一种促进牛樟芝液态发酵生长和三萜合成的方法
【技术领域】
[0001]本发明属生物工程技术领域，具体涉及一种促进牛樟芝液态发酵生长和三萜合成的方法。
【背景技术】
[0002]牛樟芝又名牛樟燕，学名Antrodiacamphorata，被誉为“森林红宝石”，是中国台湾特有的真菌，仅生长于中国台湾特有的牛樟树(Cinnamomum kanehirai)上。牛樟芝作为传统药材，被中国台湾民间长期用于解酒保肝，治疗肝痛、肝癌、腹痛、腹泻、炎症等，有着显著疗效。现代研究表明，牛樟芝子实体中含有包括三萜类、多糖类、固醇类、腺苷类、不饱和脂肪酸、免疫蛋白等在内的多种功能性成分，具有抑制肿瘤、抗胆碱、抗乙肝表面抗原、抗炎症、抗氧化等功效，有着广泛的保健和药用价值。由于牛樟木资源稀缺，牛樟芝市场需求量增大，导致樟树盗阀，滥采，野生牛樟芝市场价格居高不下。目前中国台湾方面已经采取措施进行保护，并将其专一寄生的牛樟木列为保护树种，禁止出口。由于牛樟芝护肝保肝效果惊人，目前牛樟芝市场价每公斤达十几万甚至几十万，市场前景巨大。
[0003]鉴于牛樟木资源的稀缺和牛樟芝的显著功效，微生物领域人士将目光聚焦于牛樟芝的人工培养和液态深层发酵上。牛樟芝人工固体培养周期较长，较难得到子实体，且仍然需要牛樟木。液体深层发酵方面已有较多的研究，但总体上菌丝收获量不大，以三萜类化合物为代表的活性成分含量相对较低。
[0004]龙脑樟属樟科植物，是天然冰片的主要提取来源。近年来在我国湖南新晃、江西吉安等地已有相当的培育种植规模及产业链。龙脑樟树中龙脑的前体物质是异戊二烯多聚体，与牛樟树完全相同，是牛樟芝菌代谢产生麦角留醇骨架烯萜类有效成分的重要物质。这启示我们可以利用龙脑樟提取物质促进牛樟芝菌丝体的生长和三萜类化合物的合成。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是液态发酵时牛樟芝菌丝及其所含活性成分三萜类化合物合收率较低，发酵效率不高的问题。
[0006]本发明的目的正是为了克服上述技术的不足，而提供一种促进牛樟芝液态发酵生长和三萜合成的方法，具体涉及一种添加龙脑樟提取物质促进牛樟芝液态发酵中菌丝生长及三萜类化合物合成的方法，使牛樟芝菌丝体量提高了 14 %，菌丝中三萜含量提高了 60 %。
[0007]本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种促进牛樟芝液态发酵生长和三萜合成的方法，在发酵起始和菌体生长到特定阶段，分两次加入龙脑樟提取物，以促进牛樟芝菌丝的生长和三萜类化合物的合成。龙脑樟提取物先制成乙酸乙酯溶液，经0.22μπι有机微滤膜过滤除菌后备用;发酵培养基灭菌完成降至常温后，进行移种，随即加入龙脑樟提取物溶液，添加量为0.5?10mg/L，然后进行培养，当溶氧降至20%以下时，再次加入龙脑樟提取物溶液，添加量为5?50mg/L，继续培养直至发酵结束。
[0008]所加入的龙脑樟提取物为龙脑樟树枝或树叶粉碎后，采用有机溶剂提取、或蒸汽蒸馏、或CO2超临界萃取得到提取物。
[0009]所添加的龙脑樟提取物为有机溶剂提取法或CO2超临界萃取法所得时，初次添加量最好为5?10mg/L，二次添加量最好为30?50mg/L;所添加的龙脑樟提取物为蒸汽蒸馈法所得时，初次添加量最好为0.5?5mg/L，二次添加量最好为5?15mg/L。
[0010]本发明有益效果是:本发明公开的一种添加龙脑樟提取物促进牛樟芝液态发酵菌丝生长和三萜类化合物合的方法，可使牛樟芝的生物量提高14%，菌丝中三萜类化合物的含量提高60%，提高了牛樟芝液态发酵的效率，降低生产成本。
【具体实施方式】
[0011]下面通过【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。
[0012]这种促进牛樟芝液态发酵生长和三萜合成的方法，向发酵体系中加入龙脑樟提取物，可以提高牛樟芝菌丝量及三萜含量。龙脑樟提取物先制成乙酸乙酯溶液，经0.22μπι有机微滤膜过滤除菌后备用;发酵培养基灭菌完成降至常温后，进行移种，随即加入龙脑樟提取物溶液，添加量为0.5?10mg/L，然后进行培养，当溶氧降至20%以下时，再次加入龙脑樟提取物溶液，添加量为5?50mg/L，继续培养直至发酵结束。与对照不添加组相较，本方法可使牛樟芝液态发酵生物量提高14%，菌丝中三萜含量提高60%。
[0013]所加入的龙脑樟提取物为龙脑樟树枝或树叶粉碎后，采用有机溶剂提取、或蒸汽蒸馏、或CO2超临界萃取得到提取物。所添加的龙脑樟提取物为有机溶剂提取法或CO2超临界萃取法所得时，初次添加量最好为5?10mg/L，二次添加量最好为30?50mg/L;所添加的龙脑樟提取物为蒸汽蒸馈法所得时，初次添加量最好为0.5?5mg/L，二次添加量最好为5?15mg/L。
[0014]实施例1:
[0015]1.培养基:
[0016]斜面培养基:综合PDA培养基；
[0017]种子培养基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨5，酵母粉5，大豆粉5，磷酸氢二钾I，硫酸镁
0.6ο
[0018]发酵培养基(g/L):葡萄糖35，蛋白胨5，酵母粉5，大豆粉5，磷酸氢二钾I，硫酸镁
0.6ο
[0019]2.提取物制备:将龙脑樟树枝粉碎后，用5倍的乙酸乙酯常温下提取2次，合并提取液，将提取液减压浓缩、蒸干，备用。使用时，取提取物用乙酸乙酯制成20mg/ml的溶液，用0.22μηι有机膜过滤后备用。
[0020]3.培养方法
[0021]I)种子液培养:牛樟芝菌种经斜面活化后，接种于种子瓶20-30°C培养3-5天得到种子液。成熟种子液接种于种子罐，设定培养温度20_30°C、转速100_150r/min、通气量0.3-
0.5vvm，培养周期2-5天。
[0022]2)发酵培养:将上述种子液移入发酵罐，移种量5%_15%，按5mg/L的比例加入提取物溶液(以所含提取物计)，培养温度20-30 °C、转速50-100r/min、通气量0.3-0.5vvm;当溶氧下降至20%时，按30mg/L的比例加入提取物溶液(以所含提取物计)，培养周期4-6天。
[0023]4.处理及结果:发酵结束后收集菌丝体，烘干，称重并检测三萜类化合物含量。测得牛樟芝菌丝体收获量提高了 15 %，菌丝中三萜含量提高了 63 %。
[0024]实施例2:
[0025]与上述实施例不同的是:龙脑樟提取物制备采用CO2超临界萃取法;发酵中首次加入提取物量为7mg/L;溶氧下降至20%时，加入提取物量40mg/L。结果取得了同样的增产效果O
[0026]实施例3:
[0027]与上述实施例不同的是:龙脑樟提取物制备采用蒸汽蒸馏法;发酵中首次加入提取物量为0.8mg/L;溶氧下降至20%时，加入提取物量10mg/L。结果取得了同样的增产效果。
[0028]最后，应当指出，以上实例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实例，还可以有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种促进牛樟芝液态发酵生长和三萜合成的方法，其特征是:龙脑樟提取物先制成乙酸乙酯溶液，经0.22μπι有机微滤膜过滤除菌后备用;发酵培养基灭菌完成降至常温后，进行移种，随即加入龙脑樟提取物溶液，添加量为0.5?lOmg/l，然后进行培养，当溶氧降至20 %以下时，再次加入龙脑樟提取物溶液，添加量为5?50mg/L，继续培养直至发酵结束。2.根据权利要求1所述的促进牛樟芝液态发酵生长和三萜合成的方法，其特征是:所加入的龙脑樟提取物为龙脑樟树枝或树叶粉碎后，采用有机溶剂提取、或蒸汽蒸馏、或0)2超临界萃取得到提取物。3.根据权利要求2所述的促进牛樟芝液态发酵生长和三萜合成的方法，其特征是:所添加的龙脑樟提取物为有机溶剂提取法或CO2超临界萃取法所得时，初次添加量最好为5?10mg/L，二次添加量最好为30?50mg/L;所添加的龙脑樟提取物为蒸汽蒸馏法所得时，初次添加量最好为0.5?5mg/L，二次添加量最好为5?15mg/L。
【专利摘要】本发明公开了一种促进牛樟芝液态发酵生长和三萜合成的方法，龙脑樟提取物先制成乙酸乙酯溶液，经0.22μm有机微滤膜过滤除菌后备用；发酵培养基灭菌完成降至常温后，进行移种，随即加入龙脑樟提取物溶液，添加量为0.5～10mg/L，然后进行培养，当溶氧降至20％以下时，再次加入龙脑樟提取物溶液，添加量为5～50mg/L，继续培养直至发酵结束。本发明方法可有效促进牛樟芝菌丝的生长和三萜类化合物的合成，发酵结束后牛樟芝生物量提高14％，菌丝中三萜含量提高60％，可应用于牛樟芝及其活性成分的规模化生产。
【IPC分类】A01G1/04
【公开号】CN105580638
【申请号】CN201510952926
【发明人】刘国, 李海龙, 边军英
【申请人】浙江亚林生物科技股份有限公司
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2015年12月17日