一种白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法
【专利摘要】本申请公开了一种白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法，选取白花虎眼万年青的叶片作为组培用的外植体；通过叶片表面珠芽诱导培养形成种苗，或者通过叶片愈伤组织诱导培养、不定芽诱导培养、生根培养形成种苗；待种苗长出不定根后，进行组培苗驯化移栽，然后正常培养。本申请白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法，解决了采用地下球茎繁殖存在再生困难、种球繁殖系数低的问题，具有操作简便、增殖系数高的显著优点，不受地区、季节、气候限制，可实现优质种苗的工厂化规模化生产。
【专利说明】
一种白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法
技术领域
[0001]本申请属于植物繁殖技术领域，具体地说，涉及一种白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002]白花虎眼万年青(Orni thoga Ium thy r o i de s )是百合科虎眼万年青属(Ornithogalum spp)的多年生球茎花卉，高25?50厘米，有皮鳞茎圆形光滑，观赏价值高。叶基部丛生，披针形而长，顶端具长尾，深绿色，无柄。花小型，总状花序紧密，金字塔形，生于从叶丛中抽生的花葶顶部，25多以上小花，花形杯状，花色白色，花瓣中央无绿色条纹。
[0003]不但其花朵及球茎具有较高的观赏价值，可广泛应用于园林绿化和作为鲜切花，而且化学成分分析表明，其中含有留醇糖苷、胆留烷糖苷等次生代谢物质，具有潜在的药用和经济价值。
[0004]随着经济社会及园林事业的发展，球根花卉因为具有种类丰富、花色艳丽、花期较长、栽培容易、适应性强等特点和优点，在园林中应用越来越多，可广泛作为切花、地被和盆花等，亦具有较高的药用和经济价值。虎眼万年青属植物作为百合科多年生鳞茎花卉，有150多种，因其具有较高的观赏价值，以及较高的药用价值，愈来愈受到瞩目。
[0005]但是球根花卉的繁育无论在野生还是离体条件下，基本是采用地下的球茎，普遍存在着再生困难、种球繁育系数低及种质创新难等突出问题，虎眼万年青属植物也不例外，成为制约其研究开发的瓶颈。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本申请针对采用地下球茎繁殖存在再生困难、种球繁殖系数低的问题，提供了一种白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法，具有操作简便、增殖系数高的显著优点，可实现优质种苗的工厂化规模化生产。
[0007]为了解决上述技术问题，本申请公开了一种白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法，选取白花虎眼万年青的叶片作为组培用的外植体;通过叶片表面珠芽诱导培养形成种苗，或者通过叶片愈伤组织诱导培养、不定芽诱导培养、生根培养形成种苗;待种苗长出不定根后，进行组培苗驯化移栽，然后正常培养。
[0008]进一步地，具体包括以下步骤:
[0009]步骤I，外植体的选择及处理
[0010]选取白花虎眼万年青的叶片为起始材料，将采集到的叶片切成2?4cm的叶段，作为组培用的外植体；
[0011]步骤2，对叶片进行诱导形成种苗
[0012]将经过表面消毒的外植体接种于珠芽诱导培养基MS+TDZ2.0mg/L上在光照处培养，待叶片表面逐渐形成完整的根系后，将根系插入培养基中成为新的种苗；
[0013]或者，将经过表面消毒的外植体接种于愈伤组织诱导培养基MS+2，4D2.0mg/L上进行暗培养，待叶片切口处形成白色或淡黄色的愈伤组织，然后接种于不定芽诱导培养基MS+6BA2.0mg/L，放在光照处培养，愈伤组织逐渐形成不定芽，再将其转接到生根培养基MS+IBAl.0mg/L上，20?30d后，生根成苗成为新的种苗；
[0014]步骤3，组培苗驯化移栽
[0015]待种苗长出3?5条2?3cm的不定根后，进行炼苗，然后将组培苗移栽到培养基质中进行缓苗，再正常培养。
[0016]进一步地，培养温度为25 °C。
[0017]进一步地，光照时间为12?14h/d，光照强度为40?60u.Mol.m—2.s—1。
[0018]进一步地，珠芽诱导、愈伤组织诱导、不定芽诱导及生根培养，所用的基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为20?40g/L，凝固剂为琼脂粉、用量为6?7g/L，培养基pH为5.8。
[0019]进一步地，所述炼苗具体为:先在组培室打开瓶盖炼苗3天，然后将其移至温室或荫棚，再炼苗3天。
[°02°]进一步地，所述培养基质由沙壤土与草炭土按质量比3:1组成。
[0021]进一步地，所述培养基质的含水量25%以内，空气相对湿度80?90%。
[0022]与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果:
[0023](I)本申请通过选取白花虎眼万年青的叶片作为组培用的外植体;通过叶片表面珠芽诱导培养形成种苗，或者通过叶片愈伤组织诱导培养、不定芽诱导培养、生根培养形成种苗;待种苗长出不定根后，进行组培苗驯化移栽，然后正常培养，解决了采用地下球茎繁殖存在再生困难、种球繁殖系数低的问题，具有操作简便、增殖系数高的显著优点，不受地区、季节、气候限制，可实现优质种苗的工厂化规模化生产。
[0024](2)从母株上剪下叶片，以叶片为外植体，一个叶片上形成多个珠芽，繁殖系数达3?10，是一般繁殖方式的十几倍甚至几十倍，而且对植株本身损伤较少，母株可以继续生长和利用，实现可持续生产和发展。
[0025](3)建立白花虎眼万年青的高效再生体系，为白花虎眼万年青的产业化开发、建立分子育种平台及种质资源创新等提供良好的技术支持和体系支撑;为完善白花虎眼万年青的遗传转化体系，建立分子育种的平台，从分子水平对其进行遗传改良，深入研究开发利用奠定了基础。
[0026](4)本申请还可为其他球根花卉及再生困难的植物提供有益的思路和借鉴。
[0027]当然，实施本申请的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
【附图说明】
[0028]此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中:
[0029]图1是本申请实施例白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖过程对比图；图中，A为白花虎眼万年青叶片，B为白花虎眼万年青叶片表面形成多个珠芽，C为叶片表面的珠芽逐渐萌发，D为珠芽生根成苗，E为叶片产生愈伤组织及愈伤组织分化出不定芽，F为白花虎眼万年青种苗生根，G为白花虎眼万年青形成花芽，H为白花虎眼万年青开花。
【具体实施方式】
[0030]以下将配合实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
[0031]本发明白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法，具体包括以下步骤:
[0032]步骤I，外植体的选择及处理
[0033]选取白花虎眼万年青的叶片为起始材料，将采集到的叶片切成2?4cm的叶段，作为组培用的外植体；
[0034]步骤2，对叶片进行诱导形成种苗
[0035]步骤2-1，将经过表面消毒的叶段转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸干叶段表面水分；
[0036]具体地，所述消毒具体为:将白花虎眼万年青叶段用洗洁精溶液清洗30min，期间不断轻轻搅拌，然后流水冲洗30?60min，在已经消毒的超净工作台上将上述清洗过的白花虎眼万年青叶段转移至无菌烧杯中，用体积浓度为75%的酒精浸泡30?60s，期间不断晃动烧杯，倒出酒精，再用质量浓度0.1%的升汞浸泡3?5min，浸泡期间不断轻轻晃动，倒出升汞后，用无菌水清洗经过消毒的叶片3次以上。
[0037]步骤2-2，将消毒后的叶段平放或插入珠芽诱导培养基MS+TDZ2.0mg/L (TDZ:噻苯隆)上进行珠芽的诱导，如图1(A)所示，培养温度25°C，光照时间为12?14h/d，光照强度为40?60u.Mol.m—2^1JOd后叶片表面形成小白点，如图1 (B)所示，小白点逐渐变绿，再过20d后，小白点变成绿球，如图1(C)所示，绿球慢慢生根，最后形成完整的根系，如图1(D)所示，将根系插入培养基中成为新的种苗，即“叶上生根，落地成苗”；
[0038]或者，将消毒后的叶段接种于愈伤组织诱导培养基MS+2，4D2.0mg/L (2，4D: 2，4-二氯苯氧乙酸)上置于黑暗处进行愈伤组织的诱导，温度25°C，20d后从叶片切口处形成白色或淡黄色的愈伤组织;然后将诱导出的愈伤组织转移到不定芽诱导培养基MS+6BA2.0mg/L(6BA:苄氨基嘌呤)进行不定芽的诱导，培养温度25°C，光照时间为12?14h/d，光照强度为40?60u.Mol.m—2.s—1JOd后愈伤组织逐渐形成不定芽(叶片)，如图1(E)所示;再将诱导出的不定芽转接到生根培养基MS+IBA1.0mg/L( IBA:吲噪丁酸)上进行不定根的诱导，20?30d后，生根成苗成为新的种苗，如图1(F)所示；
[0039]其中，珠芽诱导、愈伤组织诱导、不定芽诱导及生根培养，所用的基本培养基均为MS培养基，鹿糖用量为20?40g/L，凝固剂为琼脂粉、用量为6?7g/L，培养基pH为5.8。
[0040]步骤3，组培苗驯化移栽
[0041]待种苗长出3?5条2?3cm的不定根后，进行炼苗，然后将组培苗表面的琼脂洗净，移栽到培养基质中进行缓苗，如图1(G)所示，组培苗移栽到盆中并形成花芽，再正常培养，如图1 (H)所示，繁殖的白花虎眼万年青无限花序从下至上依次开放一个月。
[0042]所述炼苗具体为:先在组培室打开瓶盖炼苗3d，然后将其移至温室或荫棚，再炼苗3d。
[0043]优选的，培养基质由沙壤土与草炭土按质量比3:1组成，培养基质的含水量25%以内，空气相对湿度80?90 %。
[0044]实施例1
[0045]步骤I，外植体的选择及处理
[0046]选取白花虎眼万年青的叶片为起始材料，将采集到的叶片切成3cm的叶段，作为组培用的外植体；
[0047]步骤2，对叶片进行诱导形成种苗
[0048]步骤2-1，将经过表面消毒的叶段转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸干叶段表面水分；
[0049]步骤2-2，将消毒后的叶段平放或插入珠芽诱导培养基MS+TDZ2.0mg/L上进行珠芽的诱导，培养温度250C，光照时间为14h/d，光照强度为40u.Mol.m—2.s—1;待叶片表面逐渐形成完整的根系后，将根系插入培养基中成为新的种苗；
[0050]所用的基本培养基为MS培养基，蔗糖用量为30g/L，凝固剂为琼脂粉、用量为6.5g/L，培养基pH为5.8。
[0051 ]步骤3，组培苗驯化移栽
[0052]待种苗长出3条3cm的不定根后，进行炼苗，然后将组培苗表面的琼脂洗净，移栽到培养基质中进行缓苗，培养基质由沙壤土与草炭土按质量比3:1组成，培养基质的含水量25%以内，空气相对湿度80%，再正常培养。
[0053]实施例2
[0054]步骤I，外植体的选择及处理
[0055 ]选取白花虎眼万年青的叶片为起始材料，将采集到的叶片切成2cm的叶段，作为组培用的外植体；
[0056]步骤2，对叶片进行诱导形成种苗
[0057]步骤2-1，将经过表面消毒的叶段转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸干叶段表面水分；
[0058]步骤2-2，将消毒后的叶段平放或插入珠芽诱导培养基MS+TDZ2.0mg/L上进行珠芽的诱导，培养温度250C，光照时间为13h/d，光照强度为50u.Mol.m—2.s—1;待叶片表面逐渐形成完整的根系后，将根系插入培养基中成为新的种苗；
[0059]所用的基本培养基为MS培养基，蔗糖用量为20g/L，凝固剂为琼脂粉、用量为6g/L，培养基pH为5.8。
[0060]步骤3，组培苗驯化移栽
[0061]待种苗长出4条3cm的不定根后，进行炼苗，然后将组培苗表面的琼脂洗净，移栽到培养基质中进行缓苗，培养基质由沙壤土与草炭土按质量比3:1组成，培养基质的含水量25%以内，空气相对湿度85%，再正常培养。
[0062]实施例3
[0063]步骤I，外植体的选择及处理
[0064]选取白花虎眼万年青的叶片为起始材料，将采集到的叶片切成4cm的叶段，作为组培用的外植体；
[0065]步骤2，对叶片进行诱导形成种苗
[0066]步骤2-1，将经过表面消毒的叶段转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸干叶段表面水分；
[0067]步骤2-2，将消毒后的叶段平放或插入珠芽诱导培养基MS+TDZ2.0mg/L上进行珠芽的诱导，培养温度250C，光照时间为12h/d，光照强度为60u.Mol.m—2.s—1;待叶片表面逐渐形成完整的根系后，将根系插入培养基中成为新的种苗；
[0068]所用的基本培养基为MS培养基，蔗糖用量为40g/L，凝固剂为琼脂粉、用量为7g/L，培养基pH为5.8。
[0069]步骤3，组培苗驯化移栽
[0070]待种苗长出5条2cm的不定根后，进行炼苗，然后将组培苗表面的琼脂洗净，移栽到培养基质中进行缓苗，培养基质由沙壤土与草炭土按质量比3:1组成，培养基质的含水量25%以内，空气相对湿度90%，再正常培养。
[0071 ] 实施例4
[0072]步骤I，外植体的选择及处理
[0073]选取白花虎眼万年青的叶片为起始材料，将采集到的叶片切成3cm的叶段，作为组培用的外植体；
[0074]步骤2，对叶片进行诱导形成种苗
[0075]步骤2-1，将经过表面消毒的叶段转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸干叶段表面水分；
[0076]步骤2-2，将消毒后的叶段接种于愈伤组织诱导培养基MS+2，4D2.0mg/L上置于黑暗处进行愈伤组织的诱导，温度25°C;然后将诱导出的愈伤组织转移到不定芽诱导培养基M S + 6 B A 2.0 m g / L进行不定芽的诱导，培养温度2 5 °C，光照时间为14 h / d，光照强度为40u.Mol.m—2.s—1;再将诱导出的不定芽转接到生根培养基MS+IBA1.0mg/L上进行不定根的诱导，20?30d后，生根成苗成为新的种苗；
[0077]所用的基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为30g/L，凝固剂为琼脂粉、用量为6.58/1，培养基?!1为5.8。
[0078]步骤3，组培苗驯化移栽
[0079]待种苗长出3条3cm的不定根后，进行炼苗，然后将组培苗表面的琼脂洗净，移栽到培养基质中进行缓苗，培养基质由沙壤土与草炭土按质量比3:1组成，培养基质的含水量25%以内，空气相对湿度80%，再正常培养。
[0080]实施例5
[0081 ]步骤I，外植体的选择及处理
[0082]选取白花虎眼万年青的叶片为起始材料，将采集到的叶片切成2cm的叶段，作为组培用的外植体；
[0083]步骤2，对叶片进行诱导形成种苗
[0084]步骤2-1，将经过表面消毒的叶段转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸干叶段表面水分；
[0085]步骤2-2，将消毒后的叶段接种于愈伤组织诱导培养基MS+2，4D2.0mg/L上置于黑暗处进行愈伤组织的诱导，温度25°C;然后将诱导出的愈伤组织转移到不定芽诱导培养基M S + 6 B A 2.0 m g / L进行不定芽的诱导，培养温度2 5 °C，光照时间为13 h / d，光照强度为50u.Mol.m—2.s—1;再将诱导出的不定芽转接到生根培养基MS+IBA1.0mg/L上进行不定根的诱导，20?30d后，生根成苗成为新的种苗；
[0086]所用的基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为20g/L，凝固剂为琼脂粉、用量为6g/L，培养基pH为5.8。
[0087]步骤3，组培苗驯化移栽
[0088]待种苗长出4条3cm的不定根后，进行炼苗，然后将组培苗表面的琼脂洗净，移栽到培养基质中进行缓苗，培养基质由沙壤土与草炭土按质量比3:1组成，培养基质的含水量25%以内，空气相对湿度85%，再正常培养。
[0089]实施例6
[0090]步骤I，外植体的选择及处理
[0091]选取白花虎眼万年青的叶片为起始材料，将采集到的叶片切成4cm的叶段，作为组培用的外植体；
[0092]步骤2，对叶片进行诱导形成种苗
[0093]步骤2-1，将经过表面消毒的叶段转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸干叶段表面水分；
[0094]步骤2-2，将消毒后的叶段接种于愈伤组织诱导培养基MS+2，4D2.0mg/L上置于黑暗处进行愈伤组织的诱导，温度25°C;然后将诱导出的愈伤组织转移到不定芽诱导培养基M S + 6 B A 2.0 m g / L进行不定芽的诱导，培养温度2 5 °C，光照时间为I 2 h / d，光照强度为60u.Mol.m—2.s—1;再将诱导出的不定芽转接到生根培养基MS+IBA1.0mg/L上进行不定根的诱导，20?30d后，生根成苗成为新的种苗；
[0095]所用的基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为40g/L，凝固剂为琼脂粉、用量为7g/L，培养基pH为5.8。
[0096]步骤3，组培苗驯化移栽
[0097]待种苗长出5条2cm的不定根后，进行炼苗，然后将组培苗表面的琼脂洗净，移栽到培养基质中进行缓苗，培养基质由沙壤土与草炭土按质量比3:1组成，培养基质的含水量25%以内，空气相对湿度90%，再正常培养。
[0098]采用上述方法对白花虎眼万年青叶片组织培养繁殖，繁殖系数达3?10，是一般繁殖方式的十几倍甚至几十倍，而且对植株本身损伤较少，母株可以继续生长和利用，实现可持续生产和发展，且不受地区、季节、气候限制，可实现优质种苗的工厂化规模化生产。
[0099]如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于” ο “大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
[0100]还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
[0101]上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
【主权项】
1.一种白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，选取白花虎眼万年青的叶片作为组培用的外植体;通过叶片表面珠芽诱导培养形成种苗，或者通过叶片愈伤组织诱导培养、不定芽诱导培养、生根培养形成种苗;待种苗长出不定根后，进行组培苗驯化移栽，然后正常培养。2.如利要求I所述的白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，具体包括以下步骤: 步骤I，外植体的选择及处理 选取白花虎眼万年青的叶片为起始材料，将采集到的叶片切成2?4cm的叶段，作为组培用的外植体； 步骤2，对叶片进行诱导形成种苗 将经过表面消毒的外植体接种于珠芽诱导培养基MS+TDZ2.0mg/L上在光照处培养，待叶片表面逐渐形成完整的根系后，将根系插入培养基中成为新的种苗； 或者，将经过表面消毒的外植体接种于愈伤组织诱导培养基MS+2，4D2.0mg/L上进行暗培养，待叶片切口处形成白色或淡黄色的愈伤组织，然后接种于不定芽诱导培养基MS+6BA2.0mg/L，放在光照处培养，愈伤组织逐渐形成不定芽，再将其转接到生根培养基MS+IBAl.0mg/L上，20?30d后，生根成苗成为新的种苗； 步骤3，组培苗驯化移栽 待种苗长出3?5条2?3cm的不定根后，进行炼苗，然后将组培苗移栽到培养基质中进行缓苗，再正常培养。3.如利要求2所述的白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，培养温度为 25°C。4.如利要求2所述的白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，光照时间为 12 ?14h/d，光照强度为 40 ?60u.Mol.m—2.s—、5.如利要求2所述的白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，珠芽诱导、愈伤组织诱导、不定芽诱导及生根培养，所用的基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为20?40g/L，凝固剂为琼脂粉、用量为6?7g/L，培养基pH为5.8。6.如利要求2所述的白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述炼苗具体为:先在组培室打开瓶盖炼苗3天，然后将其移至温室或荫棚，再炼苗3天。7.如利要求2所述的白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述培养基质由沙壤土与草炭土按质量比3:1组成。8.如利要求2或7所述的白花虎眼万年青的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述培养基质的含水量25%以内，空气相对湿度80?90%。
【文档编号】A01H4/00GK106069756SQ201610431551
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】姜福星, 陈其兵, 黄远祥, 周鹏
【申请人】四川天艺优境环境科技有限公司