一种三叶青抗病促生的生物防治方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物防治肥的制备领域，具体涉及一种三叶青抗病促生的生物防治方 法。
【背景技术】
[0002] 三叶青正名三叶崖爬藤（学名：TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg)，又名 金线吊葫芦、蛇附子、石老鼠，属鼠李目，葡萄科草质藤本。全草均可入药，以地下块根和果 实的药用效果最好。三叶青每年5月份开花至秋季未结果，花期较长，果实为绿豆般大小， 色泽鲜红艳丽，味甘、性凉，具有滋补功效，属极品。分布于浙江、江西、福建、湖北、湖南、广 东、广西、四川等地区。
[0003] 危害三叶青主要病害是叶斑病，链格孢（Alternariaalternata)是主要病原菌之 一。植物病理真菌主要存在于土壤中，在植物生长中感染植物，引起植物病害、造成生产损 失。因此，要从生物防治的角度消除植物真菌病害，除了杀灭植株上的病理真菌，杀灭或抑 制土壤中的病理真菌也至关重要，而使用具有生物防治功效的生物肥是实现这一目的的有 效途径。在各种生物肥中，长久以来我国应用的都是无芽孢菌类。但是无芽孢菌抗逆性低， 对于干燥高温的抵抗能力差，所以当制成液体或者吸附剂时稳定性不高。生物肥发展的新 趋势应是大力发展抗逆性高、能够长期稳定生存的芽孢杆菌。特别是芽孢杆菌能够产生多 种抗真菌物质，对植物病原菌有显著抑制作用，并且对人畜无害，也不会污染环境，将在防 治植物真菌病害中起重要作用。
[0004] 芽孢杆菌形态上呈直或者近直的杆状，好氧或者兼性厌氧，革兰氏阳性，在特定环 境条件下能产生抗逆性内生孢子。芽孢杆菌在植物中广泛定殖，被认为是公认的食品级安 全微生物（generallyregardedassafety,GRAS)。枯草芽抱杆菌是一种典型的芽孢杆菌， 产生抗菌蛋白、多肽类物质、脂类物质及beta葡聚糖酶等抗菌物质，特别是beta葡聚糖酶 等水解酶类与其抗植物病理真菌能力有密切关系，因为真菌细胞壁的组成是葡聚糖。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种三叶青抗病促生的生物防治法，通过将产beta葡聚糖酶的枯 草芽孢杆菌（CICC10339)融入三叶青天然菌群中，制成能够通过生物防治途径有效抑制 杀灭三叶青病理真菌的生物肥。
[0006] -种三叶青抗病促生的生物防治方法，包括以下步骤：
[0007] 1)将枯草芽孢杆菌（CICC10339)进行培养，制成密度109~10 1(lCfu/mL的高密度 菌悬液；
[0008] 2)将三叶青健康枝条剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌 悬液，堆肥结束后进行发酵，经发酵后得到能有效抑制杀灭三叶青病理真菌的生物肥，将该 生物肥用在三叶青抗病促生上。
[0009] 本发明中，将三叶青健康枝条剪成小节堆肥，使所制备生物肥中的菌群即为健康 三叶青植株本身天然菌群，此菌群与三叶青植株协同进化生长，形成了互益共生体系，对病 害真菌有一定生物防治作用。进一步地，将能够产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌（CICC 10339)加入堆肥中，显著加强对三叶青病害真菌的生物防治作用。枯草芽孢杆菌（CICC 10339)由于产beta葡聚糖酶，对三叶青植株纤维有良好分解作用，为堆肥发酵过程所必 须，故能够充分融入到堆肥菌群中稳定持久地增殖。如同乳酸菌对于动物的益生作用，抑制 杀灭植物病理真菌的微生物可以称之为植物益生菌。本发明所制备生物肥中，枯草芽孢杆 菌（CICC10339)即是三叶青益生菌，对三叶青病理真菌有显著生物防治作用。
[0010] 步骤1)中，枯草芽孢杆菌（CICC10339)采用现有技术，来自中国工业微生物菌 种保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼；保藏日期为2007 年，菌种保持编号为10339。枯草芽孢杆菌（CICC10339)可以向中国工业微生物菌种保藏 管理中心购买。
[0011] 将枯草芽孢杆菌（CICC10339)进行培养，包括：枯草芽孢杆菌（CICC10339)的出 发密度为1〇6~1〇7个/mL，接种至液体培养基中接种量为1%~5%，33°C~39°C振荡培养 20~28h，至菌液密度为109~10 1(lCfu/mL的高密度菌悬液。
[0012] 进一步优选，将枯草芽孢杆菌（CICC10339)进行培养，包括：枯草芽孢杆菌（CICC 10339)的出发密度为106~107个/mL，接种至液体培养基中接种量为2%~3%，36°C~ 37°C振荡培养22~26h，至菌液密度为109~10 1(lCfu/mL的高密度菌悬液。
[0013] 所述的液体培养基，以1L计，包括以下组分：
[0014]
【主权项】
1. 一种三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将枯草芽孢杆菌CICC10339进行培养，制成密度IO9~10ltlCfuAiL的高密度菌悬 液； 2) 将三叶青健康枝条剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液， 堆肥结束后进行发酵，经发酵后得到能有效抑制杀灭三叶青病理真菌的生物肥，将该生物 肥用在三叶青抗病促生上。
2. 根据权利要求1所述的三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，步骤1)中，将 枯草芽孢杆菌CICC10339进行培养，包括：枯草芽孢杆菌CICC10339的出发密度为IO6~ IO7个/mL，接种至液体培养基中接种量为1%~5%，33°C~39°C振荡培养20~28h，至菌 液密度为IO9~10iciCfuAiL的高密度菌悬液。
3. 根据权利要求2所述的三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，步骤1)中，将 枯草芽孢杆菌CICC10339进行培养，包括：枯草芽孢杆菌CICC10339的出发密度为IO6~ IO7个/mL，接种至液体培养基中接种量为2%~3%，36°C~37°C振荡培养22~26h，至菌 液密度为IO9~10lclcfu/mL的高密度菌悬液。
4. 根据权利要求2或3所述的三叶青抗病促生的生物防治制备方法，其特征在于，所述 的液体培养基，以IL计，包括以下组分：
5. 根据权利要求4所述的三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，所述的液体 培养基，以IL计，包括以下组分：
6. 根据权利要求1所述的三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，步骤2)中，堆 肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到30°C~34°C时，喷施 步骤1)中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到41°C~45°C时堆肥结束。
7. 根据权利要求6所述的三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，步骤2)中，堆 肥过程中喷施步骤1)中的高密度菌悬液，包括：在堆肥内部温度达到32°C时，喷施步骤1) 中的高密度菌悬液，继续堆肥，待堆肥内部温度达到43°C时堆肥結束。
8. 根据权利要求1所述的三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，步骤2)中，堆 肥结束后，将堆肥搅拌摊凉。
9.根据权利要求1所述的三叶青抗病促生的生物防治方法，其特征在于，步骤2)中，所 述的发酵采用自然状态下发酵。
【专利摘要】本发明公开了一种三叶青抗病促生的生物防治方法，包括：将枯草芽孢杆菌制成密度109～1010cfu/mL的高密度菌悬液；将三叶青健康枝条剪成小段进行堆肥，堆肥过程中喷施枯草芽孢杆菌高密度菌悬液，经发酵后得到能有效抑制杀灭三叶青病理真菌的生物肥，将该生物肥用在三叶青抗病促生上。本发明中，产beta葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌是对三叶青起抗病促生作用的植物益生菌，将其加入堆肥中，显著加强对三叶青病害真菌的生物防治作用，并提高三叶青产量。堆肥过程处理简便，无废水排放，投资少、能耗低、易操作，易于工业化大规模生产，具有良好的经济效益和广阔的应用前景。
【IPC分类】A01N63-02, A01P3-00, A01G13-00, C05F17-00
【公开号】CN104620914
【申请号】CN201510059454
【发明人】吴渊, 胡慧雯, 徐薇薇, 阮晖, 梁莹, 许丽珍, 吴孔华, 莫建平, 史金昕波, 缪丹, 俞雨, 吴盛彬, 徐腾洋
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月4日