南洋楹组织培养外植体的培育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种南洋楹组织培养外植体的培育方法。
【背景技术】
[0002]南洋植(Paraserianthesfalcataria(L.) Nielsen)是含羞草科(Mimosaceae)，南洋楹属常绿乔木树种，原产马来西亚和印度尼西亚，以其速生强、固氮培肥等特点而被广泛引种栽培于我国热带和南亚热带地区。目前，南洋楹生产用种基本都是在早期引种尚存的少量散生母树上采集，存在生长速度不一、分枝数量与大小不一等分化问题。通过组织培养技术繁育南洋楹既可解决林分分化大的问题，又能在短期内将少量优良单株繁殖出大量苗木，有助于南洋楹造林的无性系化和良种化。
[0003]现用于南洋楹组织培养的外植体来源主要有2个途径，一是采用大树环割方法，在南洋楹林分中采集萌芽条作为外植体；另一种是在林分中采集枝条嫁接，再对嫁接苗进行截冠处理，采集当年萌生的幼嫩枝条的顶芽、腋芽为外植体。这2种方法获得的外植体由于长期生长在野外环境，通过表面消毒很难杀死组织内部的菌类而导致污染，无菌体系难于建立。
【发明内容】
[0004]基于此，本发明的目的在于提供一种南洋楹组织培养外植体的培育方法，克服现有南洋楹组织培养外植体获取技术的不足，快速培育质量好、数量多、易灭菌和方便收集的外植体，满足南洋楹组织培养快速繁殖体系建立的需要。
[0005]实现上述发明目的的具体技术方案如下:
[0006]—种南洋楹组织培养外植体的培育方法，包括以下步骤:
[0007](I)种子消毒:在无菌条件下，将南洋楹的种子依次用无菌水洗涤、高锰酸钾溶液浸泡、无菌水洗涤、HgCl2水溶液浸泡、无菌水洗涤进行消毒；
[0008](2)浸种:将消毒后的种子用85?90°C的无菌水浸泡22?26小时；
[0009](3)催芽:在无菌条件下，浸种后的种子依次用无菌水洗涤、HgCl2水溶液浸泡、无菌水洗涤后放入催芽容器，在25?35°C无菌遮光条件下催芽2?4天；
[0010]所述催芽容器为耐高温高压可密封的培养器皿，底部平铺用无菌水浸透的厚度为2?5_的吸水性良好的材料；所述催芽容器经高温高压灭菌15?25分钟，冷却后备用；
[0011](4)接种:在无菌条件下，将露出白色幼根的种子取出，依次用无菌水洗涤、HgCl2水溶液浸泡、无菌水洗涤后晾干，将幼根插入育苗培养基；
[0012]所述育苗培养基由以下组分组成:1/2MS培养基、0.15?0.25mg/L吲哚丁酸、
0.6?1.0mg/L萘乙酸、20?30g/L蔗糖、6?8g/L卡拉胶；所述育苗培养基的pH为5.6?6 ；
[0013](5)育苗:接种后培养6?8天即可获得所述外植体，培养条件为:温度20?30°C，每天光照14?18小时，光照的强度为750?15001x。
[0014]在其中一些实施例中，所述无菌水洗涤为用无菌水洗涤2?5次，所述高锰酸钾溶液浸泡为用4?6g/L的高锰酸钾溶液浸泡12?18分钟，所述HgCljK溶液浸泡为用1.3?
1.7g/L的HgCl2水溶液浸泡10?20分钟。
[0015]在其中一些实施例中，所述高锰酸钾溶液的浓度为5g/L，所述HgCl2水溶液的浓度为 1.5g/L0
[0016]在其中一些实施例中，所述培养器皿为组培瓶，所述吸水性良好的材料为滤纸。
[0017]在其中一些实施例中，在步骤(I)之前还包括以下步骤:
[0018](a)采种:每年7月下旬到8月中旬，采集从青色转为黄褐色或黑色并刚开裂时的夹果;
[0019](b)制种与选种:将荚果置于阳光下晒至自然开裂后取出种子，选取无病虫害、颗粒饱满的种子，备用。
[0020]在其中一些实施例中，步骤(4)所述育苗培养基由以下组分组成:1/2MS培养基、
0.2mg/L吲哚丁酸、0.8mg/L萘乙酸、25g/L蔗糖、7g/L卡拉胶；所述育苗培养基的pH为5.8。
[0021]在其中一些实施例中，步骤(5)所述培养的时间为7天，培养条件为:温度25?28°C，每天光照16小时，光照的强度为ΙΟΟΟΙχ。
[0022]在其中一些实施例中，步骤(1)-(3)所述无菌条件为超净工作台的无菌条件。
[0023]本发明提供的南洋楹组织培养外植体的培育方法具有以下有益效果:
[0024]克服了现有南洋楹组织培养外植体获取技术的不足(野外采集或培养困难，组织内含菌类多，易污染)，本发明所述方法操作简单易行、周期短、污染低、产量高，可快速培育质量好、数量多、易灭菌和方便收集的外植体。通过本发明所述的无菌育苗流程，污染率可控制在5%以内；本发明提供的催芽装置提供了温度和湿度适宜、有利于幼根发育的无菌育苗环境，催芽装置底部平铺滤纸代替现有技术中的纱布等材料，可以防止在接种步骤中取出已发芽的种子时损伤或折断种子的幼根；本发明所述的育苗培养基可促进幼苗健壮、快速生长。研究结果发现本发明提供的南洋楹组织培养外植体的培育方法可在10天内获得95%以上无菌的健壮外植体，可满足南洋楹组织培养快速繁殖体系建立的需要。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。
[0026]在广东省博罗县林业科学研究所营建的引进南洋楹种源及家系试验林中，选择来自马来西亚优良家系M4中的优良单株BLS16为采种母树，母树年龄17年，于2013年8月15日采集成熟荚果(从青色转为黄褐色并刚开裂时的荚果)250g，用该荚果培育南洋楹组织培养的外植体，培育方法包括以下步骤:
[0027](I)制种与选种:将所采集的荚果置于阳光下晒至自然开裂后取出种子，选取无病虫害、颗粒饱满的种子100粒放入组培瓶中；
[0028](2)种子消毒与浸种:在超净工作台无菌条件下，将选取好的种子用无菌水洗涤3次，置于5g/L的高锰酸钾溶液中浸泡15min，无菌水洗净后置于1.5g/L的HgClyK溶液中浸泡15min，再用无菌水洗涤4次，将消毒后的种子放入85?90°C的无菌水中浸泡24h ；
[0029](3)催芽:在超净工作台无菌条件下，将浸种后的种子用无菌水洗涤3次，置于
1.5g/L的HgCl2水溶液中浸泡15min，再用无菌水洗涤4次，放入5个催芽容器中，每个催芽容器中放置种子20粒，在28?30°C无菌遮光条件下催芽3天；催芽容器为组培瓶，底部平铺吸水滤纸，用无菌水浸透后，经高温高压灭菌20min ；
[0030](4)接种:在超净工作台无菌条件下，将露出白色幼根的种子取出，用无菌水洗涤3次，置于1.5g/L的HgCl2水溶液中浸泡lOmin，再用无菌水洗涤4次，取出晾干表面水分，将幼根插入育苗培养基；所述育苗培养基的组成为:1/2MS+吲哚丁酸(IBA，0.2mg/L) +萘乙酸(NAA，0.8mg/L) +蔗糖(25g/L) +卡拉胶(7g/L)，pH值为5.8 ; 1/2MS是指MS培养基中的成分减少为原来的一半；
[0031](5)育苗:接种后培养7天获得无菌苗95株，培养条件为:温度25?28°C，每天光照16小时，光照的强度为100lx ;所得95株无菌苗的苗高为5?8cm，苗木健壮，可直接作为组培外植体。
[0032]以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0033]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1.一种南洋楹组织培养外植体的培育方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)种子消毒:在无菌条件下，将南洋楹的种子依次用无菌水洗涤、高锰酸钾溶液浸泡、无菌水洗涤、HgCl2水溶液浸泡、无菌水洗涤进行消毒； (2)浸种:将消毒后的种子用85?90°C的无菌水浸泡22?26小时； (3)催芽:在无菌条件下，浸种后的种子依次用无菌水洗涤、HgCl2水溶液浸泡、无菌水洗涤后放入催芽容器，在25?35°C无菌遮光条件下催芽2?4天； 所述催芽容器为耐高温高压可密封的培养器皿，底部平铺用无菌水浸透的厚度为2?5mm的吸水性良好的材料；所述催芽容器经高温高压灭菌15?25分钟，冷却后备用； (4)接种:在无菌条件下，将露出白色幼根的种子取出，依次用无菌水洗涤、HgCl2水溶液浸泡、无菌水洗涤后晾干，将幼根插入育苗培养基； 所述育苗培养基由以下组分组成:1/2MS培养基、0.15?0.25mg/L吲哚丁酸、0.6?1.0mg/L萘乙酸、20?30g/L蔗糖、6?8g/L卡拉胶；所述育苗培养基的p H为5.6?6 ; (5)育苗:接种后培养6?8天即可获得所述外植体，培养条件为:温度20?30°C，每天光照14?18小时，光照的强度为750?15001x。2.根据权利要求1所述的南洋楹组织培养外植体的培育方法，其特征在于，所述无菌水洗涤为用无菌水洗涤2?5次，所述高猛酸钾溶液浸泡为用4?6g/L的高猛酸钾溶液浸泡12?18分钟，所述HgClyK溶液浸泡为用1.3?1.7g/L的HgCl 2水溶液浸泡10?20分钟。3.根据权利要求3所述的南洋楹组织培养外植体的培育方法，其特征在于，所述高锰酸钾溶液的浓度为5g/L，所述HgCljK溶液的浓度为1.5g/L。4.根据权利要求1所述的南洋楹组织培养外植体的培育方法，其特征在于，步骤(3)所述培养器皿为组培瓶，所述吸水性良好的材料为滤纸。5.根据权利要求1-4所述的南洋楹组织培养外植体的培育方法，其特征在于，在步骤(I)之前还包括以下步骤: (a)采种:每年7月下旬到8月中旬，采集从青色转为黄褐色或黑色并刚开裂时的荚果; (b)制种与选种:将荚果置于阳光下晒至自然开裂后取出种子，选取无病虫害、颗粒饱满的种子，备用。6.根据权利要求1-4任一项所述的南洋楹组织培养外植体的培育方法，其特征在于，步骤(4)所述育苗培养基由以下组分组成:1/2MS培养基、0.2mg/L吲哚丁酸、0.8mg/L萘乙酸、25g/L蔗糖、7g/L卡拉胶；所述育苗培养基的P H为5.8。7.根据权利要求1-4任一项所述的南洋楹组织培养外植体的培育方法，其特征在于，步骤(5)所述培养的时间为7天，培养条件为:温度25?28°C，每天光照16小时，光照的强度为ΙΟΟΟΙχ。
【专利摘要】本发明涉及一种南洋楹组织培养外植体的培育方法，包括种子消毒、浸种、催芽、接种、育苗等步骤。通过本发明所述的无菌育苗流程，污染率可控制在5％以内；本发明提供的催芽装置提供了温度和湿度适宜、有利于幼根发育的无菌育苗环境；该方法中的育苗培养基可促进幼苗健壮、快速生长；该方法操作简单易行、周期短、污染低、产量高，可在10天内获得95％以上无菌的健壮外植体，可满足南洋楹组织培养快速繁殖体系建立的需要。
【IPC分类】A01G31/00, A01C1/00
【公开号】CN105210831
【申请号】CN201510683550
【发明人】晏姝, 胡德活, 韦如萍, 王润辉, 郑会全
【申请人】广东省林业科学研究院
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月20日