一种创制芜菁和萝卜属间杂种的方法
【专利摘要】本发明涉及一种创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，属于生物技术育种技术领域。该具体包括如下步骤：亲本材料的播种；花期杂交授粉；考种；组织培养获得杂种苗；无菌苗驯化；杂种形态学鉴定；杂种的细胞学鉴定方法。本发明根据芸薹属和萝卜远缘杂交，芸薹属的雌蕊允许萝卜花粉萌发和花粉管伸长，但是受精后障碍严重的特点，采用蕾期授粉以及授粉前涂抹一定浓度赤霉素到母本柱头上的方法，最大程度改善属间杂交的亲和性，授粉后，采取的是自然结荚，借助组织培养技术，进行种粒无菌培养的方法，获得了杂种苗并对其进行了形态学和细胞学的鉴定，确定是真实的属间杂种。
【专利说明】
一种创制芜菁和萝卜属间杂种的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，属于生物技术育种技术领域。
【背景技术】
[0002] 萝卜是十字花科植物中芸薹属(Brassica)的近缘属，通过属间远缘杂交，已经获得 萝卜和芸薹属间的双二倍体杂种，并被命名为新的物种。由于远缘杂交的生殖隔离、种间杂 种的不亲和性、杂种败育以及杂种不育等共性问题，为了获得有性杂交的杂种，人们采用了 多种技术和方法，包括嫁接、混合授粉、切柱头、化学药物处理等，但这些技术和方法对芸薹 属与萝卜的远缘杂交，效果不大。房相佑在研究萝卜与芸薹野生种属间杂交时发现:芸薹种与 萝卜杂交时受精前障碍较小，芸苔种的雌蕊允许萝卜花粉萌发和花粉管伸长，但是受精后障 碍严重;胚培养技术保障了萝卜和芸薹属植物间远缘杂交的成功。
[0003] 芜菁是十字花科芸薹属芸薹种芜菁亚种，同萝卜一样都是以其肥大肉质根供食用。 进行萝卜和芜菁的远缘杂交，一方面可以创造新型遗传材料，如:人工合成新物种有助于探 明物种间的种属进化关系;培育异附加系，在促进物种之间的基因渐渗和分子细胞遗传研 究生有着重要的作用，同时在分子细胞遗传学中，可用来增加遗传图谱精确度，用于分子标 签和克隆外源基因、染色体物理作图、建立特定染色，体文库、研究单条染色体区段的结构 等方面。培育的种间杂种，作为桥梁物种，有助于增加萝卜属和芸薹属的杂交亲和性，同时有 助于转移萝卜属中的优异性状到芸薹属作物中，丰富作物的育种基础。目前，鲜见有芜菁和 萝卜的属间杂种成功的例子。
【发明内容】
[0004] 本发明解决的技术问题是:提出一种创制芜菁和萝卜属间杂种的方法。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是:一种创制芜菁和萝卜属间杂种 的方法，具体包括如下步骤：
[0006] (1)亲本材料的播种:为使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播种萝卜材料，11月 份播种芜菁材料；
[0007] (2)花期杂交授粉:次年3-4月份，以芜菁为母本，以萝卜为父本，采用人工去雄、蕾 期采用化学药剂涂抹柱头的方式进行授粉杂交；
[0008] (3)考种:6月中旬，种荚成熟后，陆续采收、脱荚，统计收获种子数量和编号；
[0009] (4)组织培养获得杂种苗:9月中旬，利用组织培养技术对收获的种子，进行发芽、 生长；
[0010] (5)无菌苗驯化;待无菌苗生长至一定大小，根系较壮后，于驯化前一天，揭开瓶盖 进行练苗，移栽至盛装灭菌营养土的小钵中，遮阳网遮盖，进行幼苗生长，一周后，移栽入塑 料大棚中，进行常规管理；
[0011] (6)杂种形态学鉴定:采用形态学的方法，对杂种苗进行鉴定，利用米尺、直尺以及 游标卡尺，分别统计其株高、叶形、叶片大小、花色、花蕾大小、花萼大小、花瓣大小、雄蕊长、 雌蕊长，花粉情况，每次测量重复3次；
[0012] (7)杂种的细胞学鉴定方法:取花蕾，利用细胞学方法，进行染色体鉴定。
[0013]优选的，所述步骤1中亲本材料的播种方式为穴播，株距为30cm，大小行距为60 X 80cm;每穴播种2~3粒种子，出苗后，待植株长至5~10cm，进行间苗，每穴保留一株;常规田 间管理。
[0014]优选的，所述步骤2中的花期杂交授粉具体为：
[0015] (1)首先对母本花序进行整理，去除已经开放的花以及花序中间特别小的花蕾，保 留花序外围，未开放的大花蕾，进行剥蕾、去雄；
[0016] (2)使用质量浓度为60mg/L的GA3对授粉前母本柱头进行滴浸；
[0017] (3)取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组 合、授粉时间。
[0018] 优选的，所述步骤4中的组织培养获得杂种苗的具体步骤为：
[0019] (1)种子首先进行70%乙醇处理lmin;
[0020] (2)6%次氯酸钠溶液处理15min;
[0021] (3)无菌水冲洗4~5次；
[0022] (4)无菌滤纸吸干种子上残存水分；
[0023] (5)接种于1 /2MS培养基上，每瓶接种10~15粒种子；
[0024] (6)放置在组织培养室内进行培养，培养条件为:室温25°C，光照时间为16h/d，光 照强度为20001UX条件下培养，获得无菌苗。
[0025] 优选的，所述步骤7中的杂种的细胞学鉴定方法的具体步骤为：
[0026] (1)取花序中间小花蕾，用改良卡诺固定液，乙醇:氯仿：乙酸=5:2: 3进行固定，一 天后更换新的固定液，于4°C冰箱保存备用；
[0027] (2)制片，从花序上挑取直径为0.5~1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至 70 %乙醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药；
[0028] (3)使用4 %的纤维素酶RS和4 %的果胶酶Y-23混合溶液，37 °C酶解2h 1 Omin;
[0029] (4)水洗、固定，制片、制片后加 DAPI后，在显微镜下观察，并记录染色体数。
[0030] 有益效果：
[0031] 本发明根据芸薹种与萝卜杂交时受精前障碍较小，芸薹种的雌蕊允许萝卜花粉萌发 和花粉管伸长，但是受精后障碍严重的特点，采用蕾期授粉以及授粉前涂抹一定浓度赤霉 素到母本柱头上的方法，最大程度的改善属间杂交的亲和性，而授粉后，采取的是自然结 荚，借助组织培养技术，进行种粒无菌培养的方法，获得了杂种苗并对其进行了形态学和细 胞学的鉴定，确定是真实的属间杂种。
[0032]本发明采用人工去雄的方式进行蕾期授粉杂交，人工授粉中采用赤霉素（GA3 60mg/L)溶液涂抹柱头的方法，促进了受精及子房和胚的发育。收获的种子采用组织培养的 方式进行杂种胚的胚胎拯救。获得了芜菁(2n = 20)和萝卜(2n=18)的属间杂种(染色体数2n = 19)，本发明一方面创造出了新型遗传材料，有助于探明物种间的种属进化关系;培育异 附加系，在促进物种之间的基因渐渗和分子细胞遗传研究生有着重要的作用；另一方面，培 育的种间杂种，作为桥梁物种，有助于增加萝卜属和芸薹属的杂交亲和性，同时有助于转移 萝卜属中的优异性状到芸薹属作物中，丰富作物的育种基础。在特异新品种的培育方面，具 有较高的实用价值。
【附图说明】
[0033]下面结合附图对本发明的作进一步说明。
[0034]图1是芜菁-萝卜亲本及杂种形态图（从左至右，次为：13W7、是芜菁-杂种、14R5) [0035]图2是芜菁-萝卜亲本及杂种花形态图（从左至右，次为：13W7、是芜菁-杂种、14R5)
[0036]图3是芜菁-萝卜属间杂种的染色体图
【具体实施方式】 [0037] 实施例1
[0038] -种创制芜菁和萝卜的属间杂种的方法，具体包括如下步骤：
[0039] 1、亲本材料的播种:为使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播种萝卜材料，11月份 播种芜菁材料;亲本材料的播种方式为穴播，株距为30cm，大小行距为60 X 80cm;每穴播种2 ~3粒种子，出苗后，待植株长至5~10cm，进行间苗，每穴保留一株;常规田间管理。
[0040] 2、花期杂交授粉:次年3-4月份，以芜菁为母本，以萝卜为父本，采用人工去雄、蕾期 采用化学药剂涂抹柱头的方式进行授粉杂交;具体为：
[0041] (1)首先对母本花序进行整理，去除已经开放的花以及花序中间特别小的花蕾，保 留花序外围，未开放的大花蕾，进行剥蕾、去雄；
[0042] (2)使用质量浓度为60mg/L的GA3对授粉前母本柱头进行滴浸；
[0043] (3)取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组 合、授粉时间。
[0044] 3、考种:6月中旬，种荚成熟后，陆续采收、脱荚，统计收获种子数量和编号；
[0045] 4、组织培养获得杂种苗:9月中旬，利用组织培养技术对收获的种子，进行发芽、生 长;组织培养获得杂种苗的具体步骤为：
[0046] (1)种子首先进行70%乙醇处理lmin;
[0047] (2)6%次氯酸钠溶液处理15min;
[0048] (3)无菌水冲洗4~5次；
[0049] (4)无菌滤纸吸干种子上残存水分；
[0050] (5)接种于1/2MS培养基上，每瓶接种10~15粒种子；
[0051 ] (6)放置在组织培养室内进行培养，培养条件为:室温25°C，光照时间为16h/d，光 照强度为20001UX条件下培养，获得无菌苗。
[0052] 5、无菌苗驯化;待无菌苗生长至一定大小，根系较壮后，于驯化前一天，揭开瓶盖 进行练苗，移栽至盛装灭菌营养土的小钵中，遮阳网遮盖，进行幼苗生长，一周后，移栽入塑 料大棚中，进行常规管理；
[0053] 6、杂种形态学鉴定:采用形态学的方法，对杂种苗进行鉴定，利用米尺、直尺以及 游标卡尺，分别统计其株高(cm)、叶形、叶片大小(长X宽，cm)、花色、花蕾大小(长X直径， mm)、花萼大小（长X宽，mm)、花瓣大小(mm)、雄蕊长(mm)、雌蕊长(mm)，花粉情况，每次测量 重复3次；
[0054] 7、杂种的细胞学鉴定方法:取花蕾，利用细胞学方法，进行染色体鉴定，具体步骤 为：
[0055] (1)取花序中间小花蕾，用改良卡诺固定液，乙醇:氯仿：乙酸=5:2: 3进行固定，一 天后更换新的固定液，于4°C冰箱保存备用；
[0056] (2)制片，从花序上挑取直径为0.5~1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至 70 %乙醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药；
[0057] (3)使用4 %的纤维素酶RS和4 %的果胶酶Y-23混合溶液，37 °C酶解2h 1 Omin;
[0058] (4)水洗、固定，制片、制片后加 DAPI后，在显微镜下观察，并记录染色体数。
[0059] 图1，母本芜菁，花色黄色，叶片抱茎，叶缘光滑；芜菁-萝卜属间杂种，花色白色，叶 片基生，叶缘光滑;父本萝卜，花色白色，叶片着生在叶柄上，叶缘锯齿状;结合表2的表型数 据，在叶形上、杂种处于偏亲表现;在叶片大小上，除杂种1偏向母本芜菁，杂种4偏向父本萝 卜外，其他两株杂种，叶片大小介于双亲之间；所有杂种，花色均为白色，与父本萝卜相同；而 在株高、花蕾大小、花萼大小、花瓣大小、雄蕊长等方面杂种表现介于双亲之间；雌蕊长，杂 种1~3具有超亲优势，杂种4与雌蕊较长的母本芜菁相似;杂种无粉，是杂种不育的典型表 现；
[0060] 图2,母本芜菁13W7的花色为黄色，花型蝴蝶状，对称花夹角小；芜菁-萝卜杂种同父 本萝卜花色相似为白色，花型与母本相似，为蝴蝶状，对称花夹角较小;父本萝卜14R5，花色为 白色，花型为蜻蜓状，对称花夹角较大；
[0061] 图3,染色体条数，共计为19条，证明我们获得了芜菁(n=10)和萝Kn = 9)的属间 杂种(染色体数2n = 19);
[0062] 表1芜菁-萝卜属间杂种的获得
[0063]
[0064]表2杂种的形态学鉴定
[0065]
[0066] 实施例2
[0067] 实施例2的一种创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，具体步骤同实施例1的创制芜菁 和萝卜属间杂种的方法，不同之处在于：
[0068] 所述步骤1中亲本材料的播种方式为穴播，每穴播种2~3粒种子，出苗后，待植株 长至一定大小，进行间苗，每穴保留一株;常规田间管理。
[0069] 所述步骤2中的花期杂交授粉具体为：
[0070] (1)首先对母本花序进行整理，对合适大小的花蕾，进行剥蕾、去雄；
[0071 ] (2)使用一定质量浓度的GA3对授粉前母本柱头进行滴浸；
[0072] (3)取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组 合、授粉时间。
[0073] 所述步骤4中的组织培养获得杂种苗的具体步骤为：
[0074] (1)种子首先进行70 %乙醇预处理；
[0075] (2)消毒处理；
[0076] (3)无菌水冲洗4~5次；
[0077] (4)无菌滤纸吸干种子上残存水分；
[0078] (5)接种于1 /2MS培养基上，每瓶接种10~15粒种子；
[0079] (6)放置在组织培养室内进行培养，获得无菌苗。
[0080]所述步骤7中的杂种的细胞学鉴定方法的具体步骤为：
[0081] (1)取花序中间小花蕾，卡诺固定液进行固定，一天后更换新的固定液，于4°C冰箱 保存备用；
[0082] (2)制片，从花序上挑取直径为0.5~1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至 70 %乙醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药；
[0083] (3)使用混合溶液进行酶解；
[0084] (4)水洗、固定，制片，显微镜下统计染色体数并拍照。
[0085] 本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术 方案均为本发明要求的保护范围。
【主权项】
1. 一种创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，具体包括如下步骤： (1) 亲本材料的播种:为使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播种萝卜材料，11月份播 种宪菁材料； (2) 花期杂交授粉:次年3-4月份，以芜菁为母本，以萝卜为父本，采用人工去雄、蕾期采 用化学药剂涂抹柱头的方式进行授粉杂交； (3) 考种:6月中旬，种荚成熟后，陆续采收、脱荚，统计收获种子数量和编号； (4) 组织培养获得杂种苗:9月中旬，利用组织培养技术对收获的种子，进行发芽、生长； (5) 无菌苗驯化;待无菌苗生长至一定大小，根系较壮后，于驯化前一天，揭开瓶盖进行 练苗，移栽至盛装灭菌营养土的小钵中，遮阳网遮盖，进行幼苗生长，一周后，移栽入塑料大 棚中，进行常规管理； (6) 杂种形态学鉴定:采用形态学的方法，对杂种苗进行鉴定，利用米尺、直尺以及游标 卡尺，分别统计其株高、叶形、叶片大小、花色、花蕾大小、花萼大小、花瓣大小、雄蕊长、雌蕊 长，花粉情况，每次测量重复3次； (7) 杂种的细胞学鉴定方法:取花蕾，利用细胞学方法，进行染色体鉴定。2. 根据权利要求1所述创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，其特征在于:所述步骤1中亲本 材料的播种方式为穴播，株距为30cm，大小行距为60 X 80cm;每穴播种2~3粒种子，出苗后， 待植株长至5~10cm，进行间苗，每穴保留一株;常规田间管理。3. 根据权利要求1所述创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，其特征在于:所述步骤2中的花 期杂交授粉具体为： (1) 首先对母本花序进行整理，去除已经开放的花以及花序中间特别小的花蕾，保留花 序外围，未开放的大花蕾，进行剥蕾、去雄； (2) 使用质量浓度为60mg/L的GA3对授粉前母本柱头进行滴浸； (3) 取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组合、 授粉时间。4. 根据权利要求1所述创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，其特征在于:所述步骤4中的组 织培养获得杂种苗的具体步骤为： (1) 种子首先进行70 %乙醇处理lmin; (2) 6%次氯酸钠溶液处理1511^11; (3) 无菌水冲洗4~5次； (4) 无菌滤纸吸干种子上残存水分； (5) 接种于1/2MS培养基上，每瓶接种10~15粒种子； (6) 放置在组织培养室内进行培养，培养条件为:室温25°C，光照时间为16h/d，光照强 度为20001UX条件下培养，获得无菌苗。5. 根据权利要求1所述创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，其特征在于:所述步骤7中的杂 种的细胞学鉴定方法的具体步骤为： (1) 取花序中间小花蕾，用改良卡诺固定液，乙醇:氯仿：乙酸= 5:2:3进行固定，一天后 更换新的固定液，于4 °C冰箱保存备用； (2) 制片，从花序上挑取直径为0.5~1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至70 %乙 醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药； (3) 使用4%的纤维素酶RS和4%的果胶酶Y-23混合溶液，37°C酶解2h lOmin; (4) 水洗、固定，制片、制片后加 DAPI后，在显微镜下观察，并记录染色体数。
【文档编号】A01C1/00GK105993913SQ201610339098
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】娄丽娜, 苏小俊, 娄群峰, 许园园
【申请人】江苏省农业科学院