雷帕霉素抑制植物早疫病菌的新用图
【专利摘要】本发明公开了一种雷帕霉素在抑制植物早疫病菌中的应用；还公开了一种真菌杀菌剂：包含雷帕霉素或者雷帕霉素与真菌化学杀菌剂的混合物。本发明首次将用于临床医学的TOR蛋白抑制剂雷帕霉素用于植物早疫病的防治研究中，通过研究发现雷帕霉素、雷帕霉素与真菌化学杀菌剂的混合物均能有效地抑制植物早疫病菌，雷帕霉素化学农药能够协同作用来抑制植物早疫病菌，为防治早疫病新药研究提供了非常有意义的基础，应用于新型杀菌剂的前景广阔，市场前景好，为防治早疫病提供了一种新的选择，能够大幅度减少化学农药的使用，对降低农药使用、延缓害虫抗性的产生具有重要意义，对维持生态系统的平衡和可持续发展也具有重大的应用价值。
【专利说明】
雷帕霉素抑制植物早疫病菌的新用途
技术领域
[0001]本发明涉及雷帕霉素的新用途，尤其涉及雷帕霉素抑制植物早疫病菌的新用途。
【背景技术】
[0002]早疫病，又称为“轮纹病”或“夏疫病”，属真菌病害，苗期、成株期均可发病，苗期发病，幼苗的茎基部生暗褐色病斑，稍陷，有轮纹。成株期发病一般从下部叶片向上部发展。初期叶片呈水渍状暗绿色病斑，扩大后呈圆形或不规则轮纹斑，边缘具有浅绿色或黄色晕环。中部具同心轮纹，潮湿时病部长出黑色霉层，主要症状是病部有(同心)轮纹。早疫病菌能够感染多种植物，是作物上的重要病原菌，其寄主范围多样，除了感染番茄和马铃薯外，还可侵染辣椒、茄子、曼陀罗等植物。目前已经报道的引起植物早疫病的病原菌主要有茄链格孢菌(Alternaria so Iani)、链格抱菌(Alternaria alternate)、Α.interrupta、A.grand is、八.七6]111188；[1]1&、4.(1111]108&、4.&1'130^806118和4.1nfectoria等8种，其中前链格抱菌是优势病原菌，该菌属半知菌亚门，丝孢纲，链格孢属真菌，成熟菌丝暗褐色，有隔膜和分枝。
[0003]对于早疫病的防治，目前主要是采用以下几种方式进行，即物理防治、化学防治与生物防治。化学防治是植物保护的主要措施之一，生产上防治早疫病的主要措施是喷施杀菌剂。如保护性杀菌剂铜制剂、波尔多液、代森锰锌、百菌清、敌菌丹等；内吸性杀菌剂啶酰菌胺、戊唑醇、苯醚甲环唑、嘧菌酯、腐霉利、异菌脲、咯菌腈等。化学农药的使用，具有一定的生产效果，但是长期使用化学药剂也带来了一系列的问题，其中一个是病菌的不断变异产生的抗药性，目前早疫病对许多的化学农药都产生了抗性。另外，由于化学药剂的使用导致的生态破坏问题也越来越受到人们的关注，急需可以替代化学药剂的环境友好病害防治体系。
[0004]生物防治，简单地说就是以虫治病虫和以菌治病虫。植物病害生物防治中常用的微生物有细菌、酵母菌、放线菌和霉菌。由于细菌的基因和代谢产物较为简单，因此以其作为生防制剂具有很大的潜力。生物防治能够克服化学药剂导致的抗药性以及环境污染问题。目前针对早疫病菌的生物防治研究已经取得了一些进展，如研究发现，木霉代谢产物对茄链格孢有抑制作用，合理使用绿脓假单胞杆菌对早疫病的防效与代森锰锌之间无显著性差异，荧光假单胞菌、哈茨木霉的培养滤液可有效抑制茄链格孢的孢子萌发，大蒜和洋葱的球茎提取物对早疫病A.alternata的抑制率达50%以上，梁宁等的研究表明枯草芽孢杆菌在防治马铃薯早疫病中具有很大的开发潜力。
[0005]T0R(Target ofRapamycin)是一种进化中保守的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，在真菌、动物、植物中通过整合营养和能量信号来促进细胞的增殖和生长。TOR信号通路在动物胚胎形成、分生组织激活，植物根和叶的生长、开花、衰老和生命周期的控制中都扮演着关键作用。近几年研究发现，TOR还具有调节核糖体的生物合成、促进翻译、新陈代谢调节和抑制自噬的功能。通过RNA干扰技术干扰动植物的TOR基因或tor突变能够导致胚胎致死，说明TOR基因在动植物的生长发育进程中扮演着核心作用。
[0006]雷帕霉素(Rapamycin，RAP)，又名西罗莫司(Sirolimus)，是一种大环内酯类免疫抑制剂，由吸水链霉菌产生，是TOR(Target ofRapamycin)的专性一代抑制剂。它首先特异性的与FKBPl2蛋白结合形成二元复合物，该复合物再与TOR蛋白的FRB结构域结合，从而达到抑制TOR蛋白的活性。当FKBP12基因发生突变时，就会大大降低或者失去与雷帕霉素的结合能力，使得雷帕霉素丧失抑制TOR蛋白的活性。在陆生植物中，FKBP12基因发生了适应性的突变，不能与雷帕霉素进行特异的有效的结合，因此对雷帕霉素表现出了抗性;然而在真菌和哺乳动物中，FKBP12可以与雷帕霉素有效结合形成二元复合物，从而可以抑制其中TOR蛋白的活性，因此真菌和哺乳动物对雷帕霉素表现了较为敏感的性状。根据这一特性，雷帕霉素可以作为防治植物病虫害的潜在生物农药。对雷帕霉素最早的研究主要是将其作为低毒性的抗真菌药物，尤其是抗白色念珠菌，目前主要广泛在临床医学上用作防止器官移植的排斥反应和治疗自身免疫性疾病的免疫抑制剂，利用该化合物来进行植物早疫病的防治还未见相关报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对以上问题提供一种雷帕酶素抑制植物早疫病菌的新用途。
[0008]为实现上述目的所采用的技术方案是:
[0009]雷帕霉素在抑制植物早疫病菌中的应用。
[0010]在该技术方案中，所述雷帕霉素单独使用或者与真菌化学杀菌剂混合使用。
[0011]进一步地，所述真菌化学杀菌剂为植物早疫病菌杀菌剂。
[0012]进一步地，所述植物为茄科植物。
[0013]—种真菌杀菌剂，包含雷帕霉素或者雷帕霉素与真菌化学杀菌剂的混合物。
[0014]在该技术方案中，所述真菌化学杀菌剂为植物早疫病菌杀菌剂。
[0015]作为优选地，所述植物早疫病菌杀菌剂为甲霜.噁霉灵。
[0016]作为优选地，所述雷帕霉素的浓度为I?50nmol/L;所述甲霜.噁霉灵的浓度为0.05?0.5mL/L0
[0017]本发明的有益效果是:本发明首次将用于临床医学的TOR蛋白抑制剂雷帕霉素用于植物早疫病的防治研究中，通过研究发现雷帕霉素、雷帕霉素与真菌化学杀菌剂的混合物均能有效地抑制植物早疫病菌，雷帕霉素化学农药能够协同作用来抑制植物早疫病菌，为防治早疫病新药研究提供了非常有意义的基础，应用于新型杀菌剂的前景广阔，市场前景好，为防治早疫病提供了一种新的选择，能够大幅度减少化学农药的使用，对降低农药使用、延缓害虫抗性的产生具有重要意义，对维持生态系统的平衡和可持续发展也具有重大的应用价值。
【附图说明】
[0018]图1为经不同浓度甲霜.噁霉灵处理的早疫病菌菌落生长12天情况图；DMSO为对照。
[0019]图2为经不同浓度甲霜.噁霉灵处理培养12天后早疫病病菌的菌落直径示意图。
[0020]图3为经不同浓度RAP处理的早疫病菌菌落生长12天情况图；DMS0为对照。
[0021 ]图4为经不同浓度RAP处理培养12天后早疫病病菌的菌落直径示意图。
[0022]图5为经不同浓度RAP+甲霜.噁霉灵处理的早疫病菌菌落生长12天情况图；DMS0为对照。
[0023]图6为经不同浓度RAP+甲霜.噁霉灵处理培养12天后早疫病菌的菌落直径示意图。
[0024]图7为RAP+甲霜.噁霉灵组合处理早疫病菌得到的协同作用曲线;R= Rapamycin;甲:甲霜.嚼霉灵。
【具体实施方式】
[0025]本发明中所用主要试剂:
[0026]雷帕霉素(Rapamycin):购自美国Selleck Chemicals公司，是一种特定的mTOR抑制剂，目录号S1039。
[0027]甲霜.噁霉灵为市售常见农药，有效成分为30%甲霜.噁霉灵，包含6%甲霜灵和24%噁霉灵。
[0028]早疫病菌株alternaria solani购自北京微生物菌种保藏中心。
[0029]所有平板试验中的固体培养基均为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PotatoDextroseAgar，PDA)。
[0030]分别使用雷帕霉素(RAP)、甲霜.卩惡霉灵、雷帕霉素+甲霜.卩惡霉灵(两者联合使用)实验检测其对早疫病菌的抑制作用:
[0031]配制PDA培养基，灭菌后置于恒温水浴中，使其温度降低并稳定于50°C左右，加入适量体积的药剂(DMS0或者雷帕霉素或者甲霜.卩惡霉灵或者雷帕霉素+甲霜.嚼霉灵)达到目的终浓度后，倒平板。待平板彻底冷却凝固后，用打孔器从培养早疫病菌平板(早疫病菌培养方法参照产品说明书进行)的边缘打取直径约为5_的早疫病琼脂块，置于待测平板中心，于25°C恒温培养箱黑暗培养，每隔四天观察一次实验现象，并拍照记录，总共持续观察12天。
[0032]实施例1.用甲霜?噁霉灵单独处理早疫病菌
[0033]设置甲霜.噁霉灵的浓度梯度为0.05ml/L、0.5ml/L和lml/L，分别配制含有这3种不同浓度的甲霜.噁霉灵的PDA培养基，每个处理设3次重复。培养12天后观察真菌生长状况可以发现(如图1、2所示)，随着甲霜.噁霉灵浓度的增加，真菌生长受到的抑制越来越明显。IC50的药物浓度为0.5ml/L0
[0034]实施例2.用Rapamycin单独处理早疫病菌
[0035]设置Rapamy c in的浓度梯度为Inmo 1/L、1nmo I/L和50nmo I/L。分别配制含有这3种不同浓度的Rapamycin的PDA培养基，每个处理设3次重复。培养12天后观察真菌生长状况可以发现(如图3、4所示)，随着Rapamycin浓度的增加，真菌生长受到的抑制越来越明显。其IC50的药物浓度约为50nmol/L。
[0036]实施例3.用雷帕霉素+甲霜.噁霉灵组合处理早疫病菌
[0037]雷帕霉素的浓度分别为:lnmOl/L、10nmOl/L、50nmOl/L;甲霜.噁霉灵的使用浓度为0.05ml/L和0.5ml/L。将上述雷帕霉素和甲霜.噁霉灵的浓度分别两两组合来处理早疫病菌，共6个组合。分别配制含有这6种不同浓度组合的雷帕霉素+甲霜.噁霉灵的PDA培养基，每个处理设3次重复。培养12天后观察真菌生长状况可以发现(如图5、6所示)，随着雷帕霉素+甲霜.噁霉灵组合用药浓度的增加，真菌生长受到的抑制越来越明显。IC50的药物浓度为雷帕霉素:50nmol/L+甲霜.噁霉灵:0.05ml/L。雷帕霉素与农药甲霜.噁霉灵组合使用后达到IC50，农药甲霜.噁霉灵的使用浓度比单独使用时降低了 15倍左右。同时，根据CompuSyn软件计算得到这两种药物之间具有协同效应(CI〈1表示具有协同作用;Cl = I表示具有叠加作用;Cl〉I表示具有拮抗作用)，如图7所示。
【主权项】
1.雷帕霉素在抑制植物早疫病菌中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述雷帕霉素单独使用或者与真菌化学杀菌剂混合使用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述真菌化学杀菌剂为植物早疫病菌杀菌剂。4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于:所述植物为茄科植物。5.—种真菌杀菌剂，其特征在于:包含雷帕霉素或者雷帕霉素与真菌化学杀菌剂的混合物。6.根据权利要求5所述的真菌杀菌剂，其特征在于:所述真菌化学杀菌剂为植物早疫病菌杀菌剂。7.根据权利要求6所述的真菌杀菌剂，其特征在于:所述植物早疫病菌杀菌剂为甲霜.口惡霉灵。8.根据权利要求5或7所述的真菌杀菌剂，其特征在于:所述雷帕霉素的浓度为I?50nmol/L;所述甲霜.噁霉灵的浓度为0.05?0.5mL/L。
【文档编号】A01N37/46GK105918330SQ201610348867
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】于力华, 任茂智, 郑先喆, 张蜀敏, 尹欢
【申请人】重庆大学