一种石蒜属植物快速增殖的离体原生鳞茎分生法
【专利摘要】本发明涉及植物快速繁殖技术，旨在提供一种石蒜属植物快速增殖的离体原生鳞茎分生法。该种石蒜属植物快速增殖的离体原生鳞茎分生法包括种子的萌发培养、原生鳞茎的增殖培养和不定芽的膨大培养，直至获得显著膨大的小鳞茎。本发明利用种子萌发的原生鳞茎为外植体，通过离体鳞茎的基盘切割方法，进行增殖、膨大培养，显著降低了污染率、减少了对石蒜属植物野生种球资源的损耗，并可在短期内高效率获得大量发育同步程度高、性状一致的种质群体。
【专利说明】
一种石蒜属植物快速増殖的离体原生鱗茎分生法
技术领域
[0001] 本发明是关于植物快速繁殖技术领域，特别涉及一种石蒜属植物快速增殖的离体 原生鳞茎分生法。
【背景技术】
[0002] 营养生长期长、自然繁殖系数低是制约我国石蒜属植物规模化生产繁育的两个重 要问题。自然条件下基质播种的种子一般要经过冬季休眠期，翌年春季才能萌发，在第一个 生长周期内只长出1~2枚叶片，且在未积累充足养分转变为成熟的开花鳞茎之前一般不进 行自然分球。
[0003] 然而，在组培条件下，可以通过接种前对种子的冷藏及温水浸泡等处理打破种子 休眠。同时，经过接种于不同配比激素的培养条件下加速鳞茎养分积累并促进侧芽萌发，从 而缩短鳞茎营养生长期、提高繁殖系数。
[0004] 目前，有关石蒜属植物组培扩繁体系均以成熟鳞茎为外植体实现植株再生，多采 用鳞茎块或双鳞片形式，其缺陷主要有三点：一是由于成熟鳞茎长期生活于自然土壤环境， 携带细菌、真菌等较多，组培污染率极高；二是挖取成熟鳞茎作为外植体，造成了对石蒜属 植物野生种球资源的破坏与浪费；三是通过鳞片诱导不定芽，特别是双鳞片法，诱导率较 低，同时诱导周期较长。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种污染率低、增殖率高、培 养周期短，能减少野生种球资源消耗的石蒜属植物离体原生鳞茎分生法。为解决上述技术 问题，本发明的解决方案是：
[0006] 提供一种石蒜属植物快速增殖的离体原生鳞茎分生法，具体包括下述步骤：
[0007] (1)种子的萌发培养
[0008] 在超净工作台上，取灭菌后的石蒜属植物种子接种到萌发培养基中，在光照强度 为12.5μπιο1 · m-2 · s-\光照时间为14h · d-\温度为（25±2)°C的组培条件下，进行20~30 天的培养后，种子萌发形成原生鳞茎(不同种的种子萌发率为78.3%~89.7%);
[0009] 所述萌发培养基以MS培养基(Murashige and Skoog，1962)为基本培养基，即每升 培养基中添加有4.43gMS粉，萌发培养基中还含有浓度为0~0.2mg/L的α-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid，NAA)、浓度为0~1 · Omg/L的6_节氨基腺噪呤（6-benzyladenine， 6-BA)、30g/L的蔗糖、8g/L的琼脂;且萌发培养基的pH值为5.8~5.9;
[0010] (2)原生鳞茎的增殖培养
[0011]种子萌发形成原生鳞茎后，继续培养45~60天，在超净工作台上夹出种子萌发出 的鳞茎，并接种到增殖培养基上后，在光照强度为12.5μπι〇1 · πΓ2 · ?Γ1、光照时间为14h · d 一1，温度为(25 ± 2) °C的组培条件下，进行2~3个月的增殖培养获得鳞茎丛(能获得18~37个 的不定芽）；
[0012] 所述增殖培养基以MS培养基(Murashige and Skoog，1962)为基本培养基，即每升 培养基中添加有4.43gMS粉，增殖培养基中还含有浓度为0.1~10 . Omg/L的α-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid,ΝΑΑ)、5 · Omg/L的6_节氨基腺噪呤（6-benzyladenine，6-ΒΑ)、 60g/L的蔗糖、8g/L的琼脂;且增殖培养基的pH值为5.8~5.9;
[0013] (3)不定芽的膨大培养
[0014] 从增殖培养基上取出鳞茎丛，剥落能分开的不定芽，将不定芽的基盘朝下插入膨 大培养基；
[0015] 所述膨大培养基以MS培养基(Murashige and Skoog，1962)为基本培养基，即每升 培养基中添加有4.4381^粉，膨大培养基中还含有浓度为0~2.〇1^/1^的€ [-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid，NAA)、60~90g/L的鹿糖、8g/L的琼脂;且膨大培养基的pH值为 5 · 8~5 · 9;
[0016] 然后，在光照条件为全黑暗条件或光照强度为12.5μπι〇1 · πΓ2 · ?Γ1、光照时间 14h · cf1条件，温度条件为温度为(25±2)°C的组培条件下，继续培养2~3个月，即获得显著 膨大的小鳞茎，直径在5~12_之间。
[0017] 在本发明中，所述步骤(1)中的石蒜属植物种子采用天然自交、人工杂交的石蒜属 植物种子，包括换锦花(Lycoris sprengeri)种子、长筒石蒜(Lycoris longituba)种子、红 蓝石蒜(Lycoris haywardii)种子、换锦花与长筒石蒜的杂交种子、红蓝石蒜与换锦花的杂 交种子。
[0018] 在本发明中，所述步骤（1)中，萌发培养基中含有浓度4.43g/L的MS粉、浓度为 0 · 2mg/L的α-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid ,ΝΑΑ)、浓度为 1 · 0mg/L的6_节氨基腺噪呤 (6-benzyladenine，6-BA)、30g/L的蔗糖、8g/L的琼脂;且萌发培养基的pH值为5.8。
[0019] 在本发明中，所述步骤(1)中，取灭菌后的种子进行接种的具体方法为：
[0020] 在超净工作台上，用干净的镊子夹住种子，将种孔朝下插入萌发培养基，使种子与 培养基充分接触(种子的种孔朝下是种子萌发后顺利生长的关键，胚根突破种皮后接触培 养基可以使植物充分感应培养基中的激素等营养物质，以顺利吸收养分形成原生鳞茎）。
[0021] 在本发明中，所述步骤(2)中，增殖培养基中含有浓度4.43g/L的MS粉、浓度为5mg/ L的α-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid ,ΝΑΑ)、浓度为5 · 0mg/L的6_节氨基腺噪呤（6-benzyladenine，6-BA)、60g/L的鹿糖、8g/L的琼脂。
[0022] 在本发明中，所述步骤(2)中，增殖培养基的pH值为5.8。
[0023] 在本发明中，所述步骤(2)中，将鳞茎接种到新鲜的增殖培养基的具体方法为：
[0024] 在超净工作台上，用干净的镊子夹出鳞茎，接种前用解剖刀将胚根和真叶切去(切 去的真叶为2~3cm的较长真叶，除去较长的根系，以便于小鳞茎基盘处的切割和接种后插 入培养基的直立性，同时，减少接种过程中因叶片或根系过长，在操作中引起污染），并将每 个鳞茎由基盘底部向上"十"字分切，然后以切口朝下插入增殖培养基，使伤口与增殖培养 基充分接触(基盘处的创口是原生鳞茎增殖的关键，创口接触培养基可以使植物充分感应 培养基中的激素等物质，以诱导并促进不定芽的快速形成）。
[0025] 在本发明中，所述步骤(2)中，每瓶增殖培养基接种1株原生鳞茎，且鳞茎直径为3 ~5mm〇
[0026] 在本发明中，所述步骤(3)中，膨大培养基的pH值为5.9。
[0027] 在本发明中，所述步骤(3)中，将不定芽接种到膨大培养基的具体方法为：
[0028] 从增殖培养基上取出鳞茎丛，用镊子和解剖刀切去冗余的根系及叶片，（轻轻)剥 落能分开的直径为1~5mm的不定芽(过于幼嫩且不易分离的不定芽需要附着于原生鳞茎上 才能生长，若强迫剥离则无法进一步发育、生长，故仅剥离已经成型且容易脱落的不定芽进 行膨大培养），然后将不定芽的基盘朝下插入膨大培养基(不做切割处理），每个膨大培养基 接种4~6个不定芽。
[0029] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0030] 本发明利用种子萌发的原生鳞茎为外植体，通过离体鳞茎的基盘切割方法，进行 增殖、膨大培养，显著降低了污染率、减少了对石蒜属植物野生种球资源的损耗，并可在短 期内高效率获得大量发育同步程度高、性状一致的种质群体。
[0031] 特别对于本发明以种子萌发形成的原生鳞茎为材料，增殖及膨大培养过程中污染 率为〇(除了少量<5%的种子在萌发过程中发生污染以外）。同时，基盘切割处理的组培方 法，使鳞茎充分感受培养基中的激素水平，可在较短时间内获得显著高于常规方法的不定 芽增殖率1:18~1:37，小鳞茎平均直径在6~10mm之间。在进行杂交种子扩增时，可在较短 的时间内获得大量性状一致、发育同步程度高的杂交后代群体。从而为石蒜属植物种球商 品化高效扩繁体系的建立准备条件。
【具体实施方式】
[0032]下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细描述：
[0033]下面的实施例可以使本专业的专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方 式限制本发明。
[0034]实施例1换锦花自交原生鳞茎分生法
[0035] (1)种子的萌发培养:于超净工作台上，取灭菌后的换锦花(Lycoris sprengeri) 天然自交种子进行接种，方法是用干净的镊子夹住种子，将种孔朝下插入培养基，使种子与 培养基充分接触，培养30天后，种子萌发率达89.7%，所述种子萌发培养是在光照强度为 12.5μπι 〇1 · m-2 · s-S光照时间14h · d-S温度(25±2)°C的组培条件下进行的。用于接种的 萌发培养基以MS培养基为基本培养基，还含有浓度为0.2mg/La-萘乙酸、浓度为1. Omg/1的 6_苄氨基腺嘌呤、30g/L的蔗糖、8g/L琼脂，种子萌发培养基的pH值为5.8。
[0036] (2)原生鳞茎的增殖培养:种子萌发50天后，在超净工作台上用干净的镊子夹出鳞 茎，接种到新鲜的增殖培养基上;接种前用解剖刀将胚根切去，并将每个小鳞茎由基盘底部 向上"十"字分切，切口朝下插入培养基，使伤口与增殖培养基充分接触。每培养瓶中接种1 株原生小鳞茎，经过3个月的增殖培养，Z3培养基中获得不定芽数量为25~37个;所述增殖 培养是在光照强度为12.5μπι 〇1 · m-2 · s-S光照时间14h · d-S温度(25±2)°C的组培条件下 进行的；用于接种的增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还含有浓度为0.1~10.Omg/La-萘乙酸、5. Omg/L的6-苄氨基腺嘌呤、60g/L的蔗糖、8g//L琼脂，继代培养基的pH值为5.8。具 体可查看表1中，不同原生鳞茎的增殖培养基配方及增殖效果。
[0037] (3)不定芽的膨大培养:原生鳞茎在增殖培养基上培养2个月后将其取出，用镊子 和解剖刀切去冗余的根系及叶片，轻轻剥落可分离的不定芽，直径在2~4_之间，将其基盘 朝下插入膨大培养基，每个膨大培养基接种6个不定芽，继续培养2个月，可获得显著膨大的 小鳞莖，直径在5mm~8mm之间；所述膨大培养是在光照强度约12.5μηιο1 · m-2 · s-1，光照时 间14h · cf1，温度(25±2)°C的组培条件下进行的；用于接种的膨大培养基以MS培养基为基 本培养基，所述膨大培养基中还含有浓度为2.0mg/La-萘乙酸、60g/L的蔗糖、8 g//L琼脂，膨 大培养基的pH值为5.9。
[0038]经过增殖及膨大培养，换锦花小鳞茎群体扩增迅速，鳞茎大小较为均匀，直径在5 ~8_之间，最佳增殖培养基中增殖率达到1:25~1:37。
[0039]另外，将实施例1中的换锦花(Lycoris sprengeri)天然自交种子，换成长筒石蒜 (Lycoris longituba)天然自交种子或者红蓝石蒜(Lycoris haywardii)天然自交种子也 能实现。
[0040]表1原生鳞茎的增殖培养基配方及增殖效果
[0041]
[0042] 实施例2换锦花与长筒石蒜的杂交种原生鳞茎分生法
[0043] (1)杂交种子的萌发培养：于超净工作台上，取灭菌后的换锦花（Lycoris sprengeri)与长筒石蒜(Lycoris longituba)的杂交种子进行接种，方法是用干净的镊子 夹住种子，将种孔朝下插入培养基，使种子与培养基充分接触，培养20天后，种子萌发率达 78.3%，所述杂交种子萌发培养是在光照强度为12.5μπι 〇1 · πΓ2 · ?Γ1，光照时间14h · cf1，温 度(25±2)°C的组培条件下进行的。用于接种的萌发培养基以MS培养基为基本培养基，所述 种子萌发培养基中还含有浓度为〇.2mg/La-萘乙酸、浓度为l.〇 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、 30g/L的蔗糖、8g/L琼脂，种子萌发培养基的pH值为5.8。
[0044] (2)原生鳞茎的增殖培养:种子萌发45天后，在超净工作台上用干净的镊子夹出鳞 茎，接种到新鲜的增殖培养基上;接种前用解剖刀将胚根切去，并将每个鳞茎由基盘底部向 上"十"字分切，切口朝下插入培养基，使伤口与增殖培养基充分接触。每培养瓶中接种1株 原生鳞茎，经过3个月的增殖培养，获得不定芽平均数量为18~26个;所述增殖培养是在光 照强度为12.5μπι 〇1 · m-2 · s-S光照时间14h · d-S温度（25±2)°C的组培条件下进行的；用 于接种的增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还含有浓度为5.0mg/La-萘乙酸、5.0mg/L 的6-苄氨基腺嘌呤、60g/L的蔗糖、8g/L琼脂，继代培养基的pH值为5.8。
[0045] (3)不定芽的膨大培养:原生鳞茎在增殖培养基上培养2个月后将其取出，用镊子 和解剖刀切去冗余的根系及叶片，轻轻剥落可分开的不定芽，直径在3~6_之间，将其基盘 朝下插入膨大培养基，每个膨大培养基接种4个不定芽，继续培养2个月，可获得显著膨大的 小鳞茎，直径在8mm~12mm之间；所述膨大培养是在光照强度为12·5μπι 〇1 · m-2 · s-S光照时 间14h · cf1，温度(25±2)°C的组培条件下进行的；用于接种的膨大培养基以MS培养基为基 本培养基，还含有浓度为0~2.0mg/La-萘乙酸、60~90g/L的蔗糖、8g/L琼脂，膨大培养基的 pH值为5.9〇
[0046] 经过增殖及膨大培养，换锦花与长筒石蒜的杂交鳞茎群体扩增迅速，鳞茎大小较 为均匀，最佳膨大培养基P2中直径在8~12mm之间，增殖率约1:18~1: 26。具体可查看表2 中，不同不定芽的膨大培养基端值及中间值配方及增殖效果。
[0047] 表2不定芽的膨大培养基端值及中间值配方
[0048]
[0049] 实施例3红蓝石蒜与换锦花的杂交种原生鳞茎分生法
[0050] (1)杂交种子的萌发培养：于超净工作台上，取灭菌后的红蓝石蒜（Lycoris haywardii)与换锦花(Lycoris sprengeri)的杂交种子进行接种，方法是用干净的镊子夹 住种子，将种孔朝下插入培养基，使种子与培养基充分接触，培养25天后，种子萌发率达 83.3%，所述杂交种子萌发培养是在光照强度为12.5μπι 〇1 · πΓ2 · ?Γ1，光照时间14h · cf1，温 度(25 ± 2) °C的组培条件下进行的。用于接种的萌发培养基以MS培养基为基本培养基，还含 有浓度为〇. 2mg/La-萘乙酸、浓度为1. Omg/1的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L的蔗糖、8g/L琼脂，种 子萌发培养基的pH值为5.8。
[0051] (2)原生鳞茎的增殖培养:种子萌发60天后，在超净工作台上用干净的镊子夹出鳞 茎，接种到新鲜的增殖培养基上;接种前用解剖刀将胚根切去，并将每个鳞茎由基盘底部向 上"十"字分切，切口朝下插入培养基，使伤口与增殖培养基充分接触。每培养瓶中接种1株 原生鳞茎，经过2个月的增殖培养，获得不定芽平均数量为20~31个;所述增殖培养是在光 照强度为12.5μπι 〇1 · m-2 · s-S光照时间14h · d-S温度（25±2)°C的组培条件下进行的；用 于接种的增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还含有浓度为5. Omg/La-萘乙酸、5. Omg/L 的6-苄氨基腺嘌呤、60g/L的蔗糖、8g/L琼脂，继代培养基的pH值为5.8。
[0052] (3)不定芽的膨大培养:原生鳞茎在增殖培养基上培养2个月后将其取出，用镊子 和解剖刀切去冗余的根系及叶片，轻轻剥落可分开的不定芽，直径在2~4_之间，将其基盘 朝下插入膨大培养基，每个膨大培养基接种4个不定芽，继续培养3个月，可获得显著膨大的 小鳞莖，直径在5mm~8mm之间；所述膨大培养条件分为全黑暗和光照强度为12.5μηιο1 · m 一2 · s-\光照时间14h · d-1两种类型分别实验，温度均为(25±2)°C;用于接种的膨大培养基 以MS培养基为基本培养基，还含有浓度为2. Omg/La-萘乙酸、60g/L的蔗糖、8g/lJ京脂，膨大 培养基的pH值为5.9。
[0053]经过增殖及膨大培养，红蓝石蒜与换锦花的杂交小鳞茎群体扩增迅速，增殖率达 1: 20~1: 31，直径在5~8mm之间，黑暗条件培养的小鳞茎直径较光照条件下更为均匀但直 径略小为4~7mm。
[0054]最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于 以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导 出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种石蒜属植物快速增殖的离体原生鳞茎分生法，其特征在于，具体包括下述步骤： (1) 种子的萌发培养 在超净工作台上，取灭菌后的石蒜属植物种子接种到萌发培养基中，在光照强度为 12.5μπι〇1 · m-2 · s-\光照时间为14h · d-\温度为(25±2)°C的组培条件下，进行20~30天 的培养后，种子萌发形成原生鳞茎； 所述萌发培养基以MS培养基为基本培养基，即每升培养基中添加有4.43gMS粉，萌发培 养基中还含有浓度为〇~〇.2mg/L的α-萘乙酸、浓度为〇~l.〇mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L 的蔗糖、8g/L的琼脂;且萌发培养基的pH值为5.8~5.9; (2) 原生鳞茎的增殖培养 种子萌发形成原生鳞茎后，继续培养45~60天，在超净工作台上夹出种子萌发出的鳞 茎，并接种到增殖培养基上后，在光照强度为12.5μπι〇1 · πΓ2 · ?Γ1、光照时间为14h · cf1，温 度为(25 ± 2) °C的组培条件下，进行2~3个月的增殖培养获得鳞茎丛； 所述增殖培养基以MS培养基为基本培养基，即每升培养基中添加有4.43gMS粉，增殖培 养基中还含有浓度为0 · 1~10 · 〇mg/L的α-萘乙酸、5 · Omg/L的6-苄氨基腺嘌呤、60g/L的蔗 糖、8g/L的琼脂;且增殖培养基的pH值为5.8~5.9; (3) 不定芽的膨大培养 从增殖培养基上取出鳞茎丛，剥落能分开的不定芽，将不定芽的基盘朝下插入膨大培 养基； 所述膨大培养基以MS培养基为基本培养基，即每升培养基中添加有4.43gMS粉，膨大培 养基中还含有浓度为0~2. Omg/1的α-萘乙酸、60~90g//L的蔗糖、8g//L的琼脂;且膨大培养 基的pH值为5.8~5.9; 然后，在光照条件为全黑暗条件或光照强度为12.5μπι〇1 · πΓ2 · ?Γ1、光照时间14h · cf1 条件，温度条件为温度为（25±2)°C的组培条件下，继续培养2~3个月，即获得显著膨大的 小鳞茎，直径在5~12mm之间。2. 根据权利要求1所述的一种石蒜属植物快速增殖的离体原生鳞茎分生法，其特征在 于，所述步骤（1)中的石蒜属植物种子采用天然自交、人工杂交的石蒜属植物种子，包括换 锦花种子、长筒石蒜种子、红蓝石蒜种子、换锦花与长筒石蒜的杂交种子、红蓝石蒜与换锦 花的杂交种子。3. 根据权利要求1所述的一种石蒜属植物快速增殖的离体原生鳞茎分生法，其特征在 于，所述步骤（1)中，萌发培养基中含有浓度4.43g/L的MS粉、浓度为0.2mg/L的α-萘乙酸、浓 度为1. Omg/L的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L的蔗糖、8g/L的琼脂;且萌发培养基的pH值为5.8。4. 根据权利要求1所述的一种石蒜属植物快速增殖的离体原生鳞茎分生法，其特征在 于，所述步骤(1)中，取灭菌后的种子进行接种的具体方法为： 在超净工作台上，用干净的镊子夹住种子，将种孔朝下插入萌发培养基，使种子与培养 基充分接触。5. 根据权利要求1所述的一种石蒜属植物快速增殖的离体原生鳞茎分生法，其特征在 于，所述步骤(2)中，增殖培养基中含有浓度4.43g/L的MS粉、浓度为5mg/L的α-萘乙酸、浓度 为5.〇11^/1的6-苄氨基腺嘌呤、6(^/1的蔗糖、88/1的琼脂。6. 根据权利要求1所述的一种石蒜属植物快速增殖的离体原生鳞茎分生法，其特征在 于，所述步骤(2)中，增殖培养基的pH值为5.8。7. 根据权利要求1所述的一种石蒜属植物快速增殖的离体原生鳞茎分生法，其特征在 于，所述步骤(2)中，将鳞茎接种到新鲜的增殖培养基的具体方法为： 在超净工作台上，用干净的镊子夹出鳞茎，接种前用解剖刀将胚根和真叶切去，并将每 个鳞茎由基盘底部向上"十"字分切，然后以切口朝下插入增殖培养基，使伤口与增殖培养 基充分接触。8. 根据权利要求1所述的一种石蒜属植物快速增殖的离体原生鳞茎分生法，其特征在 于，所述步骤(2)中，每瓶增殖培养基接种1株原生鳞茎，且鳞茎直径为3~5mm。9. 根据权利要求1所述的一种石蒜属植物快速增殖的离体原生鳞茎分生法，其特征在 于，所述步骤(3)中，膨大培养基的pH值为5.9。10. 根据权利要求1所述的一种石蒜属植物快速增殖的离体原生鳞茎分生法，其特征在 于，所述步骤(3)中，将不定芽接种到膨大培养基的具体方法为： 从增殖培养基上取出鳞茎丛，用镊子和解剖刀切去冗余的根系及叶片，剥落能分开的 直径为1~5mm的不定芽，然后将不定芽的基盘朝下插入膨大培养基，每个膨大培养基接种4 ~6个不定芽。
【文档编号】A01H4/00GK105830920SQ201610201968
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月1日
【发明人】夏宜平, 任梓铭
【申请人】浙江大学