蛋白酶体抑制剂mg-132作为菊酯类杀虫剂的增效剂的应用
【专利摘要】本发明属于害虫抗药性防治领域，具体涉及蛋白酶体抑制剂MG‐132作为菊酯类杀虫剂的增效剂的应用。本发明将蛋白酶体抑制剂MG‐132作为菊酯类杀虫剂增效剂，用二甲基亚砜作为溶剂将蛋白酶体抑制剂MG‐132配制成30μM，再喷洒到田间小菜蛾的卵、幼虫和饲料上进行预处理，预处理24小时后施菊酯类杀虫剂。本发明通过个体和细胞水平分别证明MG‐132能显著提高溴氰菊酯的防效。
【专利说明】
蛋白酶体抑制剂MG-132作为菊酯类杀虫剂的増效剂的应用
技术领域
[0001]本发明属于害虫抗药性防治领域，具体涉及蛋白酶体抑制剂MG-132及一种治理小 菜蛾的溴氰菊酯抗性的方法。
【背景技术】
[0002] 昆虫对杀虫剂的抗药性是在药剂的长期选择作用下，昆虫产生的一种生态适应和 进化现象。这种复杂的选择过程显然与多种代谢和调节相关，需要多种蛋白质和酶的参与。 蛋白酶体降解途径是细胞内降解蛋白质的一个重要途径，对于细胞许多生命功能的正常运 行，例如细胞周期调控，基因表达，氧化应激反应等都是必不可少的。
[0003] 溴氰菊酯是人工合成拟除虫菊酯杀虫剂中杀虫毒力最大的一个品种，性质稳定， 杀虫谱广，生物活性高，在世界范围内被广泛应用。小菜蛾对拟除虫菊酯类药剂的抗性发展 速度快，抗性最为显著。小菜蛾的抗药性问题是十分严重的，抗性治理也有一定的难度，要 有效解决这一问题，除了加速杀虫剂新品种的开发外，更为切实可行的措施是增强现有杀 虫剂的杀虫效果，延长其有效使用时间。
[0004] MG-132是一种强效的，可逆的，细胞通透性的蛋白酶体抑制剂（IC50 = IOOnM)，与 20S和26S蛋白酶体结合并使其失活。尚没有将MG-132用于害虫防治的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供提高溴氰菊酯控制小菜蛾的方法及其应用。
[0006] 本发明公开了蛋白酶体抑制剂MG-132作为菊酯类杀虫剂的增效剂的应用。
[0007] 本发明中所说的菊酯类杀虫剂是溴氰菊酯杀虫剂。
[0008] 所说的MG-132是蛋白酶体的特异性抑制剂。
[0009] 本发明进一步通过实验研究蛋白酶体抑制剂MG-132处理不同时间和不同处理浓 度对对溴氰菊酯毒性的影响。
[0010] (1)蛋白酶体抑制剂MG-132处理不同时间对溴氰菊酯毒性的影响
[0011]①首先用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂将蛋白酶体抑制剂配制成最终浓度为ΟμΜ， 1ΟμΜ，20μΜ，30μΜ，40μΜ和50μΜ〇
[0012] ②将处于对数期的果蝇Kc细胞预先接种到96孔板中，常规培养24h。
[0013] ③将2μL浓度为30μM的MG-l32加入到每孔中，继续培养不同的时间（2h，4h，6h，8h， l〇h)。取各个时间点的细胞组进行下一步毒性检测实验。
[0014]④向经蛋白酶体抑制剂处理过的细胞中加入2yL浓度为30ppm的溴氰菊酯药物(配 制溴氰菊酯的溶剂为DMS0)。每个药物浓度设有3个复孔。
[0015] ⑤药物处理细胞24h后，用台盼蓝染色法检测细胞存活率。
[0016] ⑥与对照组相比，计算细胞相对存活率。
[0017] ⑵蛋白酶体抑制剂MG-132不同处理浓度对溴氰菊酯毒性的影响
[0018] ①基于上步的实验结果，用不同浓度的蛋白酶体抑制剂(最终浓度为0μΜ，10μΜ，20 μΜ，30μΜ，40μΜ和50μΜ)预处理对数期果蝇Kc细胞6h;
[0019] ②对经蛋白酶体抑制剂处理过的细胞进行30ppm浓度的药物刺激24h，每个浓度设 有3个复孔；
[0020] ③台盼蓝染色法检测细胞存活率。（具体操作方法同前）。
[0021] (3)在施药之前用MG-132处理幼虫24小时，可明显提高防效。
[0022]经研究表明：（1)蛋白酶体抑制剂对细胞蛋白酶体活性呈可逆性抑制现象。（2)MG-132预处理，能显著提高溴氰菊酯处理细胞的死亡率。（3) JG-132预处理，使溴氰菊酯抗性 品系小菜蛾的抗性水平显著下降。
[0023]进一步地，本发明提供了蛋白酶体抑制剂MG-132作为菊酯类杀虫剂增效剂的具体 应用方法，是用二甲基亚砜作为溶剂将蛋白酶体抑制剂MG -13 2配制成3 0 μΜ，再喷洒到田间 小菜蛾的卵、幼虫和饲料上进行预处理，预处理24小时后施菊酯类杀虫剂。
[0024]本发明通过个体和细胞水平分别证明MG-132能显著提高溴氰菊酯的防效，因此本 发明在抗性的防治应用中具有重要的意义。
【附图说明】
[0025]图1特定浓度蛋白酶体抑制剂处理不同时间对细胞活性的影响(*代表ρ〈0.05)。 [0026]图2不同浓度蛋白酶体抑制剂MG-132处理对细胞活性的影响 [0027] 对照:仅用溴氰菊酯药物处理的对照组细胞；
[0028] MG-132:用30ppm溴氰菊酯和相应浓度蛋白酶体抑制剂处理的细胞；
[0029] *代表ρ〈〇·〇5。
【具体实施方式】
[0030] 实施例一
[0031] 1、小菜蛾抗性品系
[0032] 小菜蛾源自贵州省贵阳市花溪区中曹乡的甘蓝地，室内繁殖一代后测四龄幼虫的 LD5Q值，与武汉市蔬菜研究所的小菜蛾敏感品系四龄幼虫LD5q值比较，发现小菜蛾田间种群 为敏感种群。将其作为敏感品系同步隔离培养。小菜蛾溴氰菊酯抗性品系(抗性倍数>5000) 由点滴法处理小菜蛾四龄幼虫敏感品系经多代繁育选育而成。
[0033] 2、MG_ 132对溴氰菊酯毒性的影响
[0034] (1)特定浓度MG-132处理不同时间所引起的细胞活性的变化
[0035] 首先用特定浓度（30μΜ)的蛋白酶体抑制剂MG-132预处理果蝇Kc细胞不同时间 (Oh，2h，4h，6h，8h，IOh)，分别对每组细胞进行DM药物(30ppm)处理，CCK-8试剂盒进行细胞 毒性检测，结果发现，蛋白酶体抑制剂对细胞蛋白酶体活性呈可逆性抑制现象，并且在预处 理6h时，抑制效果达到最佳(附图1)。
[0036] (2)不同浓度MG-132处理相同时间所引起的细胞活性的变化
[0037] 在上步实验结果的基础上，用不同浓度的蛋白酶体抑制剂MG-132预处理果蝇细胞 6h，再用浓度为30ppm溴氰菊酯药物胁迫细胞，毒性检测结果发现:经MG-132预处理的果蝇 细胞的死亡率明显高于未经MG-132处理的对照组(control)细胞，并且在高浓度的MG-132 诱导下，果蝇细胞出现大面积的凋亡(附图2)。
[0038] 3、MG_ 132对小菜蛾溴氰菊酯抗性水平的影响
[0039] (I)MG-132 预处理
[0040] 挑选生长状态良好的抗性品系小菜蛾(DR)幼虫作为实验材料，腹腔显微注射蛋白 酶体抑制剂(MG-132)(购自Sigma-Aldrich公司）24h后进行活体水平毒性检测（临用前用二 甲基亚砜溶解配成30μΜ)，在相同的条件下，对照组小菜蛾幼虫腹腔则同时注射等体积的二 甲基亚砜(DMSO)。采用点滴法分别对实验组和对照组幼虫进行毒力测定(兰亦全和赵士熙， 2003)〇
[0041 ] (2)毒性检测
[0042]小菜蛾幼虫经MG-132预处理24h后，用毛细微量进样器将IyL溴氰菊酯药剂点在幼 虫的前胸背板上，每个浓度的药剂分别处理50只小菜蛾幼虫，然后放入用纱布封口的培养 皿中，人工喂食萝卜苗。饲喂48h后统计不同浓度药剂处理组幼虫的死亡数，以轻触虫体不能 协调活动视为判断死亡标准。
[0043]注:毒力测定实验设有3次生物学重复。
[0044] (3)经MG-132处理后抗性品系小菜蛾幼虫对溴氰菊酯毒力的变化
[0045]抗性品系小菜蛾幼虫经不同浓度的溴氰菊酯药物处理48h后，人工记录各药物浓 度处理组幼虫的死亡数，采用SPSS软件进行毒力回归分析得出参数估计和回归方程检验 表、95%的置信区间。通过分析得出小菜蛾抗性品系的毒力回归方程为Probit(P)=-1.943 +1.017义，当？ = 0.5时，查得1^：50值为16.9口口111，95%的置信区间为9.76~15.35。
[0046]为了进一步研究蛋白酶体活性的改变与溴氰菊酯应激反应之间的关系，蛋白酶体 抑制剂MG-132被用来处理抗性品系小菜蛾幼虫，经MG-132预处理后，再分别对处理组和未 处理组的小菜蛾幼虫进行溴氰菊酯毒力测定。三次独立的生物学实验的结果经分析得：当 蛋白酶体的活性被抑制剂MG-132抑制之后，小菜蛾抗性品系对农药溴氰菊酯的LC50的值被 显著下调。结果如表1所示。
[0047]表1.经MG-132处理后抗性品系小菜蛾幼虫对溴氰菊酯毒力的变化
[0049] η:代表幼虫总数;*代表p<0.05。
【主权项】
1. 蛋白酶体抑制剂MG-132作为菊酯类杀虫剂的增效剂的应用。2. 根据权利要求1所说的应用，其特征在于:其中所说的菊酯类杀虫剂是溴氰菊酯杀虫 剂。3. 根据权利要求1所说的应用，其特征在于:其中所说的MG-132是蛋白酶体的特异性抑 制剂。4. 根据权利要求1所说的应用，其特征在于：用二甲基亚砜作为溶剂将蛋白酶体抑制剂 MG-132配制成30μΜ，再喷洒到田间小菜蛾的卵、幼虫和饲料上进行预处理，预处理24小时后 施菊酯类杀虫剂。
【文档编号】A01P7/00GK105961426SQ201610303480
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】程罗根, 程晨, 胡俊丽, 李风良
【申请人】南京师范大学