一种高效利用昆虫核型多角体病毒表型多样性的方法
【专利说明】
一、技术领域
[0001]本发明属于害虫生物防治技术领域，具体涉及一种高效利用昆虫核型多角体病毒表型多样性的方法。
二、技术背景
[0002]自然界中寄生物-寄主相互作用中，普遍存在寄生物多基因型混合感染现象。这些基因型在存在遗传差异的同时，往往其表型上也表现出差异。昆虫病毒也不例外，昆虫核型多角体病毒(NPV)中有丰富的基因型，不同基因型又常常有着不同的表型。NPV表型多样性主要表现为杀虫活性、杀虫速度和病毒产量等特性上。如在草地贪夜蛾核型多角体病毒Spodoptera frugiperda NPV(SfMNPV)尼加拉瓜分离株的9种基因型中，其杀虫速度存在显著差异，并且分离株的杀虫速度同优势基因型相比较慢，表明可能至少有2种甚至更多的基因型决定着病毒种群的杀虫速度。由I头松夜蛾中得到的4种NPV基因型，它们的毒力相差达6倍，此外，侵染速度和病毒产出也有差异。在甜菜夜蛾核型多角体病毒Spodoptera exiguaNPV(SeNPV)西班牙分离株的4种基因型中，有I种基因型的活性显著低于其它3种，另外3种基因型间无显著差异。
[0003]斜纹夜蛾核型多角体病毒Spodoptera litura MNPV(SpltMNPV)也不例外，其在自然界中同样存在丰富的基因型和表型Jaeda等(1990)从日本采集的SpltNPV 4个分离株可分为4类基因型。Takatsuka等(2003)发现来源于日本、越南和印度等地的9个SpltNPV分离株和埃及的I个海灰翅夜蛾(SpliMNPV)分离株均由几种基因型组成。Kamiya(2004)从日本全国各地采集野外感病幼虫中病毒可分为A、B、C三类基因型。这些SpltMNPV不同基因型在病毒产量、杀虫活性和杀虫速度上表现出不同的表型特征。Kamiya等(2004)发现A、B和C三类病毒基因型的产量不同，在经口感染斜纹夜蛾幼虫时，C型包涵体产量比A型和B型多2000?20000倍;血淋巴注射结果同样表现出C型产量高。杀虫毒力和作用速度也有显著差异，杀虫活性以A型最尚，杀虫速度则以C型最尚。
[0004]从进化的动力来看，病毒多基因型的复合侵染是由于:(I)毒力更高。这已在松夜蛾核型多角体病毒Pannolis fiammea NPV(PfMNPV)上得到证实，不同基因型的复合侵染毒力要高于单独侵染。进一步研究发现PfNPV多个基因型混合侵染时毒力提高是由于产生了比单个基因型侵染致病力更强的病毒包涵体。同样也发现SfNPV多基因型种群(SfNIC)的侵染活性高于其中任何一种基因型单独侵染的活性。(2)宿主域更广。对能够感染一种以上宿主的病毒而言，病毒的多态性能够提高其在不同宿主中的适应性。此亦在PfMNPV不同基因型对松夜蛾Panolis fiammea和甘蓝夜蛾Mamestra brassicae致病力差异的研究中得到证实。
[0005]合理高效利用NPV表型多样性是充分发挥病毒控害作用的重要途径。关于病毒多样性，主要研究集中在分离株上，并且集中在分离株中分离到不同基因型后比较各基因型间表型差异上，病毒分离株或单头病虫在进行分离时，可获得不同的克隆株系，这些克隆株系并不一定属于不同基因型，它们之间的表型多样性如何？尚未见报道，而明确单头病虫中分离到的各病毒克隆株系杀虫活性、杀虫速度及病毒产量等表型多样性，可为合理高效利用核型多角体病毒表型多样性进行害虫防治提供依据和方法。
三、
【发明内容】
[0006]1、发明目的
[0007]提供一种理想的昆虫核型多角体病毒多表型样性高效利用方法，能更加有效地控制害虫。
[0008]2、技术方案
[0009]本发明为一种昆虫核型多角体病毒表型多样性高效利用方法，其特征在于利用单头病虫中的病毒表型多样性。
[0010]3、有益效果
[0011]本发明的方法与现有技术相比，产生以下有益效果:(I)与常规通过明确基因型多样性后再进行表型多样性研究相比，本发明通过直接比较单头病虫中各病毒克隆株系表型多样性，其发现效率更高；(2)与利用基于病毒基因型多样性的表型多样性相比，本发明直接利用单头病虫中的表型多样性，更为便捷高效。
四、【具体实施方式】
[0012]本发明的实施例是采用室内生物测定的方法。
[0013]供试材料
[0014]斜纹夜蛾:室内人工饲养100多代的斜纹夜蛾，饲养温度为27±1°C，光照为14:10(L:D)，虫卵用2%甲醛消毒，幼虫3龄前群体饲养，3龄后单头饲养，选择健康的3龄中期幼虫进行毒力试验。
[0015]斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltNPV)=SpltNPV 1_15号克隆株系由安徽和县田间采集的两头感染NPV的斜纹夜蛾中通过活体克隆分离获得，其中1-8号为同一头病虫中分离，9-15号为另一头病虫分离获得。
[0016]供试方法
[0017]病毒株系活体克隆方法:用来自于同一头病虫中的高浓度原始病毒感染4龄斜纹夜蛾幼虫10-15头，72h后，收集血淋巴，稀释后，再用来感染150头的3龄幼虫，此时所用病毒的浓度控制在对幼虫的致死率低于20%。将发病的虫体单头收集，并对昆虫病毒多角体进行500rpm和3000rpm的差速离心纯化。
[0018]生物测定:用饲料喂毒法测定由安徽和县自然界单头病虫中活体克隆得到的病毒对斜纹夜蛾的杀虫活性、杀虫速度及病毒产量，测定来自于两头病虫的15个活体克隆株系。试验在6孔板中进行，将人工饲料切成相同小块(确保24h吃完)加入6孔板中，每孔I块，每块饲料上加上病毒液10yL，15个病毒克隆株系浓度均为106PIB/ml，对照加清水。分别接入大小较为一致的斜纹夜蛾3龄I头，每个浓度处理60头幼虫即10块板。待含病毒液饲料吃完后补充新鲜无毒的人工饲料，试验在29°C± TC的光照培养箱中进行。每日调查死亡虫数，分别记录病毒死亡和其它死亡虫头数，同时收集病毒死亡虫于离心管中，每板单独收集于同一离心管内，用于病毒产量的分析。每天调查两次，以保证病死虫及时收集。调查时间为12d，即直到不再有病毒死亡虫出现。统计12d内的总致病率，作为病毒毒力比较的依据。并计算各处理病毒死亡虫的平均死亡时间，每板所有病虫为一个重复。同时将收集的病毒虫进行差速离心，每板收集的病毒为一个重复，用血球计数板计数方法对多角体进行计数，统计产量。
[0019]应用DPS统计分析软件对致死率、死亡时间和病毒产量进行差异显著性统计分析。
[0020]实施效果:
[0021]实施例1
[0022]比较了SpltNPV和县株I头病虫中分离获得的8个活体克隆株系在斜纹夜蛾上的表型差异。从致病力来看，不同活体克隆株系病毒间的致病力存在差异。I 06PIB/mlSpltNPVl-8号对斜纹夜蛾3龄幼虫的致死率分别为78.3%、58.3%、68.3%、71.7%、76.7%、73.3%、65%和51.7%，其中I号病毒的致死率最高，为78.3%，8号病毒最低，为51.7%，各克隆株间有显著差异$ = 2.49，(^ = 7，79，？ = 0.0239)。
[0023]从杀虫速度看，各克隆株系对斜纹夜蛾的杀虫速度也存在差异。106PIB/mlSpltNPVl-8号对斜纹夜蛾3龄幼虫的致死时间分别为142.2、129.4、113.8、121.6、126.5、122、123.6和120.5h，以I号病毒的杀虫速度最慢，平均致死时间为142.2h，3号病毒的杀虫速度最快，平均致死时间仅为113.811，各克隆株系间差异显著卬=8.976，(^ = 7，79，？<
0.0001)。
[0024]再从克隆株系间病毒产量的差异来看，106PIB/ml1_8个活体克隆株系侵染斜纹夜蛾3龄幼虫后，单头病虫的产量分别为1.22 X 108、1.07 X 108、1.12 X 108、1.1 X 108、0.95X 108、1.13 X 108、1.02 X 18和1.03 X 18PIB,所有活体克隆株系病毒间产量上无显著性差异(F=1.557，df = 7，79，P = 0.1623)。
[0025]因此，单头病虫中存在丰富的病毒表型多样性，直接利用单头斜纹夜蛾病虫即可利用病毒丰富表型多样性。
[0026]实施例2
[0027]比较了SpltNPV和县株另I头病虫中分离获得的7个单头病毒在斜纹夜蛾上的表型差异。从致病力来看，不同活体克隆株系病毒间的致病力也存在差异。1-7号病毒对斜纹夜蛾3龄幼虫的致死率分别为63.3%、31.7%、51.7%、46.7%、58.3%、61.7%和50%，其中I号病毒的致死率最高，为63.3%，2号病毒最低，为31.7%，各克隆株间有显著差异(F =2.859，df = 6，69，P = 0.0158)。
[0028]从杀虫速度看，单头病毒对斜纹夜蛾的杀虫速度也存在差异。106PIB/mlSpltNPV1-7号对斜纹夜蛾3龄幼虫的致死时间分别为120.6、117.4、111.9、126.1、127、122.8和110h，以5号病毒的杀虫速度最慢，平均致死时间为127h，7号病毒的杀虫速度最快，平均致死时间仅为110h，各克隆株间无显著差异(F = 0.783，df = 6，69，P = 0.5863)。
[0029]再从病毒分离株内病毒产量的差异来看，106PIB/ml1_8个活体克隆株系病毒侵染斜纹夜蛾3龄幼虫后，单头病毒的产量分别为1.04 X 18U.24 X 18,0.89 X 18U.14 X108、1.16 X 108、1.08 X 18和1.32 X 18PIB,7个活体克隆株系病毒间产量上无显著性差异(F= 1.133,df = 6,69,P = 0.4074) ο
[0030]因此，单头病虫中存在丰富的病毒表型多样性，直接利用单头斜纹夜蛾病虫即可利用病毒丰富表型多样性。
【主权项】
1.一种利用昆虫核型多角体病毒表型多样性方法，其特征在于利用单头病虫中病毒表型多样性。2.根据权利要求1所述的利用单头病虫中病毒表型多样性，其特征在于利用病毒杀虫活性和杀虫速度多样性。
【专利摘要】本发明公开了一种利用单头病虫中昆虫核型多角体病毒表型多样性方法。现有的昆虫核型多角体病毒表型多样性发掘和利用主要通过先明确基因型多样性后再进行表型多样性研究比较，较为费时费力。本发明通过直接比较单头病虫中各病毒克隆株系表型多样性，将单头病虫直接进行活体克隆，比较各克隆株系杀虫速度、杀虫活性和病毒产量等表型，发现单头病虫中存在丰富的表型多样性，进而明确可直接利用单头病虫中表型多样性。同现有技术相比，本方法提高了病毒表型多样性的获得速度，有效地提高了病毒的利用效率。
【IPC分类】A01P7/04, A01N63/00
【公开号】CN105557755
【申请号】CN201510943480
【发明人】郭慧芳, 俞棋, 任彬元, 刘宝生, 钟万芳, 方继朝
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月15日