一种利用ApoE-/-小鼠建立非酒精性脂肪肝模型的方法
【专利摘要】本发明涉及非酒精性脂肪肝病动物模型的建立，具体为伴有严重血脂异常的一类高脂诱导的非酒精性脂肪肝动物模型的建立。选用SPF级雄性AopE?/?小鼠和C57BL/6小鼠，按照鼠种随机分模型组和对照组，共4组，每组8只，所有小鼠用普通维持饲料适应性喂养1周后，模型组给予高脂饲料，对照组给予对照饲料，10周后取血处死，检测常规血脂四项及肝功能；取鲜活肝组织匀浆，测定组织内胆固醇与甘油三酯含量；另取肝组织做石蜡、冰冻切片，分别进行H.E.和油红O染色，判定NAFLD模型效果与质量。本发明使用单纯性高脂高热量饮食造模，在很短的周期10周内造出重度NAFLD模型，模型血脂、肝脏脂肪等指标稳定性极好，可重复性高，为NAFLD高质量模型的建立提供了一种可靠的方法。
【专利说明】
一种利用ApoE-/-小鼠建立非酒精性脂肪肝模型的方法
技术领域
[0001]本发明涉及非酒精性脂肪肝病(NAFLD)动物模型的建立，具体为伴有严重血脂异 常的一类高脂诱导的非酒精性脂肪肝动物模型的建立。
【背景技术】
[0002] 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明确的损肝因素以外，导致肝细 胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征。NAFLD由一系列连续发展的疾病组成，早 期仅发生单纯性脂肪肝(SFL)与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。随着病变的发展，最终引发肝 组织的纤维化，并导致肝硬化的形成。同时NAFLD所引起的肥胖和血脂异常也是导致其他代 谢障碍性疾病的罪归祸首，如动脉粥样硬化(AS)、高血压和二型糖尿病等。随着社会的进 步，人们饮食结构发生了改变，大批高脂肪，高胆固醇，高热量的食物进入了人们的餐桌，伴 随而来的是我国脂肪肝发病率的不断提升，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝脏疾病。
[0003] 人们常用各种手段来研究各种疾病，其中最重要的方法之一就是构建动物模型。 为了更全面了解脂肪肝的发生过程，已进行了许多临床研究。然而，NAFLD病情演变与发展 时间很长，这很大程度上限制我们得到具有合理解释性的数据。于是，研究者将注意力转至 发展合适的动物模型方向来探明脂肪肝形成过程。建立一个稳定可靠、病理演变过程符合 的NAFLD动物模型，对研究NAFLD的发病机制及治疗方法具有重要意义。
[0004] 现有的非酒精性脂肪肝动物模型类别繁杂，动物选择上也各有长短，啮齿类动物 多为SD大鼠、wistar大鼠、C57BL/6小鼠、荷兰兔等，非啮齿类动物包括猪、犬等。这些动物模 型虽能在一定程度上反应非酒精性脂肪肝发病进程，但大都存在稳定性差，成模周期长的 特点。本文特别采用以C57BL/6为背景的ApoE-/-基因敲除鼠代替野生型C57BL/6作为研究 对象，ApoE-/-小鼠因为载脂蛋白E的缺乏，导致先天性脂类代谢障碍，小鼠每日摄入充足的 高脂食物不能及时代谢出体外，造成脂质在肝脏的积累。更重要的是，ApoE-/-小鼠模型出 现严重的血脂异常，这是脂肪肝发展进程中的一个重要指标，为进一步探讨NAFLD和心血管 疾病互为作用的发病机制，提供了一种可靠的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种利用ApoE-/-小鼠建立经高脂诱导的伴有严重血脂异常的单纯性 脂肪肝病变动物模型。
[0006] 本发明选用SPF级雄性AopE-/-小鼠和C57BL/6小鼠，按照鼠种随机分模型组和对 照组，共4组，每组8只。所有小鼠用普通维持饲料适应性喂养1周后，模型组给予高脂饲料， 对照组给予对照饲料，早晚各一次定量定投饲料，保证40g/笼，每笼4只小鼠。10周后取血处 死，检测常规血脂四项（1'(：、了6、0^-(3、^1-(3)及肝功能以1^和431');取鲜活肝组织匀浆，测 定组织内胆固醇与甘油三酯含量；另取肝组织做石蜡、冰冻切片，分别进行H.E.和油红0染 色，判定NAFLD模型效果与质量。
[0007] 本发明特点采用以C57BL/6为背景的ApoE-/-基因敲除鼠，经高脂饮食诱导发展形 成非酒精性脂肪肝模型。ApoE-/-小鼠因为载脂蛋白E的缺乏，导致先天性脂类代谢障碍，使 得每日摄食的脂质不能在体内正常运输，造成其在肝脏中的积累，同时伴有严重的血脂异 常，与NAFLD临床病理相似度极高。C57BL/6小鼠在本发明中作为对照使用。本发明方法中的 动物饲料为对照饲料(ND)和高脂饲料(HFD)均购自江苏美迪森生物医药有限公司。本发明 方法中的SPF级雄性AopE-/-小鼠购自江苏省常州市卡文斯实验动物有限公司；SPF级雄性 C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0008] 本发明使用单纯性高脂高热量饮食造模，亦可以在很短的周期10周内，造出重度 NAFLD模型。更重要的是，模型血脂、肝脏脂肪等指标稳定性极好，可重复性高。为NAFLD高质 量模型的建立，提供了一种可靠的方法。
【附图说明】
[0009] 图1是对照饲料喂养的C57BL/6小鼠肝脏病理切片图（H.E.染色X400);
[0010]图2是对照饲料喂养的AopE-/-小鼠肝脏病理切片图（H.E.染色X400);
[0011]图3是高脂饲料喂养的C57BL/6小鼠肝脏病理切片图（H.E.染色X400);
[0012]图4是高脂饲料喂养的AopE-/-小鼠肝脏病理切片图（H.E.染色X400);
[0013]图5是对照饲料喂养的C57BL/6小鼠肝脏病理切片图（油红0染色X400);
[0014]图6是对照饲料喂养的AopE-/-小鼠肝脏病理切片图（油红0染色X400);
[0015] 图7是高脂饲料喂养的C57BL/6小鼠肝脏病理切片图（油红0染色X400);
[0016] 图8是高脂饲料喂养的AopE-/-小鼠肝脏病理切片图（油红0染色X400)。
【具体实施方式】
[0017]实施例丨本发明动物模型的制备
[0018] 1、实验动物：SPF级雄性AopE-/-小鼠，6~8周龄，体重（22 ± 2) g，购自江苏省常州 市卡文斯实验动物有限公司【SCXK(苏UOll-OOShSPF级雄性C57BL/6小鼠，6~8周龄，体重 (22±2)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2011-0011】。
[0019] 2、实验动物均饲养于本部屏障环境内，温度22~25°C，湿度50%，12小时昼夜交 替。
[0020] 3、实验动物经适应性喂养1周后，随机分四组，每组8只，详细分组情况如下表1。造 模10周，早晚各一次定量定投饲料，保证40g/笼，每笼4只小鼠，期间自由引水，水源为SPF级 的灭菌水，每两周称量体重一次。动物饲料为对照饲料(MD12031)和高脂饲料(MD12032)均 购自江苏美迪森生物医药有限公司。
[0021] 表1动物详细分组
[0023] 4、造模10周后，各组小鼠同一时间全部处死，处死前禁食12小时。4%水合氯醛腹 腔注射麻醉，摘眼球取血后，全血37°C静置1小时，4°C放置血块析出，3000rmp离心10min取 上层血清。全自动生化分析仪检测血清中的TC、TG、LDL-c、HDL-c、AST和ALT等指标，结果如 表2所示。
[0024] 表2各组血清生化指标变化表(^±s、n = 6)
[0026]注：TC、TG、LDL-C和HDL-C单位为mmol/L，AST和ALT单位为U/Ua:与A组比较，P〈 0.01;b:与 B组比较，P〈0.01;c:与C组比较，P〈0.01。
[0027]高脂饲料喂养的AopE-/-小鼠组相较于其他三组TC、TG和LDL-C均有极显著上升(P 〈0.01);高脂饲料喂养的C57BL/6小鼠组相较于对照饲料喂养的C57BL/6小鼠组TC、TG和 LDL-C均有极显著降上升（P〈0.01)但数值相较差距不大；有趣的是同是对照饲料喂养的 AopE-/-小鼠组相较于对照饲料喂养的C57BL/6小鼠组TC、TG和LDL-C均有极显著降上升(P〈 0.01)且数值差距较大。各组间血清中AST和ALT指标没有显著性差异，显示出高脂诱导10 周，各组肝脏没有较大损伤，根据NAFLD病情发展判断，本发明中模型应为单纯性脂肪肝。以 上数据表明ApoE-/-小鼠在血清脂质提升上的优势比较明显。
[0028] 5、肝脏脂质的检测，具体方法以一只小鼠为例，分别各取100mg新鲜肝组织根据试 剂盒自带裂解液各加lml进行匀浆，各自匀浆液一部分用来检测甘油三酯(TG)和总胆固醇 (TC)的含量，另一部分分别测定其蛋白含量，最后必须用每毫克蛋白浓度来校正甘油三酯 (TG)和总胆固醇。甘油三酯（组织)酶法测定试剂盒(E1013)和总胆固醇（组织)含量测定试 剂盒(E1015)购自北京普利莱基因技术有限公司。结果如表3所示。
[0029]表3各组肝脏脂质变化表(S±s ,n = 6)
[0031] 注：TC和TG的单位为mmol/kga:与A组比较，P〈0 ? 01;b:与B组比较，P〈0 ? 01; c :与C 组比较，P〈〇.〇l。
[0032] 与血脂对应的是ApoE-/-小鼠肝脏脂质蓄积比较严重，其中高脂饲料喂养的 AopE-/-小鼠组相较于其他三组，肝脏TG和TC上升明显（P〈0.01)，高脂饲料喂养的C57BL/6 小鼠组相较于对照饲料喂养的C57BL/6小鼠组肝脏TG和TC上升也是比较明显(P〈0.01)说明 C57BL/6小鼠高脂诱导成功，但效果逊于ApoE-/-小鼠。
[0033] 6、肝脏组织病理学的检测，具体方法以一只小鼠为例，取肝脏同一部位，分两份。
[0034] 6a、一部分用Bouin ' S固定液固定，用作石錯切片进行H. E.染色。
[0035] 6b、另一部分用4%多聚甲醛固定液固定，用作冰冻切片进行油红0染色。
[0036]由病理切片可以看出，对照饲料喂养的C57BL/6小鼠肝组织结构紧凑，放射性肝锁 结构清晰，细胞核质饱满（图1和5);对照饲料喂养的AopE-/-小鼠肝组织结构依旧清晰，但 细胞外周已出现轻微的脂肪侵润，应发展至轻度脂肪肝(图2和6);高脂饲料喂养的C57BL/6 小鼠组肝细胞内已发生脂肪病变，出现空泡面积已达1/2以上，应发展为中度脂肪肝（图3和 7);高脂饲料喂养的AopE-/-小鼠组，已经出现严重的肝细胞脂肪弥漫集聚，呈大脂滴样，已 发展为重度脂肪肝(图4和8)。进一步说明基因敲除ApoE-/-小鼠NAFLD模型的成功。
[0037]综上所述，利用ApoE-/-小鼠经高脂诱导成功建立了伴有严重血脂异常的非酒精 性脂肪肝NAFLD动物模型。为研究NAFLD发病机理尤其是NAFLD与心血管疾病脂质代谢异常 所形成的相互作用提供了一种新型动物模型。
【主权项】
1. 一种利用ApoE-/-小鼠建立非酒精性脂肪肝模型的方法，期特征在于，建立模型的步 骤为： 1) 、选取鼠种：分别选取SPF级雄性ΑορΕ-/-小鼠，6~8周龄，体重22 ± 2g，SPF级雄性 C57BL/6小鼠，6~8周龄，体重22±2g，饲养于本部屏障环境内，温度22~25°C，湿度50%，12 小时昼夜交替，适应性喂养1周； 2) 、分组与造模:经适应性喂养1周后，随机分四组，其中ΑορΕ-/-小鼠两组，命名为对照 组Β和高脂组D，C57BL/6小鼠两组，命名为对照组Α和高脂组C，每组8只；造模10周，期间对照 组喂食对照饲料，高脂组喂食高脂饲料，早晚各一次定量定投饲料，保证40g/笼，每笼4只小 鼠，自由引水，水源为SPF级的灭菌水，每两周称量体重一次； 3) 、采血与检测：造模10周后，各组小鼠同一时间全部处死，处死前禁食12小时，4%水 合氯醛腹腔注射麻醉，摘眼球取血后，全血37°C静置1小时，4°C放置血块析出，3000rmp离心 1 Omin取上层血清，全自动生化分析仪检测血清中的TC、TG、LDL-c、HDL-c、AST和ALT指标； 4) 、肝脏脂质的检测：各组以一只小鼠为例，分别各取100mg新鲜肝组织根据试剂盒自 带裂解液各加lml进行匀浆，各自匀浆液一部分用来检测甘油三酯TG和总胆固醇TC的含量， 另一部分分别测定其蛋白含量，最后必须用每毫克蛋白浓度来校正甘油三酯TG和总胆固醇 TC； 5) 、肝脏组织病理学的检测：各组以一只小鼠为例，取肝脏同一部位，分两份，一部分用 Bouin's固定液固定，用作石錯切片进行H.E.染色，另一部分用4%多聚甲醛固定液固定，用 作冰冻切片进行油红〇染色； 6) 、对步骤3)-步骤5)进行分析，确定利用ApoE-/-小鼠经高脂诱导成功建立了伴有严 重血脂异常的非酒精性脂肪肝NAFLD动物模型。
【文档编号】A23K50/50GK105850868SQ201610189192
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月28日
【发明人】刘庆平, 路遥, 林家彬, 王仁军
【申请人】大连大学