一种含重组人prdx4蛋白的人精液冷冻保护剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于人精液冷冻保护剂领域。
[0002]
【背景技术】 阳00引据2012年忡国不孕不育现状调研报告》显示，中国不孕不育的发病率由20年前 的3%提高至15%，其中男性因素占30%~40%，男性不育已成为一严峻社会问题。目前，辅 助生殖技术是男性不育症治疗的重要手段，而精液冷冻保存是其中不可缺少的环节，其不 仅为无精子症或男方有遗传疾病的不育夫妇提供了生育可能，而且还为将要接受放化疗的 肿瘤患者或有生育力保存要求的夫妇提供了生育保险。
[0004] 精液冻融过程中，大量活性氧自由基异常产生，而且冻融的过程破坏了精液中抗 氧化酶的活性，一边的产生大大增加，一边体内自然存在的氧化应激清除能力被削弱，最终 破坏了精浆中氧化与抗氧化的平衡，导致精子发生氧化应激，使其活力减弱，DNA损伤，进而 造成受精能力下降。因而，寻找有效的途径预防或减少精子在冻融过程中受到的氧化损伤 具有重要意义。 阳〇化]优化改良精液冷冻保护液是解决运一问题的有效途径，其中抗氧化剂是目前研究 比较热口的方向。近年来，学者们发现在精液冷冻保护液中添加酶类抗氧化剂巧日超氧化物 歧化酶、过氧化氨酶、谷脫甘肤过氧化物酶等）或非酶类抗氧化剂巧日牛横酸、k肉碱、茶多 酪、维生素C、E等）等成分能够抑制精子氧化损伤，提高复苏后精子质量。化roxiredoxins (PRDXs)是一新近发现的抗氧化酶系，包含6个成员（PRDX1~6)，与传统抗氧化酶相比，其具 有更高的活性。其中PRDX4具有分泌信号肤，在内质网中合成后被转运至细胞外。有研究 报道，PRDX4在人精浆及精子中含量丰富，并积极的与肥02反应保护精子免受氧化损伤。此 外，Prdx4基因敲除小鼠显示睾丸萎缩，并且精子DNA损伤增加。可见，PRDX4在精液抗氧化 防御中发挥重要作用，其可能是一潜在的更高效的精液冷冻保护液添加剂。
[0006]
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种含重组人P畑X4蛋白的人精液冷冻保护剂。
[0008] 具体的，所述人精液冷冻保护剂由重组人PRDX4蛋白和人精液冷冻保护基础液组 成，其中重组人PRDX4蛋白在每100ml人精液冷冻保护基础液中的添加量为5mg~20mg。
[0009] 具体的，所述人精液冷冻保护基础液为GEYC冷冻保护剂，每100ml的GEYC冷冻保 护剂中含有下列物质：葡萄糖1.5g，巧樣酸S钢二水1.3g，甘氨酸1.3g，甘油15ml，卵黄 20ml，余量为纯化水。
[0010] 所述人P畑X4基因的GenBank登录号为NM_006406. 1，人P畑X4蛋白的氨基酸序列 的登录号为NP_006397. 1。本发明所用重组人PRDX4蛋白可W通过基因工程技术获得。
[0011] 有研究报道，PRDX4在人精浆及精子中含量丰富，并积极的与肥02反应保护精子 免受氧化损伤。此外，Prdx4基因敲除小鼠显示睾丸萎缩，并且精子DM损伤增加。可见，PRDX4在精液抗氧化防御中发挥重要作用。本发明将基因工程表达的重组人PRDX4蛋白作 为添加剂加入到GEYC冷冻保护剂中，W对抗精液冷冻保存过程中产生的自由基对精子的 氧化损伤，取得了优于GEYC的保护效果。
[0012]
【具体实施方式】
[0013] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明： 实施例1 :重组人P畑X4蛋白的制备 根据编码人PRDX4基因的序列设计并合成一对特异引物(上游引物：5'-tatccatatgtg ggagacagaggagag-3，，下游引物：5, -ttactcgagattcagtttatcgaaatac-3,），在上下游引物 5'端分别添加了酶切位点Ndel及化〇1。W常规方法抽提的人附睾mRNA进行RT-PCR获 得cDNA，再WcDNA为模板扩增出人P畑X4基因。将扩增出的人P畑X4基因片段经Ndel及 化〇1双酶切后，插入原核表达载体祀T32b( + )的Ndel及化〇1酶切位点之间，即得到表达 人P畑X4蛋白的原核表达载体祀T3化（ + )/P畑X4。再将该载体转化表达菌株化igamiB (DE3)，即得到表达人P畑X4蛋白的大肠杆菌基因工程菌。该工程菌表达的P畑X4蛋白在C 端带有6个组氨酸的标签，W利于纯化。挑取单克隆至含氨节青霉素的LB液态培养基中，37 度摇床培养至〇的。。=〇. 6~0. 8后，加入IPTG至终浓度0. 4mMW诱导P畑X4蛋白的表达，3~4h 后离屯、收集菌体。将菌体重悬于PBS中破碎后，将上清过儀亲和层析柱进行亲和纯化，最后 再用G-25脱盐柱将蛋白置换到PBS中。BCA法测定蛋白浓度，0. 22微米无菌滤器过滤除菌 后可用于人精液冷冻保护剂的制备。一般制备的重组人P畑X4蛋白的浓度在2~3mg/ml左 -^5"〇
[0014] 实施例2 :含重组人P畑X4蛋白的人精液冷冻保护剂的制备 准确称取葡萄糖1.5g，巧樣酸=钢二水1.3g，甘氨酸1.3g，加纯水至65ml，完全溶解 后，加入15ml甘油，混匀。再加入20ml卵黄(从新鲜鸡蛋中抽取得到)，所制成的悬浮液置 56°C水浴中40分钟，经常揽拌，即制成人精液冷冻保护基础液，也是GEYC冷冻保护剂。冷却 后的人精液冷冻保护基础液，按终浓度0.Img/ml的量加入实施例1得到的重组人PRDX4蛋 白，混匀，最后用0. 45ym无菌滤器过滤即制得含重组人PRDX4蛋白的人精液冷冻保护剂， 无菌分装后，-70度保存，3个月内使用。 阳0巧]实施例3冶重组人PRDX4蛋白的人精液冷冻保护剂用于人精液的冷冻保存 本发明选择烟台銃壞顶医院生殖中屯、口诊的50份精液样本，精液参数符合世界卫生 组织（WK)，2010)所规定的正常精液标准，年龄在28~35周岁，近期无致崎因素接触史， 已生育正常后代。
[0016] 精液冻存及复苏程序：将完全液化的精液与冷冻保护剂W2:1的体积比混匀后， 在30~35°C解育5分钟，装入冷冻管中。先置于4°C冰箱1小时，再将其悬于液氮蒸气与空 气的混合气中（-80°C~-100°C) 15分钟，然后投入液氮中。冷冻保存1个月后，37°C水浴 中复苏5~10分钟。
[0017] 每份新鲜精液液化后，分为3份做如下处理： (1)冻前组：直接检查各精液参数，结果见表1 ; (2) 对照组：加入GEYC冷冻保护剂进行冷冻保存，一个月后复苏，检查各精液参数，结 果见表1 ; (3) 实验组：加入实施例2制备的人精液冷冻保护剂进行冷冻保存，一个月后复苏，检 查各精液参数，结果见表1。
[0018] 对照组和实验组数据用SPSS22. 0软件进行配对t检验统计学分析，P< 0. 05， 二者有统计学差异，说明加入含重组人PRDX4蛋白的人精液冷冻保护剂具有更好的保护效 果。
[0019] 表1冷冻前后各组精液参数比较分析
注：各项结果均W均数+标准差表示； 对照组：加入GEYC冷冻保护剂；实验组：加入含重组人P畑X4蛋白的人精液冷冻保护 剂； 与对照组比较，*:P<0. 05。
【主权项】
1. 一种人精液冷冻保护剂，其特征在于，所述人精液冷冻保护剂由重组人PRDX4蛋白 和人精液冷冻保护基础液组成，其中，重组人PRDX4蛋白在每100mL人精液冷冻保护基础液 中的添加量为5mg~20mg。2. 如权利要求1所述的含重组人PRDX4蛋白的人精液冷冻保护剂，其特征在于所述人 精液冷冻保护基础液为GEYC冷冻保护剂，每100mLGEYC冷冻保护剂含有下列物质：葡萄糖 1.5g，柠檬酸三钠二水1.3g，甘氨酸1.3g，甘油15ml，卵黄20ml，余量为纯化水。
【专利摘要】本发明提供了一种含重组人PRDX4蛋白的人精液冷冻保护剂，所述的人精液冷冻保护剂由重组人PRDX4蛋白和人精液冷冻保护基础液组成，其中重组人PRDX4蛋白在每100ml人精液冷冻保护基础液中的添加量为5mg~20mg。每100ml的人精液冷冻保护基础液中含有下列物质：葡萄糖？1.5g，柠檬酸三钠二水1.3g，甘氨酸1.3g，甘油15ml，卵黄20ml，余量为纯化水。本发明首次将重组人PRDX4蛋白用于人精液的冷冻保存，复苏后的人精子活力、存活率及穿卵率均显著高于对照组（使用未添加重组人PRDX4蛋白的人精液冷冻保护基础液），而DNA损伤率则低于对照组，证明添加重组人PRDX4蛋白能够改善人精液冷冻保护基础液对人精子的冷冻保存效果。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN105211054
【申请号】CN201510759002
【发明人】刘娟, 朱鹏
【申请人】刘娟, 朱鹏
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月10日