一种利用白菜拓宽芥菜a亚基因组遗传变异的方法
【专利摘要】一种利用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法，所述方法包括利用黑芥BnBn与芥菜AjAjBjBj有性杂交，经子房培养获得三倍体种子AjBjBn，三倍体种子AjBjBn经无菌条件萌发后通过染色体加倍获得异源六倍体AjAjBjBjBnBn，将所述异源六倍体与白菜Ar1?nAr1?n杂交，获得新型芥菜AjAr1?nBjBn。本发明整个操作过程周期短，可简单快速地拓宽现有芥菜A亚基因组遗传变异的方法。
【专利说明】
-种利用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物新品系选育技术领域，具体设及为一种W采用黑芥与现有的芥菜 的异源六倍体为桥梁，与遗传变异丰富的多种白菜杂交获得一种新型芥菜，具体为一种利 用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法。
【背景技术】
[0002] 芥菜类作物(Brassica juncea，AABB)包括重要的蔬菜类型和油用类作物型，包括 棒菜、儿菜、青菜头、大头菜、W及芥菜型油菜等型，其中芥菜型油菜俗称油辣菜，巧粒细小， 多为金黄色或暗红色，含油量高。芥菜型油菜具有耐瘡性强等特点，但产量低，目前种植面 积已越来越小。芥菜型油菜（Brassica juncea，AABB)是由白菜型油菜（B.rapa，AA)和黑芥 (B.nigra,BB)自然杂交，染色体加倍进化而来的异源四倍体。与白菜型油菜相比，芥菜型油 菜狭窄的遗传基础限制了其遗传改良。
[0003] 传统利用白菜改良芥菜的方法主要有两种:第一种是通过白菜和黑芥杂交，创建 人工合成的芥菜;第二种方法是芥菜与白菜杂交，自然条件下收获Ξ倍体杂种，然后利用Ξ 倍体杂种与芥菜多轮回交，从回交后代中选育含有白菜遗传背景的芥菜。
[0004] 第一种方法由于白菜与黑芥的杂交障碍，该途径中每种杂交组合必须经过大量的 胚挽救技术才可能获得杂交种，且人工合成芥菜遗传不稳定，无法直接使用，其保种也存在 困难(Wen等.Euphytica. 2007)。
[0005] 第二种方法在实施中，Ξ倍体杂种仅能供当代使用，无法保种，且Ξ倍体与芥菜回 交后代为非整倍体，需要多代繁琐的选育才可能获得芥菜型的个体。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是采用现有获得拓宽芥菜遗传变异的方法由于物种 间严重的生殖隔离亲和性障碍，无法实现有性杂交，即使采用大量的胚挽救，也仅只适合于 少量亲本种材料的杂交利用;且物种选育周期长，选育过程繁琐。本发明目的在于提供一种 利用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法，采用黑芥与芥菜有性杂交，子房培养胚挽救 后经染色体加倍获得异源六倍体，W该六倍体为桥梁，与白菜杂交，获得新型芥菜，解决了 现有技术芥菜遗传变异方法应用范围有限，选育周期长、选育过程繁琐等技术缺陷。
[0007] 本发明的通过下述技术方案实现：
[000引一种利用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法，所述方法包括利用黑芥护B。与 芥菜AjAjBjRj有性杂交，经子房培养获得立倍体种子AjRjBn，Ξ倍体种子AjRjBn无菌条件萌发 后通过染色体加倍获得异源六倍体巧巧巧，将所述异源六倍体与白菜ATl-nAf l-n杂交，获 得新型芥菜AWi-WB。。
[0009]发明人经多次试验发现，现有利用白菜改良芥菜一种方法中，白菜与黑芥 B^n杂交，由于白菜ATl-nATl-n与黑芥两个物种间存在严重的生殖隔离亲和性障碍，采用 胚挽救技术克服物种间的亲和性障碍，但是人工合成的芥菜不稳定，无法直接使用及保种， 且操作过程中需要进行多轮胚挽救步骤才能获得杂交种，该方法复杂繁琐，不能快速高效 的筛选出芥菜A亚基因组个体。
[0010]另外一种现有方法是利用芥菜4^巧巧哺白菜Ad-nATl-n杂交，自然条件下收获Ξ倍 体杂种体杂种A^i-W与芥菜巧皆多轮回交，从回交后代中选育含有白菜 遗传背景的芥菜，但是该方法中获得的Ξ倍体杂叫又能当代使用，且无法保种，Ξ 倍体杂种与芥菜4^巧巧^回交后代非整倍体，需要多代繁琐的选育才能获得芥菜4亚基因组 个体。
[0011] 基于W上两种现有方法所产生的缺陷，发明人经研究认识到选择农艺性状优良的 芥菜4^巧巧^与黑芥日巧"有性杂交，获得杂种胚4巧巧"，授粉7-1〇天后对杂种胚进行子房培养 胚挽救可克服黑芥邮。与芥菜巧巧哺个物种间的生殖隔离亲和性障碍，具体胚挽救方法 是有性杂交后，采取子房培养获得杂种胚A巧巧η，获得的立倍体A巧巧η幼苗通过染色体加倍 获得异源六倍体巧巧巧巧。，异源六倍体Α^Α巧巧巧巧巧自然条件下可育，可反复使用，可保 种;获得的异源六倍体巧巧巧巧。与白菜Ατ1-ηΑ"-η杂交亲和性较好，田间自然条件下可获得 杂交后代。
[0012] 发明人所研究的方法中，与第一种现有操作方法相比，选择杂交的物种不同，物种 先后杂交的顺序不同，且仅经过一轮子房培养胚挽救和染色体加倍即可获得芥菜4^巧巧^ 与黑芥护8。的六倍体杂种巧巧巧ngn，解决了第一种现有操作方法中需要进行大量的胚挽 救技术获得杂交种;采用本发明所述方法获得的新型芥菜遗传稳定，直接可从当代培育出 得芥菜中选育中形状优良的芥菜A亚基因个体，且培育出得新型可直接使用，可保种，解决 了第一种现有操作方法中人工合成的芥菜遗传不稳定，无法直接使用，保种困难的问题。
[0013] 与第二种操作方法相比，选择杂交的物种不同，物种先后杂交的顺序不同，整个操 作方法不同，可通过试验发现本发明所述方法与之相比，解决其需多代繁琐选育芥菜个体 的问题，且本发明操作简单，同时采用本发明所述方法获得的芥菜A亚基因组个体可多代使 用，不限制仅当代使用，可保种，选育程序简单，整个过程周期短，可简单快速地拓宽现有芥 菜A亚基因阻遗传变异。
[0014] 本发明的具体操作过程为：
[0015] (1)获得六倍体
[0016] 选取农艺形状优良的芥菜巧邮为母本，剥蕾去雄，授W黑芥B^n花粉，授粉7-10 天后对杂种子房进行胚挽救子房培养，将胚挽救成熟种子萌发的幼苗置于分化培养基中扩 繁2轮，每轮培养25天，分化出大量的无性系，然后采用秋水仙碱诱导染色体加倍，获得基因 组结构为巧巧巧巧。异源六倍体或W黑芥护8。为母本，剥蕾去雄，授W芥菜巧巧喘粉，授 粉7-10天后对杂种子房进行胚挽救子房培养，将胚挽救成熟种子萌发的幼苗置于分化培养 基中扩繁2轮，每轮培养25天，分化出大量的无性系，然后采用秋水仙碱诱导染色体加倍，获 得基因组结构为巧巧巧ngn异源六倍体；
[0017] (2)创建新型芥菜A亚基因组个体
[0018] W异源六倍体作为母本，人工去雄，授予白菜ATl-nATl-n花粉，田间自然 条件下生长，至成熟后收获种子，即得新型芥菜A亚基因组个体或W白菜ATl-nATl-n为母本，授 予异源六倍体巧巧巧巧。的花粉，田间自然条件下生长，至成熟后收获种子，即得新型芥菜 A亚基因组个体。
[0019] 其中所述芥菜为基因组为巧巧叫勺作物，包括芥菜型油菜和蔬菜用芥菜，所述白 菜为基因组为ATl-nATl-n的作物，包括白菜型油菜和蔬菜用白菜。
[0020] 其中，j、r、n代表染色体的来源，A巧P来自芥菜B.juncea中的A染色体组，AT就是来 自白菜B. rapa的A染色体组，βη就是来自黑芥B. nigra的B染色体组，Bj就是来自芥菜B. nigra 的B染色体组。
[0021] 其中获得萌发的Ξ倍体A巧巧η幼苗的具体方法为：摘取杂交7一10天后的S倍体 A巧巧η子房，经70 %酒精灭菌30s，无菌水清洗5min，再用10 %次氯酸钢消毒15min，平均每 3min摇晃一次，然后采用无菌水清洗3次，每次3min，剥离幼胚，之后将子房果柄部位插入接 种到MS培养基中，放置于16小时光照，8小时暗处理，20°C的光照培养室中培育，30-35天收 获成熟角果，无菌条件下剥离角果皮，获得立倍体A巧巧η种子。
[0022] 对萌发的Ξ倍体A巧巧η幼苗进行染色体加倍具体操作步骤为:将获得S倍体A巧巧。 种子置于MS培养基中萌发，萌发后幼苗经分化培养基处理获得的无性幼苗转入含lOOmg/L 秋水仙碱的分化培养基暗培养诱导染色体加倍处理7天，之后将无性幼苗转入分化培养基 中培养25天成苗，最后转入生根培养基中生根。生根后移栽，检测植株花粉育性、结实性或 通过染色体计数筛选加倍成功个体。
[0023] 在上述萌发Ξ倍体A巧巧η幼苗、立倍体幼苗进行染色体加倍的操作步骤中所采用 的生根培养基由W下组分组成:MS培养基+0.5mg/L ΙΒΑ;分化培养基由W下组分组成，MS培 养基+2mg/L IBA+0.2mg/L NAA。
[0024] 本
【发明内容】
中所述的芥菜为基因组为AABB的作物，包括芥菜型油菜和蔬菜用芥 菜，所述白菜为基因组为AA的作物，包括白菜型油菜和蔬菜用白菜。
[0025] 本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
[00%]本发明通过芥菜4^巧巧^与黑芥护8。杂交，通过一轮胚挽救子房培养和染色体加倍 获得异源六倍体巧巧巧巧η，并W六倍体A巧巧巧巧η作为桥梁，六倍体巧巧巧ngn自然条 件下可育，可反复使用，与遗传变异丰富的多种白菜ATl-nATl-n亲和性较好，田间自然条件下 可获得杂交后代。整个操作过程周期短，可简单快速地拓宽现有芥菜A亚基因组遗传变异的 方法。
【具体实施方式】
[0027]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作 进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本 发明的限定。
[002引实施例1:
[0029] -种利用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法，包括W下步骤：
[0030] W品系为PI174795黑芥为母本，剥蕾去雄，授予品系为4N001芥菜花粉，获得Ξ倍 体F1，授粉第10天后对Ξ倍体F1杂种子房进行第一轮胚挽救子房培养，获得Ξ倍体种子，萌 发后的幼苗通过秋水仙碱诱导染色体加倍，获得异源六倍体D1;W异源六倍体D1为母本，人 工去雄，授予3份卷忍大白菜，品系分别为①4M242、②抓244、③抓246和2份白菜型油菜的花 粉，品系分别为④5W395、⑤6Y733，杂种子房在自然条件下生长，成熟后收获。
[0031] 对实施例中异源六倍体D1与5种不同类型的白菜杂交，获得的杂交后代的染色体 数据进行检测，染色体数目均为36条。然后对六倍体与5种编号类型的白菜杂交的结实率进 行统计，统计结果如表1所示。同时对上述不同编号类型白菜杂交后获得的新型芥菜进行培 育，上述不同类型的新型芥菜的叶型、花色、株高、分枝数目和形态、开花期等多种农艺形状 差异明显，遗传变异较大。本实施例还采用上述不同类型的新型芥菜进行自交，对自交后新 型芥菜的结实率进行统计，统计结果如表1所示。
[0032] 表 1
[0033]
'[0034]上述六倍体D1与不同类型白菜杂交，其平均结^率为2.33粒/芙，上述新型芥菜自 交后，其平均结实率为4.78粒/芙。
[0035] 实施例2:
[0036] 本实施例与实施例1的区别在于:本实施例中W品系为4N001芥菜为母本，W品系 为PI174795黑芥为父本，杂交，授粉第10天对杂种子房进行子房培养，获得Ξ倍体种子，萌 发后获得Ξ倍体Ρ2，Ξ倍体F2经第一轮胚挽救子房培养，获得的幼苗通过秋水仙碱诱导染 色体加倍，获得异源六倍体D2; W异源六倍体D2为母本，人工去雄，授予3份卷忍大白菜，品 系分别为①4Μ242、②5W244、③5W246和2份白菜型油菜的花粉，品系分别为④5W395、⑤ 6Υ733，杂种子房在自然条件下生长，成熟后收获不同类型的新型芥菜。
[0037] 对本实施例杂交后的新型芥菜的染色体数目进行检测，发现它们的染色体数目均 为36条，上述多份新型芥菜的的叶型、花色、株高、分枝数目和形态、开花期等多种农艺形状 差异明显，遗传变异较大。
[0038] 按照实施例1中相同的检测方法检测六倍体D2与不同类型白菜杂交后的平均结实 率，W及不同类型的新型芥菜自交后的平均结实率，该杂交结实率为2.78粒/芙，该自交结 实率为4.82粒/芙。
[0039] 实施例3:
[0040] 本实施例与实施例1的区别在于，本实施例W异源六倍体D1为父本，白菜为母本， 白菜种类与实施例1中相同，杂交后获得新型芥菜。
[0041 ]对本实施例杂交后的新型芥菜的染色体数目进行检测，发现它们的染色体数目均 为36条，上述多份新型芥菜的的叶型、花色、株高、分枝数目和形态、开花期等多种农艺形状 差异明显，遗传变异较大。
[0042] 按照实施例1中相同的检测方法检测六倍体D1与不同类型白菜杂交后的平均结实 率，W及不同类型的新型芥菜自交后的平均结实率，该杂交结实率为2.48粒/芙，该自交结 实率为4.90粒/芙。
[0043] 实施例4:
[0044] 本实施例与实施例2的区别在于：本实施例中W异源六倍体D2为父本，白菜为母 本，白菜种类与实施例2相同，杂交后获得的新型芥菜。
[0045] 对本实施例杂交后获得的新型芥菜的染色体数目进行检测，发现它们的染色体数 目均为36条，上述多份新型芥菜的的叶型、花色、株高、分枝数目和形态、开花期等多种农艺 形状差异明显，遗传变异较大。
[0046] 按照实施例1中相同的检测方法检测六倍体D2与不同类型白菜杂交后的平均结实 率，W及不同类型的新型芥菜自交后的平均结实率，该杂交结实率为2.50粒/芙，该自交结 实率为4.65粒/芙。
[0047] 实施例5:
[0048] 本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中黑芥和芥菜的品系不同，其他均与实 施例1相同。
[0049] 本实施例中黑芥的品系为PI174796，芥菜的品系为4N001。按照实施例1中相同的 检测方法检测六倍体D3与不同类型白菜杂交后的平均结实率，W及不同类型的新型芥菜自 交后的平均结实率，该杂交结实率为2.75粒/芙，该自交结实率为4.82粒/芙。
[0050] 对本实施例杂交后获得的新型芥菜的染色体数目进行检测，检测结果染色体数据 均为36条，本实施例中多份新型芥菜的叶型、花色、株高、分枝数目和形态、开花期等多种农 艺形状差异明显，遗传变异较大。
[0051] W上所述的【具体实施方式】，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步 详细说明，所应理解的是，W上所述仅为本发明的【具体实施方式】而已，并不用于限定本发明 的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含 在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种利用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法，其特征在于:所述方法包括利用 黑芥B nBn与芥菜WB如有性杂交，经子房培养获得三倍体种子MBMn，三倍体种子A也 无菌条件萌发后通过染色体加倍获得异源六倍体WBMW nBn，将所述异源六倍体与白菜 AmA+n杂交，获得新型芥菜AjAm BjBn。2. 根据权利要求1所述的一种利用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法，其特征在 于:所述将采用胚挽救子房培养方法萌发的三倍体MBB n幼苗置于分化培养基中扩繁2轮， 每轮培养25天，分化出无性幼苗，然后将无性幼苗通过秋水仙碱诱导染色体加倍。3. 根据权利要求2所述的一种利用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法，其特征在 于:所述萌发的三倍体AjB jBn幼苗的获得方法为:摘取杂交7-10天后的三倍体AjBjB n子房， 经70%酒精灭菌3〇8，无菌水清洗5111；[11，再用10%次氯酸钠消毒151]1；[11，平均每31]1；[11摇晃一 次，然后采用无菌水清洗三次，每次3min，然后将子房的果柄部位插入剥离幼胚，接种到MS 培养基中，放置于16小时光照，8小时暗处理，20 °C的光照培养室中培育，30-35天收获成熟 角果，无菌条件下剥离角果皮，获得三倍体幼苗种子。4. 根据权利要求3所述的一种利用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法，其特征在 于:所述染色体加倍具体操作步骤为:将获得的三倍体AMM n种子置于MS培养基中萌发，萌 发后幼苗转入分化培养基中扩繁2次，每次培养25天，处理之后将获得的无性系幼苗转入含 100mg/L秋水仙碱的分化培养基中暗培养诱导染色体加倍处理7天，然后将无性处理后的幼 苗转入分化培养基中培养25天成苗，最后转入生根培养基中生根，生根后移栽，检测植株花 粉育性、结实性、通过染色体计数筛选加倍成功个体。5. 根据权利要求4所述的一种利用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法，其特征在 于:所述生根培养基由以下组分组成:MS培养基+0.5mg/L IBA;分化培养基由以下组分组 成:MS培养基+2mg/L IBA+0.2mg/L NAA。6. 根据权利要求1所述的一种利用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法，其特征在 于:所述黑芥BnB n为母本，剥蕾去雄，授以芥菜^\也初花粉，有性杂交，经子房培养获得三倍 体种子MBBn，三倍体种子AMM n染色体加倍获得异源六倍体WBMMnBn，将所述异源六倍 体A j AjBjBjBnBn与白菜A rl-nArl-n杂交，获得新型芥菜Aj Arl-nBjB'7. 根据权利要求1所述的一种利用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法，其特征在 于:所述芥菜WB初为母本，剥蕾去雄，授以黑芥B nBn花粉，有性杂交，经子房培养获得三倍 体种子MBBn，三倍体种子AMM n经染色体加倍获得异源六倍体WBMMnBn，将所述异源六 倍体A jAjBjBjBnBn与白菜A rl-nArl-n杂交，获得新型芥菜AjA rl-nBjB'8. 根据权利要求1所述的一种利用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法，其特征在 于:所述以染色体加倍获得的异源六倍体WB^B nBn为母本，剥蕾去雄，授以白菜Α+ηΑ+η 花粉，获得新型芥菜Α^^ηΒ%η。9. 根据权利要求1所述的一种利用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法，其特征在 于:所述以白菜Alrl- nA1^n为母本，剥蕾去雄，授以染色体加倍获得的异源六倍体WBBBnB n 花粉，获得新型芥菜Α^^ηΒ%η。10. 根据权利要求1所述的一种利用白菜拓宽芥菜A亚基因组遗传变异的方法，其特征 在于:所述芥菜为基因组为AABB的作物，包括芥菜型油菜和蔬菜用芥菜，所述白菜为基因组 为AA的作物，包括白菜型油菜和蔬菜用白菜。
【文档编号】A01H4/00GK105918105SQ201610269977
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】钱伟, 明佳熠, 梅家琴, 魏瑞芳, 李勤菲
【申请人】西南大学