一种暗紫贝母组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种暗紫贝母组织培养方法。
【背景技术】
[0002]暗紫贝母是我国特有的名贵中药材，为百合科贝母属草本植物，以地下鳞茎入药。有清热润肺、化痰止咳功效，用于治疗感冒咳嗽、肺热燥咳、干咳少痰等症状。暗紫贝母主要生长在海拔2800?4500米的高山高原草地上，生长周期缓慢，对环境条件要求十分苛刻，其价格昂贵，其野生资源已濒临枯竭。因此，暗紫贝母长期存在供不应求的问题。
[0003]目前，暗紫贝母主要采用鳞茎和种子繁殖，鳞茎繁殖法用种量大且繁殖系数低，一般I个鳞茎只能收1.5?1.6个鳞茎。种子繁殖成苗率低，速度慢，需要5?6年才能发育成商品鳞茎的大小。而通过组织培养技术可提高暗紫贝母的繁殖速度，扩大繁殖系数，大大缩短了鳞茎的形成年限，只要6个月左右的时间就可以得到供做药用的鳞茎。因此，本发明以暗紫贝母鳞片为外植体，通过外植体消毒、不定芽诱导、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程获得了暗紫贝母离体再植株，建立了有效的暗紫贝母组培快繁殖技术体系，短时期内即可生产大量种苗，提高繁殖效率，降低生产成本，有利加快其繁育及推广。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供出一种暗紫贝母组织培养方法，本发明以暗紫贝母鳞片为外植体，通过外植体消毒、不定芽诱导、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程获得了暗紫贝母离体再植株，建立了有效的暗紫贝母组培快繁殖技术体系，从而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种暗紫贝母组织培养方法，包括以下的步骤:
(I)外植体消毒:以暗紫贝母鳞茎为外植体，先75%乙醇浸泡15?30s，
无菌水冲洗3?5次，再用10%?20%次氯酸钠溶液浸泡20?30min，无菌水冲洗3?5次后备用。
[0006](2)诱导培养:将步骤(I)处理好的暗紫贝母鳞茎切成0.5cm左右的切块并接种于诱导培养基中进行不定芽诱导。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为1000?20001x，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计诱导率。
[0007](3)增殖培养:以步骤(2)诱导得到不定芽作为材料，将老化的和生长不良的不定芽去掉，并将生长状态良好的不定芽切成单芽并转入增殖培养基进行扩繁。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?30001x，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计增殖情况。
[0008](4)生根培养:将经步骤(3)后得到的生长较一致且健壮的未生根的无菌苗单株切下转入生根培养基诱导。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?30001x，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计生根情况。
[0009](5)炼苗移栽:将生根的无菌苗从培养室中取出放在室外炼苗30天后，再将生根苗从瓶中取出洗去基部的培养基，然后移栽到经过高温灭菌的基质(泥炭土:珍珠岩:蛭石=3:1:1)中，定期浇浇1/2MS大量元素营养液，覆盖薄膜，10天后揭膜，揭膜后20天统计成活率。
[0010]上述步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+1.0?5.0mg/L ΝΑΑ+0.1?1.0mg/L6-BA+0.5 ?lmg/L AC+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0011]上述步骤(3)所述的增殖培养基为:MS+0.1?1.0mg/L 6 一 ΒΑ+0.1?1.0mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0012]上述步骤(4)所述的生根培养基为:l/2MS+0.1?0.5mg/LNAA+15?30g/L蔗糖+3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0013]本发明的优点是以暗紫贝母鳞片为外植体，通过外植体消毒、不定芽诱导、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程获得了暗紫贝母离体再植株，建立了有效的暗紫贝母组培快繁殖技术体系。
【具体实施方式】
[0014]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0015]实施例1
(I)外植体消毒:以暗紫贝母鳞茎为外植体，先75%乙醇浸泡15s，
无菌水冲洗3次，再用10%次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水冲洗3次后备用。
[0016](2)诱导培养:将步骤(I)处理好的暗紫贝母鳞茎切成0.5cm左右的切块并接种于诱导培养基中进行不定芽诱导。接种后置于每天光照12小时，光照强度为ΙΟΟΟΙχ，置于培养温度为25°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后诱导率达到85.7%。所述的诱导培养基为:MS+1.0mg/L NAA+0.lmg/L 6-BA+0.5mg/L AC+15g/L 蔗糖 +3.5g/L 琼脂，pH 为
5.4。
[0017](3)增殖培养:以步骤(2)诱导得到不定芽作为材料，将老化的和生长不良的不定芽去掉，并将生长状态良好的不定芽切成单芽并转入增殖培养基进行扩繁。接种后置于每天光照12小时，光照强度为20001x，置于培养温度为25°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后增殖系数达到5.86。所述的增殖培养基为:MS+0.lmg/L 6 一 BA+0.1mg/LNAA+15g/L 蔗糖 +3.5g/L 琼脂，pH 为 5.4。
[0018](4)生根培养:将经步骤(3)后得到的生长较一致且健壮的未生根的无菌苗单株切下转入生根培养基诱导。接种后置于每天光照12小时，光照强度为20001χ，置于培养温度为25°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后生根率达到91.8%。所述的生根培养基为:l/2MS+0.lmg/LNAA+15g/L 蔗糖 +3.5g/L 琼脂，pH 为 5.4。
[0019](5)炼苗移栽:将生根的无菌苗从培养室中取出放在室外炼苗30天后，再将生根苗从瓶中取出洗去基部的培养基，然后移栽到经过高温灭菌的基质(泥炭土:珍珠岩:蛭石=3:1:1)中，定期浇浇1/2MS大量元素营养液，覆盖薄膜，10天后揭膜，揭膜后20天成活率达到93.4%。
[0020]实施例2
(I)外植体消毒:以暗紫贝母鳞茎为外植体，先75%乙醇浸泡25s， 无菌水冲洗5次，再用15%次氯酸钠溶液浸泡25min，无菌水冲洗4次后备用。
[0021](2)诱导培养:将步骤(I)处理好的暗紫贝母鳞茎切成0.5cm左右的切块并接种于诱导培养基中进行不定芽诱导。接种后置于每天光照13小时，光照强度为20001χ，置于培养温度为27°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后诱导率达到93.7%。所述的诱导培养基为:MS+3.0mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L AC+25g/L 蔗糖 +3.5g/L 琼脂，pH 为
5.4。
[0022](3)增殖培养:以步骤(2)诱导得到不定芽作为材料，将老化的和生长不良的不定芽去掉，并将生长状态良好的不定芽切成单芽并转入增殖培养基进行扩繁。接种后置于每天光照14小时，光照强度为30001χ，置于培养温度为27°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后增殖系数达到6.92。所述的增殖培养基为:MS+0.5mg/L 6 一 BA+0.2mg/LNAA+15g/L 蔗糖 +4.5g/L 琼脂，pH 为 5.4。
[0023](4)生根培养:将经步骤(3)后得到的生长较一致且健壮的未生根的无菌苗单株切下转入生根培养基诱导。接种后置于每天光照13小时，光照强度为20001χ，置于培养温度为25°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后生根率达到94.1%。所述的生根培养基为:l/2MS+0.3mg/LNAA+18g/L 蔗糖 +4.0g/L 琼脂，pH 为 5.4。
[0024](5)炼苗移栽:将生根的无菌苗从培养室中取出放在室外炼苗30天后，再将生根苗从瓶中取出洗去基部的培养基，然后移栽到经过高温灭菌的基质(泥炭土:珍珠岩:蛭石=3:1:1)中，定期浇浇1/2MS大量元素营养液，覆盖薄膜，10天后揭膜，揭膜后20天成活率达到91.8%ο
【主权项】
1.一种暗紫贝母组织培养方法，其特征在于包括以下步骤: (1)外植体消毒:以暗紫贝母鳞茎为外植体，先75%乙醇浸泡15?30s， 无菌水冲洗3?5次，再用10%?20%次氯酸钠溶液浸泡20?30min，无菌水冲洗3?.5次后备用； (2)诱导培养:将步骤(I)处理好的暗紫贝母鳞茎切成0.5cm左右的切块并接种于诱导培养基中进行不定芽诱导，接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为1000?20001x，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计诱导率； (3)增殖培养:以步骤(2)诱导得到不定芽作为材料，将老化的和生长不良的不定芽去掉，并将生长状态良好的不定芽切成单芽并转入增殖培养基进行扩繁，接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?30001x，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计增殖情况； (4)生根培养:将经步骤(3)后得到的生长较一致且健壮的未生根的无菌苗单株切下转入生根培养基诱导，接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?30001χ，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计生根情况； (5)炼苗移栽:将生根的无菌苗从培养室中取出放在室外炼苗30天后，再将生根苗从瓶中取出洗去基部的培养基，然后移栽到经过高温灭菌的基质(泥炭土:珍珠岩:蛭石=.3:1:1)中，定期浇浇1/2MS大量元素营养液，覆盖薄膜，10天后揭膜，揭膜后20天统计成活率。
2.根据权利要求1所述的一种暗紫贝母组织培养方法，其特征在于步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+1.0 ?5.0mg/L ΝΑΑ+0.1 ?1.0mg/L 6-BA+0.5 ?lmg/L AC+15 ?30g/L 鹿糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
3.根据权利要求1所述的一种暗紫贝母组织培养方法，其特征在于步骤(3)所述的增殖培养基为:MS+0.1 ?1.0mg/L 6 — ΒΑ+0.1 ?1.0mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L琼脂，pH为5.4?5.8。
4.根据权利要求1所述的一种暗紫贝母组织培养方法，其特征在于步骤(4)所述的生根培养基为:l/2MS+0.1 ?0.5mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?.5.8
【专利摘要】本发明公开了一种暗紫贝母组织培养方法，暗紫贝母（Fritillaria unibracteata Hsiao）为百合科贝母属药用植物，以地下鳞茎入药，具有清热散结，化痰止咳等功效。因野生的暗紫贝母多生长于海拔较高的地区，生长期长，资源缺乏。因而药用暗紫贝母长期存在着供不应求的问题。本发明以暗紫贝母鳞片为外植体，通过外植体消毒、不定芽诱导、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等过程获得了暗紫贝母离体再植株，建立了有效的暗紫贝母组培快繁殖技术体系，短时期内即可生产大量种苗，提高繁殖效率，降低生产成本，有利加快其繁育及推广。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104782488
【申请号】CN201510216173
【发明人】冯文杰
【申请人】冯文杰
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月2日