一种浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法
【专利摘要】本发明公开了一种浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，包括1）外植体预处理，2）红花油茶果的灭菌及无菌体系的建立，3）接种及愈伤组织的诱导，4）体细胞胚的诱导，5）次生胚的诱导，6）次生胚分化成壮苗。本发明的浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，以N6+NAA 1.0mg/L+6?BA 1.0mg/L+2,4?D 1.0mg/L为培养基诱导胚性愈伤组织，接种后，经过7d左右培养，培养基上的子叶块开始膨大，15d左右子叶块的周边开始出现大量淡黄色、致密紧实、表面光滑有光泽的胚性愈伤组织。将胚性愈伤组织转接到体胚诱导培养基上以后，20d左右就开始出现体细胞胚。经过次生胚的增殖和分化培养，15d左右分化出芽和根，最终形成壮苗。本发明建立出高效的浙江红花油茶体胚发生体系，为浙江红花油茶提供大量幼苗。
【专利说明】
一种浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法
技术领域
[0001]本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法。
【背景技术】
[0002 ] 浙江红花油茶，另Ij名:浙江红山茶。学名:Camellia chekiangoleosa。山茶科，山茶属，是我国特有的树种。分布于浙江南部、江西东部，以及浙江、福建、安徽三省边境的高山上。浙江红花油茶具有观赏和油用两种用途。植株形态优美，叶色翠绿，具有美丽硕大的红花，色彩艳丽，果实形如苹果，夏秋季满树红果，寒性强，为山茶抗性育种的优良亲本。该树种其茶仁出油率高，油质好，茶油品质和出油率均优于普通油茶，是一种很好的食用油料来源，有很好的经济前景，市场开发潜力巨大。浙江红花油茶资源分布大多处于野生或半野生状态，自然生境遭受人为因素破坏严重，接近濒危。
[0003]油茶的自然繁殖率低，因此可以采用组织培养快繁技术解决，目前国内外尚未浙江红花油茶相关组培技术报道。
【发明内容】
[0004]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供了一种浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，建立出高效的浙江红花油茶体胚发生体系，短时间可以为浙江红花油茶提供大量幼苗。
[0005]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是:
一种浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，步骤如下:
1)以浙江红花油茶种子作为材料，去外壳，灭菌后备用；
2)去除灭好菌的种子的胚芽、胚轴、胚根，只留下子叶，将子叶切面贴在胚性愈伤组织诱导培养基表面进行接种;控温控湿，先进行暗培养，之后光照培养，直至诱导出愈伤组织；胚性愈伤组织诱导培养基配方为:N6+ 1.0mg/L NAA+1.0-2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D；
3)取胚性愈伤组织，切块，接种到体胚诱导培养基中，进行体胚诱导培养;体胚诱导培养基配方为:N6+ 1.0mg/L NAA+2.0-3.0 mg/L 6-BA；
4)采用步骤3)的方法，在次生胚诱导培养基上进行次生胚的诱导;次生胚诱导培养基配方:N6+ 0.5mg/L NAA+1.0-2.0mg/L ZT+0- 0.0Olmg/L TDZ；
5)将次生胚转接到N6培养基上培养，1d后分化出芽和根，最终形成壮苗。
[0006]步骤I)中，选用福建省武夷山浙江红花油茶的种子作为材料，小心去掉种子外壳，避免对种子造成损伤;用清水将种子浸泡1.5h;之后，去除种皮;用洗涤剂进行清洗，并流水冲洗2h。
[0007]步骤I)中，将超净工作台用75%的酒精擦拭，开启紫外灯灭菌20min;将流水冲洗好的种子用镊子装入无菌瓶中，倒入75%的酒精，使种子完全浸入酒精中，搅动灭菌30S，倒出酒精用无菌水冲洗I次;倒入0.1%升汞搅动灭菌，搅动灭菌8min，倒出升汞，用无菌水冲洗4-5次。
[0008]步骤2)中，将接种好的培养瓶置于人工气候恒温培养箱中，先进行暗培养3d，之后光照24h/d，光照强度20001x，温度控制在25°C，相对湿度保持在40_50%。
[0009]步骤2)中，经过7d的培养，接种于培养基上的子叶块开始膨大，15d子叶块的周边开始出现大量的胚性愈伤组织。
[0010]步骤2)中，胚性愈伤组织诱导培养基配方:N6+ 1.0mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+1.0mg/L 2，4_Do
[0011]步骤2)中，胚性愈伤组织诱导培养基配方:N6+ 1.0mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+1.0mg/L 2，4_Do
[0012]步骤3)中，体胚诱导培养基配方:N6+ 1.0mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA。
[0013]步骤4)中，次生胚诱导培养基配方:N6+ 0.5mg/L NAA+1.0mg/L ZT+ 0.0Olmg/LTDZ0
[0014]步骤4)中，次生胚诱导培养基配方:N6+ 0.5mg/L NAA+1.0mg/L ZT。
[0015]有益效果:与现有技术相比，本发明的浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，以N6+NAA 1.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L为培养基诱导胚性愈伤组织，接种后，经过7d左右培养，培养基上的子叶块开始膨大，15d左右子叶块的周边开始出现大量淡黄色、致密紧实、表面光滑有光泽的胚性愈伤组织。将胚性愈伤组织转接到体胚诱导培养基上以后，20d左右就开始出现体细胞胚。经过次生胚的增殖和分化培养，15d左右分化出芽和根，最终形成壮苗。本发明建立出高效的浙江红花油茶体胚发生体系，短时间可以为浙江红花油茶提供大量幼苗，具有很好的实用性。
【附图说明】
[0016]图1是浙江红花油茶外植体接种后I周图；
图2是浙江红花油茶含有各个发育阶段的愈伤组织团块图图3是浙江红花油茶的次生胚图；
图4是次生胚分化成苗图。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0018]实施例1
一种浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，步骤如下:
I)外植体预处理
选用福建省武夷山浙江红花油茶2014年10月所收获的种子作为材料，小心去掉种子外壳，避免对种子造成损伤。用清水将种子浸泡1.5h。之后，去除种皮。用洗涤剂进行清洗，并流水冲洗2h。
[0019]2)红花油茶果的灭菌及无菌体系的建立
将超净工作台用75%的酒精擦拭，开启紫外灯灭菌20min。将流水冲洗好的种子用镊子装入无菌瓶中，倒入75%的酒精，使种子完全浸入酒精中，搅动灭菌30S，倒出酒精用无菌水冲洗I次。倒入0.1%升汞搅动灭菌，搅动灭菌8min，倒出升汞，用无菌水冲洗4_5次。
[0020]3)接种及愈伤组织的诱导
将灭好菌的种子按粒置于无菌培养皿中，用无菌解剖刀延种子子叶缝垂直方向对半切开，小心地去除胚芽、胚轴、胚根，只留下子叶，将切面贴在胚性愈伤组织诱导培养基表面进行接种。将接种好的培养瓶置于人工气候恒温培养箱中，先进行暗培养3d，之后光照24h/d，光照强度20001x，温度控制在25°C，相对湿度保持在40-50%。
[0021]经过7d左右的培养，如图1所示，接种于培养基上的子叶块开始膨大，15d左右子叶块的周边开始出现大量的胚性愈伤组织。这些胚性愈伤组织长势良好，呈现出淡黄色、致密紧实、表面光滑有光泽、量多的状态。
[0022]以N6培养基作为基本培养基，配置出不同配方的胚性愈伤组织诱导培养基，进行多组平行对比培养，发现不同培养基对诱导率影响很大，具体如下:
N6+ 1.0mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4_0，诱导率68.67%;
N6+ 1.0mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4_0，诱导率57.65%;
N6+ 1.0mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L 2，4_D，诱导率37%;
N6+ 1.0mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA+0.5?2.0 mg/L 2，4_D，诱导率<30%。
[0023]4)体细胞胚的诱导
打开培养皿，用镊子轻轻夹住胚性愈伤组织，并用刀将其切成若干块(红花油茶胚性愈伤组织有抱团生长的习性，因此要控制好切块的大小，以保证胚性愈伤组织能继续生长)，盖好培养皿。用镊子把切好的胚性愈伤组织放到冷却至固体的体胚诱导培养基中，将接种好的培养瓶置于人工气候恒温培养箱中进行培养，光照24h/d，光照强度20001x，温度控制在25°C，相对湿度保持在40-50%。
[0024]将胚性愈伤组织转接到体胚诱导培养基上，如图2所示，图a、d为胚性愈伤组织，图b中可以明显地看出球形胚、心形胚，图e、f中已经分化形成了幼芽，图c、g、h、i中可以看到非常粗壮的根，20d左右开始出现体细胞胚。并且，在同一个胚性愈伤组织上可以观察到不同发育时期的体细胞胚发育早期形态，包括了球形胚、心形胚以及子叶形胚等。
[0025]以N6培养基作为基本培养基，配置出不同配方的体胚诱导培养基，进行多组平行对比培养，发现不同培养基对诱导率影响很大，具体如下:
N6+ 0.5mg/L NAA+1.0-4.0 mg/L 6_BA，诱导率< 10%或为O;
N6+ 1.5mg/L NAA+1.0-4.0 mg/L 6-BA，诱导率 <30%;
N6+ 1.0mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，诱导率5.08%;
N6+ 1.0mg/L NAA+2.0 mg/L 6_BA，诱导率35%;
N6+ 1.0mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA，诱导率53.33%;
N6+ 1.0mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA，诱导率 19.6%。
[0026]5)次生胚的诱导
采用体胚诱导方法，在次生胚诱导培养基上进行次生胚的诱导。经过20d左右的培养，如图3所示，获得了大量的次生胚，为后续实验的开展提供充足的材料。
[0027]以N6培养基作为基本培养基，配置出不同配方的次生胚诱导培养基，进行多组平行对比培养，发现不同培养基对诱导率影响很大，具体如下:
N6+ 0.5mg/L NAA+1.0mg/L ZT+ 0.0Olmg/L TDZ，诱导率80.82%;N6+ 0.5mg/L NAA+1.0mg/L ZT，诱导率75.95%;
N6+ 0.5mg/L NAA+2.0mg/L ZT+O- 0.0Olmg/L TDZ，诱导率<75%;
N6+ 1.0mg/L NAA+1.0-2.0mg/L ZT+ O-0.0Olmg/L TDZ，诱导率 <32%;
N6+ 1.5mg/L NAA+1.0-2.0mg/L ZT+ O-0.0Olmg/L TDZ，诱导率<22%;
6)次生胚分化成壮苗
以N6培养基为次生胚分化培养基，其他方法同次生胚的诱导。次生胚转接到N6培养基上后，如图4所示，逐渐地变绿，15d左右分化出芽和根，最终形成壮苗。
[0028]以上的各类培养基中均需添加100g/L香蕉汁，30g//L蔗糖，5.8g/L琼脂，调节pH至5.8-6.00
【主权项】
1.一种浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，其特征在于，步骤如下: 1)以浙江红花油茶种子作为材料，去外壳，灭菌后备用； 2)去除灭好菌的种子的胚芽、胚轴、胚根，只留下子叶，将子叶切面贴在胚性愈伤组织诱导培养基表面进行接种;控温控湿，先进行暗培养，之后光照培养，直至诱导出愈伤组织；胚性愈伤组织诱导培养基配方为:N6+ 1.0mg/L NAA+1.0-2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D； 3)取胚性愈伤组织，切块，接种到体胚诱导培养基中，进行体胚诱导培养;体胚诱导培养基配方为:N6+ 1.0mg/L NAA+2.0-3.0 mg/L 6-BA； 4)采用步骤3)的方法，在次生胚诱导培养基上进行次生胚的诱导；次生胚诱导培养基配方:N6+ 0.5mg/L NAA+1.0-2.0mg/L ZT+0- 0.001mg/L TDZ； 5)将次生胚转接到Ν6培养基上培养，1d后分化出芽和根，最终形成壮苗。2.根据权利要求1所述的浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，其特征在于，步骤I)中，选用福建省武夷山浙江红花油茶的种子作为材料，小心去掉种子外壳，避免对种子造成损伤;用清水将种子浸泡1.5h;之后，去除种皮;用洗涤剂进行清洗，并流水冲洗2h。3.根据权利要求1所述的浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，其特征在于，步骤I)中，将超净工作台用75%的酒精擦拭，开启紫外灯灭菌20min;将流水冲洗好的种子用镊子装入无菌瓶中，倒入75%的酒精，使种子完全浸入酒精中，搅动灭菌30S，倒出酒精用无菌水冲洗I次;倒入0.1%升汞搅动灭菌，搅动灭菌8min，倒出升汞，用无菌水冲洗4_5次。4.根据权利要求1所述的浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，其特征在于，步骤2)中，将接种好的培养瓶置于人工气候恒温培养箱中，先进行暗培养3d，之后光照24h/d，光照强度20001x，温度控制在25°C，相对湿度保持在40-50%。5.根据权利要求1所述的浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，其特征在于，步骤2)中，经过7d的培养，接种于培养基上的子叶块开始膨大，15d子叶块的周边开始出现大量的胚性愈伤组织。6.根据权利要求1所述的浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，其特征在于，步骤2)中，胚性愈伤组织诱导培养基配方:N6+ 1.0mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4_D。7.根据权利要求1所述的浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，其特征在于，步骤2)中，胚性愈伤组织诱导培养基配方:N6+ 1.0mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4_D。8.根据权利要求1所述的浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，其特征在于，步骤3)中，体胚诱导培养基配方:N6+ 1.0mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA。9.根据权利要求1所述的浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，其特征在于，步骤4)中，次生胚诱导培养基配方:N6+ 0.5mg/L NAA+1.0mg/L ZT+ 0.001mg/L TDZ010.根据权利要求1所述的浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法，其特征在于，步骤4)中，次生胚诱导培养基配方:N6+ 0.5mg/L NAA+1.0mg/L ZT0
【文档编号】A01H4/00GK105900845SQ201610426774
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】续晨, 温强, 徐雯, 蔡小宁, 贲爱玲, 杨平, 徐立军, 赵俊丽, 段淑蓉, 华春
【申请人】南京晓庄学院