一种促进三叶青愈伤组织总黄酮合成的培养基的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物领域，具体而言，涉及一种促进三叶青愈伤组织总黄酮合成的培 养基。
【背景技术】：
[0002] 三叶青（Tetrastigma hemsleyanum)，又名三叶对（《浙江民间常用草药》），蛇附 子（《植物名实图考》）等，属于葡萄科崖爬藤属多年生草质藤本植物。三叶青产江苏、浙 江、福建、江西、台湾、广西、湖北、广东、湖南、贵州、四川、云南、西藏。生于山坡灌丛、溪边林 下岩石缝中，海拔300-1300米。三叶青以块根或全草入药，研宄表明三叶青中的化学成分 黄酮在其发挥药效方面起到重要作用，其对多种肿瘤具有促凋亡的作用。三叶青黄酮抗肿 瘤的机制主要有促进细胞凋亡，提高免疫力和抗氧化作用。目前，三叶青黄酮的抗癌作用正 逐渐受到关注。
[0003] 近些年，由于不合理的狂采滥挖加之对生长环境要求苛刻，三叶青野生资源濒临 灭绝，人工栽培难度大，市场供需矛盾凸显。利用植物组织培养技术来生产药用次生代谢产 物，是未来利用此资源的一个途径，但三叶青组织培养研宄中会出现愈伤组织中总黄酮含 量较低的问题，因此获得一种能显著促进三叶青愈伤组织中总黄酮合成的培养基，是能满 足市场需求，降低生产成本的有效途径。
[0004] 稀土元素一般指元素周期表中的镧系和钪、钇共17中元素的总称。稀土元素对植 物生长相关方面的促进作用引起了研宄人员把稀土元素应用到植物组织培养体系中的兴 趣。文献表明，低浓度的稀土元素应用于组培体系后会促使愈伤组织的增殖和相关代谢产 物的合成，稀土的这种效应可能是通过影响细胞内钙信号的变化来调控相关次生代谢产物 合成的。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的是提供一种促进三叶青愈伤组织总黄酮合成的培养基，以提高愈伤 组织总黄酮的含量。该培养基的组成包括：基础培养基和稀土元素。
[0006] 所述基础培养基的组分及含量为：
[0007] KNO3 80-2900mg/L，NH4NO3 105-1520mg/L，KH2PO4 19-410mg/L，MgSO4 ? 7H20 240-750mg/L，CaCl2 ? 2H20 145-460mg/L，KCl0-67mg/L，KI0? 7-1.7mg/L，H3BO3 0? 7-6. 3mg/L，MnSO4 ? 4H20 4_25mg/L，ZnSO4 ? 7H20I. 5-8. 6mg/L，Na2MoO4 ? 2H20 〇-〇? 28mg/ L，CuSO4 ? 5H20 0-0? 35mg/L，CoCl2 ? 6H20 0-0? 03mg/L，Na2-EDTA0-38mg/L，FeSO4 ? 7H20 24-29mg/L，肌醇0-100mg/L，甘氨酸0-2. 5mg/L，Vbi 0? 1-11.Omg/L，Vb6 0? 4-1. 2mg/L， 烟酸0? 3-1. 5mg/L，6-苄基腺嘌呤（以下简称6-BA) 2. 0-3.Omg/L，萘乙酸（以下简称 NAA)0. 2-0. 5mg/L，蔗糖20-30g/L，琼脂4. 0-7. 0g/L。
[0008] 所述的稀土元素为钕、铈或二者组成的混合物，总浓度为0. 01-0. 2mM，加入形式为 其盐溶液，混合稀土的摩尔比为钕：铈= 1-35 : 1-45。
[0009] 本发明一种促进三叶青愈伤组织总黄酮合成的培养基定为A培养基，其配制为现 有配制方法，其中稀土元素亦是配成母液后，吸取相应的体积。
[0010] 三叶青愈伤组织中总黄酮的测定方法为：取稀土处理30d的愈伤组织，除去琼脂， 称重，把愈伤组织切成小块，置于50°C烘箱中，烘至恒重，记录恒重值。把干燥至恒重的愈 伤组织粉粹，称取0.1 g的粉末，记录实际称取量，放入IOmL dorf管中，加入5. OOmL 50% 乙醇，超声提取3h，离心，4000rpm，IOmin留取上清液即得供试品溶液。测定总黄酮含量时 精密量取供试品溶液3. OOmL至25mL的容量瓶中，加入50 %乙醇至6. OOmL，然后分别加入 1.0 OmL 5% NaNO2,1. OOmL 10% Al (NO3)3,10.0 OmLlO % NaOH，每次间隔 6min，最后用 50 % 乙 醇定容，摇匀后放置20min，即可用紫外分光光度计测定500nm处的吸光值。在绘制标准曲 线时，以芦丁为对照品，所得到的回归方程为Y = 11. 648C-0. 0018, R2= 0. 9992。其中，Y 代表总黄酮的吸光值，C代表总黄酮的浓度（mg/mL)。
[0011] 三叶青愈伤组织中总黄酮的含量S = (CNV/W) X 100% ;
[0012] 其中，S为三叶青总黄酮含量)，N为稀释倍数，V为提取液体积（mL)，W为愈伤 组织干重（mg)。
[0013] 本发明的有益之处：采用此培养基能使三叶青愈伤组织总黄酮含量增加，可为工 业化生产三叶青黄酮提供原料而且可保护三叶青野生资源。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1
[0015] 取三叶青的叶片，用洗衣粉溶液浸泡5min，流水冲lh，于无菌超净工作台上用 75 %酒精消毒30s，无菌水洗3次，再于0. 15 %氯化采中消毒6min，无菌水洗6次，用解剖刀 将已消毒后的叶片切成1平方厘米的小片，接种于1/2MS培养基中，此培养基中含有2. Omg/ L的6-BA和0. 2mg/L的NAA，培养温度为25± 1°C，暗培养，20-25d后长出三叶青愈伤组织。
[0016] 把获得的三叶青愈伤组织继代于上述培养基中生长20d进行后续研宄，培养温度 为25±1°C，暗培养。
[0017] 将继代培养20d的三叶青愈伤组织接种至A培养基中生长，A培养基的组成为：
[0018] KNO3 80mg/L，NH4NO3 105mg/L，KH2PO4 19mg/L，MgSO4?7H20 240mg/L，CaCl2?2H20 145mg/L，KI 0? 7mg/L，H3BO3 0? 7mg/L，MnSO4 ? 4H20 4mg/L，ZnSO4 ? 7H20 I. 5mg/L， Na2MoO4 ? 2H20 0? 12mg/L，CuSO4 ? 5H20 0? 13mg/L，CoCl2 ? 6H20 0? 01mg/L，Na2-EDTA25mg/L， FeSO4 ? 7H20 24mg/L，肌醇 20mg/L，甘氨酸 0? 5mg/L，VB1 0? lmg/L，VB6 0? 4mg/L，烟酸 0? 3mg/ L，6-苄基腺嘌呤2. 0mg/L，萘乙酸0. 2mg/L，蔗糖20g/L，琼脂4. 2g/L，所加稀土元素为钕 (Nd3+用量如下表），培养温度25± 1°C，暗培养，培养周期为30d。
[0019] 培养结束后测定三叶青愈伤组织中总黄酮的含量，结果见表1。
[0020] 表1不同浓度的Nd3+对三叶青愈伤组织总黄酮含量的影响
[0021]
【主权项】
1. 一种促进三叶青愈伤组织总黄酮合成的培养基，其特征在于该培养基的组成包括： 基础培养基和稀土元素。
2. 如权利要求1所述的一种促进三叶青愈伤组织总黄酮合成的培养基，其特征在于， 所述基础培养基的组分及含量为： KNO3 80-2900mg/L，NH4NO3 105-1520mg/L，KH2PO4 19-410mg/L，MgSO4 ? 7H20240-750mg/ L，CaCl2 ? 2H20 145-460mg/L，KCl 0-67mg/L，KI 0? 7-1. 7mg/L，H3BO3 0? 7-6. 3mg/L， MnSO4 ? 4H20 4-25mg/L，ZnSO4 ? 7H20 I. 5-8. 6mg/L，Na2MoO4 ? 2H20 0-0? 28mg/L，CuSO4 ? 5H20 0-0? 35mg/L，CoCl2 ? 6H20 0-0? 03mg/L，Na2-EDTA 0-38mg/L，FeSO4 ? 7H20 24-29mg/L，肌醇 0-100mg/L，甘氨酸0-2. 5mg/L，VB1 0? 1-11. Omg/L，VB6 0? 4-1. 2mg/L，烟酸0? 3-1. 5mg/L， 6_苄基腺嘌呤2. 0-3. Omg/L，萘乙酸0? 2-0. 5mg/L，蔗糖20-30g/L，琼脂4. 0-7. Og/L。
3. 如权利要求I所述的一种促进三叶青愈伤组织总黄酮合成的培养基，其特征在于， 所述的稀土元素为钕、铈或二者组成的混合物，总浓度为〇. 01-0. 2mM，加入形式为其盐溶 液，混合稀土的摩尔比为钕：铈= 1-35 : 1-45。
【专利摘要】本发明公开了一种促进三叶青愈伤组织总黄酮合成的培养基，该培养基是由基础培养基和稀土元素组成，使用该培养基可明显促进三叶青愈伤组织总黄酮的合成。本发明不仅可为工业化利用三叶青黄酮提供原料，也有利于三叶青野生资源的保护。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104756875
【申请号】CN201510226422
【发明人】余伯阳, 张剑, 张腾腾, 彭昕
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年5月4日