一种玉米灰斑病的接种方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物灰斑病的接种方法，具体涉及一种玉米灰斑病的接种方法。
【背景技术】
[0002] 玉米灰斑病是玉米生产区主要病害之一，随着灰斑病在玉米生产造成的危害逐年 加重，对于玉米灰斑病的研究也在不断深入。近年来，针对玉米灰抗斑病的研究主要涵盖了 灰斑病致病机理研究、病原菌致病性研究、植株抗病性鉴定及抗性基因定位及克隆等方面， 上述研究的开展均依赖赖于通过自然接种或人工接种方式来实现病原菌对玉米植株进行 侵染，进而引发病害，从而便于研究人员跟踪调查发病全程。
[0003]目前，玉米灰斑病的发生对气温和空气湿度有较高要求，自然接种和人工接种的 方式均存在各自的不足，因而不能完全满足试验的要求。其中，自然接种是在玉米灰斑病流 行区域内种植待接种的玉米材料，待环境温度及相对湿度适宜时，由残留在环境中的灰斑 病病原菌对鉴定材料进行侵染进而引发病害。自然接种侵染植株受到季节、地域及年度病 害流行情况等因素限制，只能够在符合玉米生长的特定季节（如春、夏季）及适宜该病害发 生的地域内进行田间鉴定。该接种方法对于空气温度和相对湿度无法调控，从而影响接种 效果；同时自然接种试验人员无法准确掌握接种时间及侵染发生时间，无法观察收集接种 前与接种后特定时间节点被侵染植株在生理生化指标上的变化。人工接种需要对灰斑病病 原菌进行人工分离、培养，在大田或大棚环境条件下，通过人工喷施、注射带菌液或接入带 菌载体到植株体的方式完成接种，并诱发植株发病，该接种方法虽能够准确掌控接种时间， 也能够通过病原菌分离培养步骤获得纯化后灰斑病病原菌，但人工接种侵染植株受到季节 和地域的限制，只能够在符合玉米生长的特定季节（如春、夏季）进行田间鉴定，面临植株 接种后空气温度和相对湿度变化无法调控影响，接种寄主难以发病，接种成功率不高的问 题；此外，灰斑病病原菌人工条件下生长缓慢，培养期间易受污染也是限制人工接种成功率 的原因之一。
[0004] 因此，如何提高玉米灰斑病的接种成功率，为灰斑病研究提供一种稳定可靠（不 受季节、外部环境和地域等因素的限制）的可控制接种时间的高成功率地人工接种方法成 为了一个亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种稳定可靠的玉米灰斑病可控制接种时间 的高成功率地人工接种方法。
[0006] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种玉米灰斑病的接种方法，包括以 下步骤：
[0007] (1)喇叭口期玉米植株移栽：将喇叭口期玉米植株（优选小喇叭口期玉米植株） 带土移栽至直径40~60cm，深50~70cm的花盆中；
[0008] (2)模拟环境下培养：将移植植株放置于人工气候培养箱中，设定环境温度为 20~30°C (优选25°C )，相对湿度为90~100% (优选95% )，白昼时间11~13h(优选 12h)，光照强度2000~3000Lx (优选2500Lx)，黑夜时间为11~13h (优选12h)，光照强度 为OLx，人工气候箱内培养植株7~IOd (优选9d)，待植株恢复正常生长；
[0009] (3)病原菌收集：对灰斑病典型病斑叶进行水浸泡、水洗脱与离心方式，在短时间 内获得具有高浓度的灰斑病带菌液；
[0010] (4)接种：先用清水冲洗待接种的叶片，晾干后再撒上少许500~700目金刚砂， 在接种叶片上轻轻摩擦，要求仅使叶片表皮细胞造成微伤口而不死亡，每天涂抹1~3次， 连续涂抹2~4d，每次涂抹后以保鲜膜覆盖涂抹菌液部分，保湿3~4d后去掉保鲜膜，以起 到保湿作用。
[0011] 进一步，步骤（3)中，所述水浸泡是用50ml蒸馏水浸泡20g具有灰斑病典型病斑 的叶片，浸泡4h，过滤叶片残渣，收集浸泡蒸馏水；所述水洗脱是用新的蒸馏水反复洗脱浸 泡后的病斑叶片3~4次，每次用水量50ml，洗脱后收集蒸馏水备用；所述离心是将浸泡病 斑的蒸馏水以6500~7000rap/min转速离心15~25min，去掉离心管内上清液，保留底部 沉淀，重复离心多次，直至洗脱液全部被离心；最后收集离心管底部沉淀，将其置入Iml蒸 馏水中，充分搅拌均匀，即得带菌悬浊液。
[0012] 本发明通过人工气候培养箱真实模拟出灰斑病发病所需要的最佳环境（最适接 种环境温度、相对湿度及光照强度），在模拟环境中以高浓度病原菌悬浊液涂抹对玉米植株 进行灰斑病人工接种。因此，本发明不受季节、外部环境和地域等因素的限制，有效地提高 了灰斑病人工接种的成功率，能够准确控制灰斑病的接种时间，有利于观察和检测植株在 接种前后特定时间节点的外观及内部指标动态变化。
[0013] 实践证明，玉米灰斑病病株率可达95.0%。
【具体实施方式】
[0014] 以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0015] 实施例1 :
[0016] 1、玉米灰斑病的接种方法
[0017] (1)喇叭口期玉米植株移栽：将小喇叭口期玉米植株带土移栽至直径50cm，深 60cm的花盆中；
[0018] (2)在人工气候培养箱模拟环境下培养：将移植植株放置于人工气候培养箱中， 设定环境温度为25°C，相对湿度为95%，白昼时间12h，光照强度2500Lx，黑夜时间为12h， 光照强度为〇Lx，人工气候箱内培养植株9天，待植株恢复正常生长。
[0019] (3)病原菌收集：①首选水浸泡：用50ml蒸馏水浸泡20g具有灰斑病典型病斑的 叶片，浸泡4h，过滤叶片残渣，收集浸泡蒸馏水；②接着水洗脱：用新的蒸馏水反复洗脱浸 泡后的病斑叶片3~4次，每次用水量50ml，洗脱后收集蒸馏水备用；③然后离心：将浸泡 病斑的蒸馏水以6700rap/min转速离心20min，去掉离心管内上清液，保留底部沉淀，重复 离心多次，直至洗脱液全部被离心；④最后收集离心管底部沉淀，将其置入Iml蒸馏水中， 充分搅拌均匀，即得浓度为5 X IO5个/微升带菌悬浊液。
[0020] (4)接种：先用清水冲洗待接种的叶片，晾干后再撒上少许金刚砂（600目），以左 手托着叶片，用右手食指蘸取少量灰斑菌悬液。在接种叶片上轻轻摩擦，要求仅使叶片表皮 细胞造成微伤口而不死亡。每天涂抹2次，连续涂抹3d，每次涂抹后以保鲜膜覆盖涂抹菌液 部分，保湿3~4d后可去掉保鲜膜。
[0021] 2、发病情况调查
[0022] 保持人工气候培养箱的温湿度及光照强度在合适的范围，大喇叭口期移栽玉米至 人工气候培养箱，根据玉米植株生长状态及时进行肥水管理，待玉米植株恢复正常生长后 人工接种。接种后15d左右可以通过肉眼观察到接种叶片出现典型病斑，玉米灰斑病发病 情况调查结果见表1 (三次重复数据）。
[0023] 表1玉米灰斑病发病情况
[0025] 3、寄主发病效果对照数据
[0026] 分别比较了三种接种方法（A :海拔600m的大田环境人工接种；B :海拔1500m的自 然接种；C :海拔600m的大喇叭口期移栽后人工气候培养箱条件下人工接种）下的玉米灰 斑病发病情况，每种方法设三次重复。玉米灰斑病发病情况见表2。
[0027] 表2玉米灰斑病发病情况
【主权项】
1. 一种玉米灰斑病的接种方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 喇叭口期玉米植株移栽：将喇叭口期玉米植株带土移栽至直径40~60cm，深50~ 70cm的花盆中； (2) 模拟环境下培养：将移植植株放置于人工气候培养箱中，设定环境温度为20~ 30°C，相对湿度为90~100%，白昼时间11~13h，光照强度2000~3000Lx，黑夜时间为 11~13h，光照强度为OLx，人工气候箱内培养植株7~10d，待植株恢复正常生长； (3) 病原菌收集：对灰斑病典型病斑叶进行水浸泡、水洗脱与离心方式，在短时间内获 得具有高浓度的灰斑病带菌液； (4) 接种：先用清水冲洗待接种的叶片，晾干后再撒上少许500~700目金刚砂，在接 种叶片上轻轻摩擦，要求仅使叶片表皮细胞造成微伤口而不死亡，每天涂抹1~3次，连续 涂抹2~4d，每次涂抹后以保鲜膜覆盖涂抹菌液部分，保湿3~4d后去掉保鲜膜。2. 根据权利要求1所述的玉米灰斑病的接种方法，其特征在于，步骤（1)中，所述喇叭 口期玉米植株为小喇叭口期玉米植株。3. 根据权利要求1或2所述的玉米灰斑病的接种方法，其特征在于，步骤⑵中，所述 设定环境温度为25°C，相对湿度为95%，白昼时间12h，光照强度2500Lx，黑夜时间为12h， 光照强度为〇Lx，人工气候箱内培养植株9d。4. 根据权利要求1~3之一所述的玉米灰斑病的接种方法，其特征在于，步骤（3)中， 所述水浸泡是用50ml蒸馏水浸泡20g具有灰斑病典型病斑的叶片，浸泡4h，过滤叶片残渣， 收集浸泡蒸馏水；所述水洗脱是用新的蒸馏水反复洗脱浸泡后的病斑叶片3~4次，每次用 水量50ml，洗脱后收集蒸馏水备用；所述离心是将浸泡病斑的蒸馏水以6500~7000rap/ min转速离心15~25min，去掉离心管内上清液，保留底部沉淀，重复离心多次，直至洗脱液 全部被离心；最后收集离心管底部沉淀，将其置入Iml蒸馏水中，充分搅拌均匀，即得带菌 悬浊液。
【专利摘要】一种玉米灰斑病的接种方法，包括以下步骤：(1)喇叭口期玉米植株移栽；(2)在人工气候培养箱真实模拟环境下培养；(3)病原菌收集；4)接种。本发明不受季节、外部环境和地域等因素的限制，有效地提高了灰斑病人工接种的成功率，能够准确控制灰斑病的接种时间，有利于观察和检测植株在接种前后特定时间节点的外观及内部指标动态变化。
【IPC分类】A01G1/00
【公开号】CN105123175
【申请号】CN201510434473
【发明人】何文铸, 张彪, 杨麟, 冷益丰, 兰海, 陈洁, 李芦江, 谭君, 徐国伦, 杨俊品, 蔡明鸿, 康继伟, 黄维藻, 唐海涛, 李政, 何远远
【申请人】四川省农业科学院作物研究所
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年7月22日