一种快速获得小卷蛾斯氏线虫整齐龄期感染期幼虫的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速获得小卷蛾斯氏线虫整齐龄期感染期幼虫的方法。将怀有成熟卵的怀卵雌虫加入纯水中孵育，获得整齐龄期感染期幼虫。本发明的快速获得小卷蛾斯氏线虫整齐龄期感染期幼虫的方法，能使卵不经过成虫阶段直接发育成感染期幼虫，从而直接从小卷蛾斯氏线虫母体中获得感染期幼虫，极大地缩短了获得整齐感染期幼虫的时间，为应用RNAi研究昆虫病原线虫环境抗性相关基因功能和对昆虫病原线虫进行基因改造提供了基础。
【专利说明】
一种快速获得小卷蛾斯氏线虫整齐龄期感染期幼虫的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物农药领域，具体涉及一种快速获得小卷蛾斯氏线虫整齐龄期感染 期幼虫的方法。
【背景技术】：
[0002] 昆虫病原线虫是一种生物活体制剂，作为新型生物农药已广泛用于防治农林、牧 草、花卉和卫生等重要害虫。昆虫病原线虫能够主动搜寻寄主昆虫，对于防治蛀干及地下害 虫的幼虫效果明显，产生很大的经济、生态和社会效益。昆虫病原线虫的感染期幼虫是昆虫 病原线虫生活史中唯一能在寄主昆虫体外的存活的龄期，是商业化生产和商品化制剂的主 要活性成分。昆虫病原线虫在田间防治害虫时，环境因子如干燥、低温、渗透压、紫外照射等 的影响会削弱昆虫病原线虫在田间对害虫的防治效果，因此对昆虫病原线虫感染期幼虫抗 环境压力相关基因的研究尤为重要，是对昆虫病原线虫进行基因改造的基础，将有助于推 进昆虫病原线虫的应用。昆虫病原线虫卵缠在母体内并在母体内孵化，在感染期幼虫形成 之前，幼虫取食母体组织，该过程称为"·母过程"（endotokia matricidea)，母体组织的利 用有利于将昆虫营养转化为感染期幼虫的生物能量。在外界营养供给不足或者环境恶劣 时，噬母现象可以保证感染期幼虫的形成以确保昆虫病原线虫的存活。在昆虫病原线虫感 染寄主昆虫体内或在体外进行培养时，由于有充足的营养，感染期幼虫恢复后经历多代才 形成新的感染期幼虫。已有研究表明，使用双链RNA(dsRNA)对昆虫病原线虫卵进行浸泡可 以将外源的dsRNA导入卵内，dsRNA能干扰(RNAi)昆虫病原线虫卵内的特定基因的转录，从 而鉴定特定基因的功能。由于昆虫病原线虫抗环境压力的能力仅在感染期幼虫龄期中体现 才有意义，因此应用RNAi来研究相关基因的功能需要收集到卵导入dsRNA后能直接发育而 成的感染期幼虫。因此，能从昆虫病原线虫母体中直接获得整齐龄期的感染期幼虫，是开展 RNAi从而研究环境抗性相关基因功能的基础，也是对昆虫病原线虫进行基因改造的基础。
【发明内容】
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[0003] 本发明的目的是提供一种能够快速获得小卷蛾斯氏线虫整齐龄期感染期幼虫的 方法。
[0004] 本实验应用不同的孵育液来孵育小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae All 怀卵成虫，以寻找可以从昆虫病原线虫母体中直接获得感染期幼虫的方法。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0006] -种快速获得小卷蛾斯氏线虫整齐龄期感染期幼虫的方法，将怀有成熟卵的怀卵 雌虫加入纯水中孵育，获得整齐龄期感染期幼虫。
[0007] 具体步骤如下：
[0008] 1)使用海绵培养基培养小卷蛾斯氏线虫，将整齐龄期的感染期幼虫洗出，低温保 存备用；
[0009] 2)接种洗出的感染期幼虫到长满相应共生细菌的ΝΒ0平板，25~28°C培养3~4d至 线虫长成成虫且母虫体内怀有成熟的卵，在无菌条件下将怀卵雌虫洗出；
[0010] 3)于培养板的孔内加入纯水，每孔挑入1头怀卵雌虫，培养板用封口膜封口，26°C 孵育，获得整齐龄期感染期幼虫。
[0011]优选，步骤3)所述的培养板为96孔板。
[0012]优选，步骤3)所述的培养板的孔内加入纯水的量为每孔50yL。
[0013]优选，步骤2)所述的在无菌条件下将怀卵雌虫洗出所用的洗出液为Ringer's液1 或Ringer' s液2〇
[0014] 本发明的有益效果是:本发明的快速获得小卷蛾斯氏线虫整齐龄期感染期幼虫的 方法，能使卵不经过成虫阶段直接发育成感染期幼虫，从而直接从小卷蛾斯氏线虫母体中 获得感染期幼虫，极大地缩短了获得整齐感染期幼虫的时间，为应用RNAi研究昆虫病原线 虫环境抗性相关基因功能和对昆虫病原线虫进行基因改造提供了基础。
【附图说明】：
[0015] 图1是不同孵育液中开始形成感染期幼虫的时间；不同字母表示感染期幼虫形成 的时间之间存在显著性差异(Duncan检验，P〈0.05);
[0016] 图2是不同孵育液全部形成感染期幼虫的时间；不同字母表示感染期幼虫全部形 成的时间之间存在显著性差异(Duncan检验，P〈0.05)。
【具体实施方式】：
[0017] 下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描 述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明 中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施 例，都属于本发明保护的范围。
[0018] 实施例1:
[0019] 1.材料与方法
[0020] 1.1昆虫病原线虫
[0021] 小卷蛾斯氏线虫S.carpocapsae All的感染期幼虫由广东省昆虫研究所以人工固 体培养基培养获得(韩日畴，1995)，以浅水层方法贮存于10± 1°C条件下，贮存期不超过15 天。
[0022] 1.2孵育液的配制
[0023]用于怀卵成虫的孵育液包括纯水、质量分数0.9 %的氯化钠溶液（N a C1 )、P B S (pH7 · 0)、Ringer ' s液 1、Ringer ' s液2、P溶液、LB培养液和NB培养液。
[0024]质量分数0.9%的氯化钠溶液:每升含有:NaCl 9g，余量为水，其配制方法是将上 述成分混合均匀。于121°C，1.05kPa灭菌30min，室温保存备用。
[0025] PBS(pH7.0):每升含有：NaCl 8.5g、Na2HP〇4 2.2g和NaH2P〇4 0.4g，余量为水，其配 制方法是将上述成分混合均匀。于121°C，1.05kPa灭菌30min，室温保存备用。
[0026] Ringer's液 1:每升含有：NaCl 9g、KCl 0.4g、CaCl2 0.5g和NaHC03 0.2g，余量为 水，其配制方法是将上述成分混合均匀。于121°C，1.05kPa灭菌30min，室温保存备用。
[0027] Ringer's液2:每升含有：NaCl 5.8g、KCl 0.1g、CaCl2 0.2g、MgCl2 · 6H20 0.2g和 HEPES1.2g，余量为水，其配制方法是将上述成分混合均匀。于121°C，1.05kPa灭菌30min，室 温保存备用。
[0028] P溶液:每升含有：蛋白胨10g和NaCl 10g，余量为水，其配制方法是将上述成分混 合均匀。于121°C，1.05kPa灭菌30min，室温保存备用。
[0029] LB培养液:每升含有：蛋白胨10g、酵母粉5g和NaCl 10g，余量为水，其配制方法是 将上述成分混合均匀。于121°C，1.05kPa灭菌30min，室温保存备用。制备LB固体培养基时， 每升LB培养液中加入15~18g琼脂粉，灭菌后倒LB平板，冷却后保存备用。
[0030] NB培养液：每升含有：营养肉汤18g，余量为水，其配制方法是将上述成分混合均 勾。于121°C，1.05kPa灭菌30min，室温保存备用。
[0031] 1.3NB0培养基的配制
[0032] ΝΒ0固体培养基:每升含有:营养肉汤18g、玉米油10g和琼脂粉15g，余量为水，其配 制方法是将上述成分混合均匀。于121°C，1.05kPa灭菌30min，倒ΝΒ0平板，冷却后保存备用。 [0033] 1.4感染期幼虫的诱导
[0034]挑取LB平板上活化的小卷蛾斯氏线虫共生细菌嗜线虫致病杆菌（Xenorhabdus nematophi la)Al 1的菌落，接入LB培养基中，于25 °C，200rpm培养24h后，取200yL菌液涂布到 ΝΒ0平板上，25 °C倒置培养2d。
[0035] 将小卷蛾斯氏线虫感染期幼虫接种到长好Xenorhabdus nematophila All共生细 菌的ΝΒ0培养基上，每日观察感染期幼虫发育情况，3天后线虫发育成成虫且怀有成熟的卵。 在超净工作台内用无菌Ringer's液1将怀卵成虫洗出，清洗怀卵成虫3次。于96孔板内每孔 加入50yL的孵育液，每种孵育液12个孔，每孔挑入1条小卷蛾斯氏线虫的怀卵雌虫，每个处 理重复3次。26°C孵育，每24h观察卵孵化及幼虫发育情况，观察两周。实验用不同批次的共 生细菌和线虫重复3次。
[0036] 1 · 5感染期幼虫对大蜡螟的感染力
[0037]在培养皿中测定线虫对大蜡螟的感染力(Yan et al.，2012)。收集诱导形成的感 染期幼虫，灭菌水重悬，在垫有2层中速定性滤纸(新华牌)的灭菌培养皿(6cm)中挑入5头大 蜡螟末龄幼虫，然后均匀滴入lmL含有100条在纯水中形成的感染期幼虫，封口膜封好后置 于25°C黑暗条件下，对照为无菌水处理的大蜡螟。3天后检查大蜡螟的死亡情况，5天后解剖 大蜡螟，检查线虫侵染及发育情况。
[0038] 1.6数据统计
[0039] 计算怀卵雌虫的存活率，卵孵化的比例，感染期幼虫形成最短时间，全部幼虫形成 感染期幼虫的时间，单条雌虫最终形成感染期幼虫的数量，以及感染期幼虫对大蜡螟的致 死率。统计分析使用SPSS软件(版本为16.Ofor Windows)进行。百分数值均经反正弦转换后 进行方差分析，采用Duncan检验各处理之间的差异显著性，显著水平P〈0.05。
[0040] 2.结果与分析
[0041 ] 2.1怀卵雌虫存活及卵孵化情况
[0042] 怀卵雌虫在P溶液、LB培养液和NB培养液中的存活时间及比例见表1，在这3种孵育 液中，由于菌的大量生长，孵育液变混浊，怀卵雌虫最短仅存活1天，最长3天即死亡。雌虫体 内卵不孵化，会释放部分卵到体外，LB培养液中释放的卵不孵化，P溶液和NB培养液中有部 分卵可孵化至1龄幼虫后死亡（比例分别为58.3%及37.5%)。怀卵雌虫在纯水、质量分数 0.9 %的氯化钠溶液、PBS、Ringer ' S液1和Ringer ' S液2这5种孵育液中均可以存活至体内卵 孵化后耗尽雌虫营养，体外卵均可孵化并发育至2龄幼虫。
[0043] 表1.怀卵雌虫在不同孵育液中的存活时间及存活率
[0044]
[0045] 不同字母表示相同处理时间下不同孵育液中怀卵雌虫的存活率之间存在显著性 差异(Duncan检验，P〈0.05)。
[0046] 2.2感染期幼虫的形成
[0047] 不同孵育液中开始形成感染期幼虫的时间见图1。感染期幼虫在纯水中最快形成， 最快仅需要2.5天的时间即可观察到感染期幼虫的形成;感染期幼虫在PBS溶液中形成所需 要的时间最长，最长需要6天才能观察到感染期幼虫的形成。
[0048] 在观察的2周时期内，孵育单条怀卵雌虫的8种孵育液中，仅在纯水、Ringer's液1 和Ringer ' s液2中可观察到2龄幼虫全部转化成感染期幼虫，所需的时间见图2。2周内，其他 孵育液中的幼虫或全部死亡，或者仍未完全转变成感染期幼虫。
[0049] 2.3单条怀卵雌虫形成感染期幼虫的数量及感染力
[0050] 单条怀卵雌虫产生的感染期幼虫的数量差异较大，实验中观察到的最多能形成66 条感染期幼虫，单条怀卵雌虫平均能形成21±5条感染期幼虫。感染期幼虫感染大蜡螟后3 天大蜡螟死亡率为100% (对照大蜡螟全部存活）；5天后解剖大蜡螟，体内由感染期幼虫发 育而成的母虫已死亡，幼虫已发育至2-3龄。10天后有感染期幼虫爬出大蜡螟尸体。
[0051] 以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种快速获得小卷蛾斯氏线虫整齐龄期感染期幼虫的方法，其特征在于:将怀有成 熟卵的怀卵雌虫加入纯水中孵育，获得整齐龄期感染期幼虫。2. 根据权利要求1所述的快速获得小卷蛾斯氏线虫整齐龄期感染期幼虫的方法，其特 征在于，具体步骤如下： 1) 使用海绵培养基培养小卷蛾斯氏线虫，将整齐龄期的感染期幼虫洗出，低温保存备 用； 2) 接种洗出的感染期幼虫到长满相应共生细菌的NBO平板，25~28 °C培养3~4d至线虫 长成成虫且母虫体内怀有成熟的卵，在无菌条件下将怀卵雌虫洗出； 3) 于培养板的孔内加入纯水，每孔挑入1头怀卵雌虫，培养板用封口膜封口，26°C孵育， 获得整齐龄期感染期幼虫。3. 根据权利要求2所述的快速获得小卷蛾斯氏线虫整齐龄期感染期幼虫的方法，其特 征在于:步骤3)所述的培养板为96孔板。4. 根据权利要求2或3所述的快速获得小卷蛾斯氏线虫整齐龄期感染期幼虫的方法，其 特征在于:步骤3)所述的培养板的孔内加入纯水的量为每孔50yL。5. 根据权利要求2或3所述的快速获得小卷蛾斯氏线虫整齐龄期感染期幼虫的方法，其 特征在于：步骤2)所述的在无菌条件下将怀卵雌虫洗出所用的洗出液为Ringer's液1或 Ringer' s液2〇
【文档编号】A01K67/033GK105831019SQ201610257254
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月21日
【发明人】颜珣, 韩日畴
【申请人】广东省昆虫研究所