70个M2家族的突变。在5个家族中，观察到了总是以3∶1比例分离的突变表型。所述家族之一的叶片花青苷(紫色)着色是分离的；该家族如图2H所示，源于单一的M2植物，其花青苷以3∶1的比例分离。
例3．‘Micro—Tom’中的转座子标记和增强子捕获(a)方法按所述方法用下列结构转化‘Micro—Tom’植物；然后按照例1所述在温室中生长所述转基因植物。
(1)结构用于增强子捕获的结构Bam35S—Ac和Ds378—GUS(Fedoroff和Smith，1993)获自Nina Fedoroff。分别被用于基因捕获和增强子捕获(Sundaresan等，1995)的结构DsG和DsE(Sundaresan等，1995)获自Venkatesan Sundaresan。所述结构如图3所示，并说明如下。类似于2Ac的序列用灰色表示，其末端反向重复用灰色箭头表示。结构的两侧是其相应的T—DNA的右臂(RB)和左臂(LB)。将β—葡糖醛酸酶基因(GUS)融合到Ds378—GUS的Ac弱启动子上，融合到DsE上的35S的最小—1至—46启动子区(黑色方框)上，或融合到拟南芥属的内含子上，随后是位于DsG上的三个受体剪接位点(黑色方框)(Sundaresan等，1995)。卡那霉素的抗性(Kanr)或潮霉素抗性(Hygr)分别是由新霉素磷酸转移酶或氨基环醇磷酸转移酶基因产生的。对萘乙酰胺(NAM5)的敏感性是由吲哚乙酸水解酶基因产生的。
Ds移动性是通过让含Ds的植物(DsG、DsE和Ds378—GUS)与用Bam35S—Ac转化过的产生转座酶的植物杂交而获得的。在该结构中，转座酶是在与Ac因子融合的35S启动子的控制下产生的。Ac因子的5’末端区一直到单一BamHI位点业已缺失。在从含有Ds378—GUS的结构中切除Ds因子时，获得了chlorosulfuron抗性(Chlr)，并激活了来自含有GUS的结构的突变的乙酰乳酸合酶基因，还激活了源于拟南芥属的突变的乙酰乳酸合酶基因(Fedoroff和Smith，1993)。在Bam35S—Ac和Ds378—GUS杂交的F1中切除Ds378—GUS时，获得了切除足迹(Ex1和Ex2)，并用引物pr1和pr2进行扩增。Ds378—GUS的旁侧序列在Ex1和Ex2上面示出。在下面划线的序列表示在产生Ds378—GUS的原始wx—m7玉米等位基因上的宿主重复旁侧Ac插入位点。
(2)转化通过以下优化方法用结构Ds378—GUS、Bam35S—Ac、DsE和DsG转化‘Micro—Tom’。在25℃下，在低光照条件下，让补充了0．2微克／毫升2，4—D的含有KCMS培养基的平板(Fillati等，1987)和烟草饲养细胞层(Horsch等，1985)培养24小时。在靠近叶柄处和叶尖处切割7日龄幼苗的子叶，放在平板上，并在25℃下在低光照条件下预培养24小时。用于共培养的农杆菌属菌株LBA4404的浓度为5×107—9×107cfu／ml，相当于OD为0．4—0．5。共培养是在和预培养相同的条件下进行的，并持续48小时。然后将所述子叶转移到含有100微克／毫升卡那霉素和400微克／毫升羧卞青霉素的2Z培养基(Fillati等，1987)上，培养3—4周，然后再转移到含有200微克／毫升羧卞青霉素的1Z培养基上培养2—3周，然后从所述子叶上切除芽，并转移到补充了2微克／毫升IBA，50微克／毫升卡那霉素，和100微克／毫升羧卞青霉素的生根培养基(MSSV)上(Fillati等，1987)。小植株在1—3周之后长出根，然后将其转移到温室中。
(3)选择标记和GUS报导基因。除了用于所述捕获系统的转化和GUS报导基因所需要的卡那霉素选择之外，将多种标记用于选择转座现象(Fedoroff和Smith，1993；Sundaresan等，1995)。为此，让消毒过的种子萌发并生长在补充了下列化合物之一或其组合的含有0．8％琼脂的Nitsh培养基上20微克／毫升潮霉素(Calbiochem)；0．25微克／毫升萘乙酰胺(NAM，Sigma)；和100p．p．b．或2p．m．chlorosulfuron(杜邦)。按照Jefferson(1987)的方法进行GUS染色，按照Beeckman和Engler(1994)的方法进行组织清理。
(4)DNA分析。用Dellaporta方法(Dellaporta等，1983)从幼小叶片中提取DNA，增加一次苯酚氯仿萃取。按照生产商推荐的条件，用Promega Taq聚合酶与2．5mM氯化镁和200μM dNTPs在MJ热循环仪中进行PCR反应。使用了下列方案在94℃下进行2分钟变性，在94℃下1分钟，在55℃下40分钟，在72℃1分钟，反应30轮次，最后一步是在72℃下5分钟。用于扩增Ds切除产物的引物是pr2，5’GGATAGTGGGATTGTGCGTC3’，该引物互补于35S启动子的序列，和pr1，5’GGATGATTTGTTGGGGTTTA3’，该引物互补于ALS基因的序列(图3)。从琼脂糖凝胶中提取预期大小的切除产物(大约322bp)的带，并按照生产商的说明用GenClean纯化DNA。将所述PCR产物克隆到pGEM—T载体(Promega)上，并用T7或SP6引物测序。为了进行Southern分析，用HindⅢ消化2微克基因组DNA，在0．8％的琼脂糖凝胶上分离，并转移到从MSI购买的硝酸纤维素膜上。按照生产商的说明进行杂交。通过PCR扩增1kb的内部GUS片段，通过随机引物法进行放射性标记(Feinberg和Vogelstein，1983)，并用作Ds检测的探针。
(b)结果按所述方法将结构Ds378—GUS、Bam35S—Ac、DsE、和DsG转入‘Micro—Tom’中。
所述结构含有能赋予对卡那霉素的抗性的NPTⅡ基因。可将NPTⅡ用作转化标记，检测T—DNA的存在，并使Ds因子相对其Ds378—GUS上的供体位点作图，或选择DsE和DsG的不连锁的转座现象。该基因的一个优点是，它可以在整个番茄植物中用作非破坏性的报导基因。按以前披露的方法(Weide等，1989)连续3天用300微克／毫升卡那霉素在大多数发育阶段喷洒‘Micro—Tom’植株，能够鉴定卡那霉素敏感植株而不破坏该植株。如图4所示，在所述植物中，靠近苗端的幼小叶片在喷洒后不久变白。图4A表示用300微克／升卡那霉素进行3天喷洒处理(每天1次)之后的3周龄‘Micro—Tom’植物。比较用Bam35—Ac转化过的卡那霉素抗性植物(上图)和同龄的野生型敏感植物(下图)。在敏感植物的苗端上形成白色叶片。这些叶片最终死亡，但随后出现的叶片是绿色的，并且植株能存活。
如图4B所示，潮霉素抗性基因表示Ds378—GUS的存在。用Ds378—GUS转化过的植物能抗20微克／毫升潮霉素(图4B，左)，而野生型‘Micro—Tom’是敏感型的(图4B，下右)。
吲哚乙酸水解酶(iaaH)基因能产生对NAM的敏感性。敏感型植物在根基部位形成愈伤组织样组织，并在发芽后大约3周死亡，如图4C所示。用Bam35S—Ac转化过的植物对0．25微克／毫升萘乙酰胺敏感(图4C，左)，而野生型是抗性的(图4C，右)。可将NAM敏感性用作负选择标记，对Bam35S—Ac进行选择，从而稳定新的插入和／或对DsE和DsG上的供体位点进行选择。
ALS基因能在携带未剪切的Ds因子的植物中产生对100ppbchlorosulfuron低的抗性，并能在Ds被切除的植物中产生对2ppmchlorosulfuron的抗性，如图4D所示。生长在100ppb chlorosulfuron上的野生型植物是敏感的(图4D，左)，而用Ds378—GUS转化过的植物具有低的抗性(图4D，中)。
选择用于转座选择的标记的结果如图4所示，对F1(Ds×转座酶)植物进行X—Gluc染色，出现了兰色扇形区(图4E—F)。通过10日龄F1幼苗根中的兰色，证实无启动子GUS报导基因在DsG中是激活的。对开花后2周的、直径为1厘米大的幼小果实进行染色，检测GUS活性(图4F)。在诸如野生型或Bam35S—Ac的亲本的负对照植物中未获得GUS活性(图4F，上)。GUS在某些F1果实中是有活性的(图4F，下)。
因此，以前所披露的拟南芥属的选择特征(Fedoroff和Smith，1993；Sundaresan等，1995)同样适用于‘Micro—Tom’，因此，可被用于转座子标记系统。以前业已披露并比较了产生不连锁的并且稳定的Ds转座的方法，以及用于选择切除和再插入的方法，其中，通常都能获得连锁的转座现象(Sundaresan，1996)。
使用Ds378—GUS和Bam35S—Ac结构获得了该剪切／再插入系统的新的特征，因为其具有鉴定和恢复卡那霉素敏感植物的能力(图4A)。让携带Ds378—GUS的亲本与携带Bam35S—Ac的亲本杂交，选择F2植物对潮霉素的抗性和对卡那霉素的敏感性，可以选择不连锁的、稳定的转座现象，如图4D所示。发生了胚Ds切除现象的F2植物(Bam35S—Ac×Ds378—GUS)能充分地抗chlorosulfuron(图4D，右)，这一特征使得由Fedoroff和Smith(1993)开发的系统适用于番茄。所述双重系统适用于选择连锁的和不连锁的转座。
该系统在番茄中的使用首先包括选择Hygr和Kans植物，由此可以鉴定不连锁的、稳定的转座现象。对于这一类植物来说，NAM选择是不必要的，而且不使用chlorosulfuron，因为含有空的供体位点的T—DNA发生了分离。其次，在Hygr和Kanr植物中选择抗chlorosulfuron的植物，能够鉴定连锁的转座现象。这一类植物多有所述现象，因为Ac具有自然转座的倾向，并且因为消除了某些上述不连锁的转座现象(Hygr，Kans和Chls植物)。
通过对Ds切除足迹进行测序，在分别用Ds378—GUS和Bam35S—Ac转化过的转基因植物之间杂交所产生的F1植物中证实了导入“Micro—Tom”的Ac／Ds系统的活性。在图3中Ds378—GUS结构下面示出的所述足迹，是预期的典型的Ac／Ds足迹。在分析过的4个克隆中，3个具有相同的足迹(GC反向)，如Ac在玉米的wx—m7等位基因，或在拟南芥属(C．Weil，个人通讯)和烟草(Gorbunova和Levy，1997；Shalev和Levy，1997)中产生的。以上结果表明，优势足迹的形成是不依赖于物种的，如Scott等以前所披露的(1996)。另外，在F1植物中的GUS染色特征出现在DsG X Bam35S—Ac的根部(图4E)，在叶片中(未示出)或在Ds378—GUS X Bam35S—Ac幼小果实中(图4F)，表明Ds在植物发育过程中整合到有关基因或附近基因中。在缺少Ac启动子的Ds378—GUS亲本中，仅在幼小果实的不成熟的种子中检测到微弱的GUS活性。
最后，在chlorosulfuron和潮霉素抗性F2植物的Southern印迹分析中证实了转座，所述F2植物是Ds378—GUS X Bam35S—Ac杂交的后代，如图5所示。基因组DNA提取自Ds378—GUS结构纯合的转基因植物(泳道a)；Bam35S—GUS结构纯合的转基因植物(泳道b)；以上两种植物杂交的F1植物(泳道C)；以及所得到的抗2ppm chlorosulfuron和抗潮霉素的F2植物(泳道D—L)。用HindⅢ消化DNA，并在0．8％的琼脂糖凝胶上电泳，转移到尼龙膜上，并与内部1kb GUS探针杂交。箭头指向来自Bam35S—GUS亲本的8kb带。
处理源于含有Ds亲本Ds378—GUS的DNA，用HindⅢ消化能断开Ds的5’末端和GUS基因的5’末端之间的结合，但不能断开T—DNA的左臂(图3)。GUS探针存在于Ds中，揭示了一个Ds亲本的单一8kb带(泳道a)，表明单一的T—DNA拷贝插入该基因组中。正如所预料的，未获得与转座酶亲本的杂交(泳道b)。F2植物表现出可变的杂交方式(图5，泳道d—1)，表明在新的位点上发生了因子切除和再插入。对来自Ds378—GUS和Bam35S—Ac杂交的F2植物进行分析表明，在进行chlorosulfuron抗性试验的22个植物中有11个抗潮霉素，这一点通过在含有潮霉素的培养基上培养时旺盛的根系发育所证实。这使得切除Ac的丢失百分比大约为50％，这一结果类似于以前在玉米(Dooner和Belachew，1989；Greenblatt，1984；McClintock，1956)，烟草(Jones等，1990)，和拟南芥属(Altmann等，1992)上所报导的结果。
例4．小型作物栽培品种的反向遗传学选择小型番茄栽培品种‘Micro—Tom’来生产含有转座子的植物群体。通过在例3中所述的转化方法将图3所示质粒Bam35S—Ac转化到‘Micro—Tom’中。让转化体自交，产生第一亲本植物(品系R2—1—1)，该品系的质粒Bam35S—Ac是纯合的，并表达转座酶活性。按例3所述方法将图3所示质粒Ds378—GUS和图6所示Ds—LUC转入‘Micro—Tom’中。让转化体自交，产生一系列在T—DNA上含有供体Ds的植物。让转座酶和Ds植物杂交，产生F1种子。让F1植物生长而不进行选择，自交产生F2种子。按例3所述方法通过让F2幼苗生长在含有chlorosulfuron、潮霉素和NAM的琼脂培养基上筛选F2种子的稳定转座现象。种植相当于独立转座现象的F2植物，并筛选显性突变。让F2植物自交，并得到F3家族，每一个家族包括源于单一F2植物的12个F3植物，筛选F3家族的隐性突变。
鉴定了含有插入已知核苷酸序列(靶序列)上的Ds的突变型小型植物。从F2植物的叶片中提取DNA。对所述DNA样品进行PCR，用相当于转座子Ds的核苷酸序列的第一引物和相当于所述靶核苷酸序列的核苷酸序列的第二引物进行选择。鉴定并分析了用所述第一和第二引物能产生PCR产物的植物，以便确定转座子插入感兴趣的核苷酸序列对植物表型的影响。
例5．Ds—萤光素酶被命名为Ds—萤光素酶的用于基因捕获的DNA结构如图6所示。类似于Ac的序列用灰色表示，其末端反向重复用灰色箭头表示。该结构的旁侧是相应的T—DNA的右臂(RB)和左臂(LB)。萤光素酶基因(LUC)融合到Ac的左侧末端，从1到252号核苷酸。该片段含有所述末端反向重复，但缺少启动子。卡那霉素抗性(Kanr)或潮霉素抗性是由新霉素磷酸转移酶基因或氨基环醇磷酸转移酶基因产生的。Chlorosulfuron抗性(chlorosulfuronr)是在将Ds从含有Ds378—GUS的结构上切除之后获得的，并且由35S启动子激活了源于拟南芥属的突变型乙酰乳酸合酶基因(Federoff和Smith，1993)。BAR基因产生对除草剂Basta的抗性。
质粒Ds—萤光素酶按以下方法构建用图6所示的上述Ds因子取代位于Ds378—GUS上的Ds因子(图3)，用于取代的Ds因子在Ac臂之间含有萤光素酶和卡那霉素抗性基因。然后将35S启动子—Ds—ALSAsp718片段克隆到二元载体SLJ525(获自Jonathan Jones博士，Norwich，UK)。按例3所述方法将质粒Ds—萤光素酶转入小型番茄栽培品种‘Micro—Tom’。
总共培养了1，000株含有Ds萤光素酶独立转座的植物。在诸如幼苗、花和果实的植物器官中筛选萤光素酶的表达。所述筛选是通过用1mM萤光素喷洒植物组织，然后在完全无光线的条件下显像而进行的。显像是用冷CCDP Princeton仪表用相机进行的，其能检测超低光信号。如图7所示，检测到100个在黑暗中发光的植物，即能在各个组织中表达萤光素酶。在筛选过的1000个植株中，有一个植株的幼苗在正常条件下表达萤光素酶，但通过冷处理能抑制其表达(图7，下图)。为了检测启动子或增强子的特定类型，需要对较大的突变型群体进行筛选。
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权利要求
1．一种筛选具有理想性状的突变型小型植物的方法，包括以下步骤(a)提供一群小型植物，其中，所述小型植物具有下列特征(ⅰ)与同一物种的商业植物相比具有较小的体形；(ⅱ)在比用于同一物种的商业植物的标准生长条件至少高10倍的种植密度下能够成熟，并产生有活力的种子或块茎；和(ⅲ)能够与同一物种的商业植物杂交；(b)通过用突变诱导剂处理所述小型植物在所述小型植物群体中产生突变型小型植物，以便产生诱变型小型植物群体；和(c)在所述诱变的小型植物群体中选择具有所述理想性状的突变型小型植物。
2．如权利要求1的方法，其中，所述小型植物群体是通过天然或诱发突变、通过遗传工程、或通过用植物生长因子处理的方式产生的。
3．如权利要求2的方法，其中，所述小型植物是小型番茄栽培品种。
4．如权利要求1的方法，其中，所述同一物种的商业植物被用于生产粮食、纤维或花卉。
5．如权利要求4的方法，其中，所述同一物种的商业植物是能产生浆果型果实的植物或茄科的植物。
6．如权利要求5的方法，其中，所述能产生浆果型果实的商业植物选自番茄、葡萄、李子、茄子、柑橘类果实、苹果。
7．如权利要求1的方法，其中，步骤(b)中的所述突变诱导剂是选自下列一组的化学诱变剂乙基磺酸乙酯(EMS)、甲基磺酸甲酯(MMS)、甲基—N—亚硝基脲(MNU)和博来霉素。
8．如权利要求1的方法，其中，步骤(b)中的所述突变诱导剂是选自下列一组的射线UV、γ—射线、X—射线、和快速中子。
9．如权利要求1的方法，其中，步骤(b)中的所述突变诱导剂是选自下列一组的可动DNA序列T—DNA和转座因子。
10．如权利要求9的方法，其中，所述转座因子选自自主性转座子、非自主性转座子和自主性转座子／非自主性转座子系统。
11．如权利要求10的方法，其中，所述转座因子是玉米Ac／Ds转座因子。
12．用权利要求1—11任一项所述方法选择的突变型小型植株。
13．如权利要求12的突变型小型植株，其中，所述小型植株是小型番茄栽培品种。
14．一种突变型小型植物群体，其中，所述群体的小型植物具有下列特征(ⅰ)与同一物种的商业植物相比具有较小的体形；(ⅱ)在比用于同一物种的商业植物的标准生长条件至少高10倍的种植密度下能够成熟，并产生有活力的种子或块茎；(ⅲ)能够与同一物种的商业植物杂交；和(ⅳ)具有用一种制剂诱导的突变，该制剂是化学诱变剂、射线、或可动DNA序列。
15．如权利要求14的突变型小型植物，其中，所述同一物种的商业植物被用于生产粮食、纤维或花卉。
16．如权利要求15的突变型小型植物群体，其中，所述同一物种的商业植物是能产生浆果型果实的植物或茄科的植物。
17．如权利要求16的突变型小型植物群体，其中，所述产生浆果型果实的商业植物选择番茄、葡萄、李子、茄子、柑橘类果实、苹果。
18．一种鉴定含有插入感兴趣的基因的可动DNA序列的小型植物的方法，包括以下步骤(a)提供一群小型植物，其中，所述小型植物具有下列特征(ⅰ)与同一物种的商业植物相比具有较小的体形；(ⅱ)在比用于同一物种的商业植物的标准生长条件至少高10倍的种植密度下能够成熟，并产生有活力的种子或块茎；和(ⅲ)能够与同一物种的商业植物杂交；(b)通过用可动DNA序列处理所述植物在所述小型植物群体中产生突变型植物；(c)通过PCR筛选从所述突变型植物中提取的DNA，使用具有相当于所述可动DNA序列的核苷酸序列的第一引物和相当于所述感兴趣的基因的核苷酸序列的第二引物；和(d)鉴定包括能在有所述第一和第二引物的条件下产生PCR产物的DNA的小型植物。
19．如权利要求18的方法，其中，所述小型植物是小型番茄栽培品种。
20．如权利要求18的方法，其中，所述可动DNA序列选自T—DNA或转座因子。
21．如权利要求20的方法，其中，所述转座因子是玉米Ac／Ds转座因子。
22．一种生产突变型小型植物群体的方法，包括以下步骤(a)提供一群小型植物，其中，所述小型植物具有下列特征(ⅰ)与同一物种的商业植物相比具有较小的体形；(ⅱ)在比用于同一物种的商业植物的标准生长条件至少高10倍的种植密度下能够成熟，并产生有活力的种子或块茎；和(ⅲ)能够与同一物种的商业植物杂交；和(b)通过用一种突变诱导剂处理所述小型植物在所述小型植物群体中产生所述突变植物，以便产生所述小型作物栽培品种的突变群体。
23．如权利要求22的方法，其中，所述小型植物群体是通过天然或诱发突变、通过遗传工程、或通过用植物生长因子处理的方式产生的。
24．如权利要求22的方法，其中，步骤(b)中的所述突变诱导剂是选自下列一组的化学诱变剂乙基磺酸乙酯(EMS)、甲基磺酸甲酯(MMS)、甲基—N—亚硝基脲(MNU)和博来霉素。
25．如权利要求22的方法，其中，步骤(b)中的所述突变诱导剂是选自下列一组的射线UV、γ—射线、X—射线、和快速中子。
26．如权利要求22的方法，其中，步骤(b)中的所述突变诱导剂是选自下列一组的可动DNA序列T—DNA和转座因子。
27．如权利要求26的方法，其中，所述突变诱导剂是T—DNA，并用农杆菌属感染所述小型植物，从而产生多个转化体，其中，每一个转化体包括一个插入不同基因组位点的T—DNA。
28．如权利要求26的方法，其中，所述突变诱导剂是转座子，而所述突变型小型植物群体是从含有活性转座系统的小型植物的后代获得的。
29．如权利要求28的方法，其中，所述活性转座系统是植物固有的转座子或通过遗传工程技术导入所述植物的转座子。
30．如权利要求29的方法，其中，所述活性转座系统选自自主性转座子，而转座因子是通过让含有非自主性转座子的植物与转座酶源或与含有自主性转座子的植物杂交获得的。
31．如权利要求29的方法，其中，所述转座因子包括玉米Ac／Ds转座子系统。
32．如权利要求22—31的方法，其中，所述小型植物是小型番茄栽培品种。
33．一种鉴定控制植物基因表达的核苷酸序列的方法，包括以下步骤(a)用一种DNA结构转化一种小型植物，以便产生一个随机诱变植物的群体，其中，所述DNA结构包括一个编码选择标记的基因序列，该基因缺少启动子或者含有一个最小启动子，所述基因序列克隆到可动DNA序列的臂内，其中，所述小型植物具有下列特征(ⅰ)与同一物种的商业植物相比具有较小的体形；(ⅱ)在比用于同一物种的商业植物的标准生长条件至少高10倍的种植密度下能够成熟，并产生有活力的种子或块茎；和(ⅲ)能够与同一物种的商业植物杂交；(b)在所述植物群体中鉴定由所述DNA结构转化的并能表达所述选择标记的小型植物；和(c)克隆所述核苷酸序列，该序列可操作地连接于从在步骤(b)中鉴定的所述转化小型植物中提取的总DNA的编码所述选择标记的基因上。
34．如权利要求33的方法，其中，所述选择标记选自GUS和萤光素酶。
35．如权利要求33或34的方法，其中，所述可动DNA序列是T—DNA或转座因子。
36．如权利要求33的方法，其中，所述控制植物基因表达的核苷酸序列是启动子或增强子。
37．一种生产具有理想性状的突变型商业植物群体的方法，包括以下步骤(a)让按照权利要求1的方法选择的具有所述理想性状的所述突变型小型植物与同一物种的商业植物杂交；和(b)选择与所述商业亲本植物相似并表达所述理想性状的后代。
38．如权利要求37的方法，其中，所述商业植物被用于生产粮食、纤维或花卉。
39．如权利要求38的方法，其中，所述商业植物是能产生浆果型果实的植物或茄科的植物。
40．如权利要求39的方法，其中，所述能产生浆果型果实的商业植物选自番茄、葡萄、李子、茄子、柑橘类果实、苹果。
41．一种用权利要求37的方法生产的具有理想性状的商业植物。
42．如权利要求41的商业植物，其中，所述商业植物被用于产生粮食、纤维或花卉。
43．如权利要求42的商业植物，其中，所述商业植物是能产生浆果型果实的植物或茄科的植物。
44．如权利要求43的方法，其中，所述能产生浆果型果实的商业植物选自番茄、葡萄、李子、茄子、柑橘类果实、苹果。
全文摘要
本发明可以在作物中迅速并大规模产生突变体。这一目的是通过使用能够与同物种的商业植物杂交的小型植物实现的。在所述小型栽培品种中诱发突变,然后在所得到的突变型植物群体中鉴定突变体。通过让选择的突变型小型植物与商业栽培品种杂交,将感兴趣的突变基因逐渐渗透到商业栽培品种中。可以用含有随机T－DNA或转座子插入现象的小型作物的植物群体进行反向遗传学,并选择该群体中所插入的感兴趣的基因。类似地,用一种DNA结构转化所述小型植物群体,该DNA结构包括位于一个可动DNA上的无启动子选择标记基因。由该结构衍生的突变体可以通过所述选择标记基因的表达快速选择,并克隆了所述转化体中的可操作地连接于所述选择标记基因上的启动子。
文档编号A01H1/04GK1278701SQ98811051
公开日2001年1月3日 申请日期1998年9月10日 优先权日1997年9月11日
发明者A·A·莱维, R·梅斯纳, Y·艾金德 申请人:耶达研究及发展有限公司, 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司