一种雪莲离体培育方法
【专利摘要】本发明公开一种雪莲离体培育方法，采用雪莲的花托外植体诱导培养，先用蓝光照射再用荧光照射，二者的结合大大缩短了愈伤组织的愈伤分化时间，提高了愈伤组织的形成数量与效率。本发明经离体培养得到的雪莲幼苗，缩短培育周期，保持雪莲基因的典型性，具有在雪莲人工栽培领域的应用前景。
【专利说明】
_种雪莲禹体培育方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种珍稀中草药离体培育方法，具体涉及一种基于雪莲花药的离体培育方法。
【背景技术】
[0002]雪莲是菊科凤毛菊属植物，一般是指雪莲花，为多年生草本植物，含有蛋白质、氨基酸、黄酮类化合物、生物碱等，具有通经活血、散寒除湿、止血消肿、排体内毒素等功效。药用价值很高，可用于风寒引起的四肢麻木，风湿性关节炎，小腹冷痛，妇女月经不调，肾虚腰痛等。
[0003]雪莲多生长于天山、阿尔泰山和昆仑山脉海拔3000米以上雪线附近，生长期需6?8年。20世纪末，国内外对雪莲花需求量与日倶增，雪莲遭到疯狂的采挖，造成野生雪莲资源急剧减少;现在雪莲已被列为国家三级濒危物种，为一级重点保护野生植物。随着野生雪莲的数量的减少与保护力度的加大，雪莲资源远远不能满足药用的需要，为了保证雪莲花药源的充分供应，保护野生种植资源的繁衍恢复，现有技术开始研究实现雪莲花的人工栽培。由于雪莲生长的特殊自然条件，进行人工栽培比较困难。
[0004]现有技术人工栽培雪莲的方法有组织培养法和种子繁殖法两种。组织培养法的繁殖系数低，不能满足大规模生产的需要，而且由于培养环境如光照、水分、温度、营养等以及激素浓度等因素易造成雪莲种苗发生无性变异。
[0005]而通过种子繁殖的方法也存在诸多缺陷，由于雪莲生长在极端的环境中，其种子具有活力强、发芽慢的特点，有些雪莲的种子可以埋藏在地下三年不发芽，发芽这一环节的不可控性极大的延长了雪莲人工培养的周期;若采用人工活化雪莲种子的方式，则可能发生种子生物结构被破坏，造成雪莲种质资源的浪费；由于雪莲是异花传粉，会导致其基因混杂，得到的种子继续培育后达不到预期药用效果。
【发明内容】
[0006]为克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种雪莲离体培育方法，所述方法基于雪莲的花托外植体，经过诱导培养得到雪莲幼苗，既保持其基因的典型性，又能缩短培育周期，提高成功率。
[0007]具体步骤如下:
[0008](I)花托外植体预处理:
[0009]选取雪莲的花蕾，在4°C环境中冷藏3?5天后，将花蕾取出自然恢复至室温，剥去苞片和小花，用纯净水冲洗，先在0.05%的升汞水溶液中消毒5?8min，再用70%的酒精消毒20?40s，之后用无菌水冲洗3次，即得到雪莲花托外植体。以上涉及的百分比均为体积百分比。
[0010](2)外植体接种及诱导培养:
[0011 ]将雪莲花托外植体移入到灭菌后的第一培养基中，将温度设定为23 ± I °C，以蓝光灯为光源，光照强度控制为400?800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，每十天更换一次培养基，直到诱导出愈伤组织。
[0012]所述第一培养基的组成成分为:KNO3 800?1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800?1200mg/L，KH2P04 300?450mg/L，CaCl2.2H20 320?350mg/L，MgS04.7H20 180?240mg/L，EDTA 120?180mg/L，FeS04.7H20 30?50mg/L，MnS04.4H20 50?80mg/L，ZnS04.7H2015?30mg/L，H3B03 8?10mg/L，KI 5?10mg/L，Na2Mo04.2H20 I?5mg/L，CoCl2.6H2O 0.2?0.5mg/L，4-鹏苯氧乙酸0.15?0.20mg/L，肌醇30?80mg/L，甘氛酸0.5?I.0mg/L，维生素BI 0.5?0.7511^/1，维生素86 1.0?1.5mg/L，烟酸1.0?1.5mg/L，蔗糖30?50g/L，琼脂 10?15g/L，激动素KT 0.5?I.0mg/L，萘乙酸NAA0.3?0.4mg/L，山梨醇50?70g/L，生物素0.15?0.20mg/L，盐酸卩比卩多醇0.5?1.0mg/L，盐酸硫胺素0.5?I.0mg/L，甲基亚硝基脲1.5?2.0mg/L,卩引噪丁酸I.5?2.0mg/L，丙氨酸5?10mg/L，叶酸5?10mg/L，调环酸|丐1.5?2.0mg/L，秋水仙碱I.5?2.0mg/L，水解蛋白2.0?2.5g/L。
[0013](3)转移诱导培养:
[0014]将步骤(2)得到的愈伤组织转移到第二培养基，温度为27± 10C，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800?2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，愈伤组织诱导出嫩芽后，将嫩芽从雪莲花托外植体上完整地切下，转移到第三培养基内继续以相同的条件培养至形成雪莲幼苗。
[0015]所述第二培养基的组成成分在步骤(2)所述第一培养基基础上添加了吲哚丁酸0.5?2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯1.5?2.0mg/L。
[0016]所述第三培养基的组成成分在所述第二培养基基础上添加了6-苄氨基嘌呤1.5?
2.0mg/Lο
[0017](4)幼苗的驯化与炼苗:
[0018]将雪莲幼苗移栽到炼苗基质中，并逐步转移到外部环境中，在幼苗适应外部环境正常生长后，再移栽至普通土壤中正常培养。
[0019]所述逐步转移到外部环境中的方法为:将雪莲幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中逐天降低温度并逐天增加光照强度，至与外部环境相同时，再培养2?3天即可移栽至普通土壤中，转移过程的周期根据室外环境不同而调节，转移过程的周期持续10?15天。
[0020]所述炼苗基质的组成成分为:珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土以及钙镁磷钾肥，质量比为1:0.5?1.5:0.2?0.8:0.2?0.8:0.1?0.5:0.05?0.15:0.05?0.15:0.005?0.015，优选质量比为1:1:0.5:0.5:0.3:0.1:0.1:0.01。
[0021]本发明涉及的一种雪莲离体培育方法，采用雪莲的花托外植体诱导培养，先采用蓝光照射再采用荧光照射，二者的结合大大缩短了愈伤组织的愈伤分化时间，提高了愈伤组织的形成数量与效率。经离体培养得到的雪莲幼苗，既避免了种子繁殖时发芽时间的不确定性，缩短培育周期，又避免组织培养过程中发生的无性变异，保持雪莲基因的典型性，具有在雪莲人工栽培领域的应用前景。
【具体实施方式】
[0022]下面通过具体实施例，进一步对本发明的技术方案进行具体说明。应该理解，下面的实施例只是作为具体说明，而不限制本发明的范围，同时本领域的技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。
[0023]实施例1
[0024]—种雪莲离体培育方法，具体步骤如下:
[0025](I)花托外植体预处理:
[0026]选取雪莲的花蕾，在4°C环境中冷藏3天后，将花蕾取出自然恢复至室温，剥去苞片和小花，用纯净水冲洗，先在0.05 %的升萊水溶液中消毒5min，再用70 %的酒精消毒30s，之后用无菌水冲洗3次，即得到雪莲花托外植体;以上涉及的百分比均为体积百分比。
[0027](2)外植体接种及诱导培养:
[0028]将雪莲花托外植体移入到灭菌后的第一培养基中，将温度设定为23± TC，以蓝光灯为光源，光照强度控制为600Lx，光周期控制为光14h/暗10h，每十天更换一次培养基，直到诱导出愈伤组织。
[0029]所述第一培养基的组成成分为:KNO3 900mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1000mg/L，KH2PO4 360mg/L,CaCl2.2H20 340mg/L,MgSO4.7H20 190mg/L，EDTA 150mg/L,FeSO4.7H2040mg/L,MnSO4.4H20 60mg/L,ZnSO4.7H20 20mg/L,H3BO3 9mg/L，KI 8mg/L,Na2MoO4.2H203mg/L，CoCl2.6H2O 0.3mg/L，4_碘苯氧乙酸0.18mg/L，肌醇50mg/L，甘氨酸0.8mg/L，维生素BI 0.65mg/L，维生素B6 I.3mg/L，烟酸I.lmg/L，鹿糖40g/L，琼脂 12g/L，激动素KT 0.8mg/L，萘乙酸NAA0.35mg/L，山梨醇60g/L，生物素0.18mg/L，盐酸卩比卩多醇0.8mg/L，盐酸硫胺素0.8mg/L，甲基亚硝基脲1.6mg/L，卩引噪丁酸1.6mg/L，丙氨8mg/L，叶酸8mg/L，调环酸I丐1.7mg/L，秋水仙碱1.8mg/L，水解蛋白2.2g/L。
[0030](3)转移诱导培养:
[0031 ]将步骤(2)得到的愈伤组织转移到第二培养基，温度为27 ± 10C，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800?2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，愈伤组织诱导出嫩芽后，将嫩芽从雪莲花托外植体上完整地切下，转移到第三培养基内继续以相同的条件培养至形成雪莲幼苗；
[0032]所述第二培养基的组成成分在步骤(2)所述第一培养基基础上添加了吲哚丁酸0.5?2.0mg/L和2，4_二氯苯氧乙酸丁酯1.5?2.0mg/L。
[0033]所述第三培养基的组成成分在所述第二培养基基础上添加了6-苄氨基嘌呤1.5?
2.0mg/Lο
[0034](4)幼苗的驯化与炼苗:
[0035]将雪莲幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中每天降低温度1°C，光照强度每天增加300Lx，至与外部环境相同时，再培养2?3天即可移栽至普通土壤中。
[0036]所述炼苗基质的组成成分为:珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土以及钙镁磷钾肥，其质量比为1:1:0.5:0.5:0.3:0.1:0.1:0.01。
[0037]实施例2
[0038]—种雪莲脱毒幼苗的培育方法，具体步骤如下:
[0039](I)花托外植体预处理:选取雪莲的花蕾，在4 °C环境中冷藏3天后，将花蕾取出自然恢复至室温，剥去苞片和小花，用纯净水冲洗，先在0.05%的升汞水溶液中消毒5min，再用70%的酒精消毒20s，之后用无菌水冲洗3次，即得到雪莲花托外植体，以上涉及的百分比均为体积百分比。
[0040](2)外植体接种及诱导培养:将雪莲花托外植体移入到灭菌后的第一培养基中，将温度设定为23 ± TC，以蓝光灯为光源，光照强度控制为400Lx，光周期控制为光14h/暗1h，每十天更换一次培养基，直到诱导出愈伤组织。
[0041 ] 所述第一培养基的组成成分为:KNO3 800mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800mg/L，KH2PO4 300mg/L,CaCl2.2H20 320mg/L,MgSO4.7H20 180mg/L，EDTA 120mg/L,FeS04.7H2030mg/L，MnS04.4H2O 50mg/L，ZnS04.7H2O 15mg/L，H3B03 8mg/L，KI 5mg/L，Na2Mo04.2H2Olmg/L，CoCl2.6H2O 0.2mg/L，4-碘苯氧乙酸0.15mg/L，肌醇30mg/L，甘氨酸0.5mg/L，维生素BI 0.511^凡，维生素136 1.011^凡，烟酸1.011^凡，鹿糖3(^凡，琼脂1(^凡，激动素0 0.5mg/L，萘乙酸NAA0.3mg/L，山梨醇50g/L，生物素0.15mg/L，盐酸卩比卩多醇0.5mg/L，盐酸硫胺素
0.5mg/L，甲基亚硝基脲1.5mg/L，卩引噪丁酸1.5mg/L，丙氨酸5mg/L，叶酸5mg/L，调环酸I丐1.5mg/L，秋水仙碱1.5mg/L，水解蛋白2.0g/L。
[0042](3)转移诱导培养:将步骤(2)得到的愈伤组织转移到第二培养基，温度为27 土 I°C，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，愈伤组织诱导出嫩芽后，将嫩芽从雪莲花托外植体上完整地切下，转移到第三培养基内继续以相同的条件培养至形成雪莲幼苗。
[0043]所述第二培养基的组成成分在步骤(2)所述第一培养基基础上添加了吲哚丁酸
0.5mg/L和2，4_二氯苯氧乙酸丁酯1.5mg/L。所述第三培养基的组成成分在所述第二培养基基础上添加了 6-苄氨基嘌呤1.5mg/L。
[0044](4)幼苗的驯化与炼苗:
[0045]将雪莲幼苗移栽到炼苗基质中，并逐步转移到外部环境中，在幼苗适应外部环境正常生长后，再移栽至普通土壤中正常培养。
[0046]所述逐步转移到外部环境中的方法为:将雪莲幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中每天降低温度1.5°C，光照强度每天增加400Lx，至与外部环境相同时，再培养2天即可移栽至普通土壤中。
[0047]所述炼苗基质的组成成分为:珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土以及钙镁磷钾肥，质量比为1: 0.5:0.2:0.2:0.1:0.05:0.05:0.005 ο
[0048]实施例3
[0049]—种雪莲脱毒幼苗的培育方法，具体步骤如下:
[0050](I)花托外植体预处理:
[0051]选取雪莲的花蕾，在4°C环境中冷藏5天后，将花蕾取出自然恢复至室温，剥去苞片和小花，用纯净水冲洗，先在0.05 %的升萊水溶液中消毒8min，再用70 %的酒精消毒40s，之后用无菌水冲洗3次，即得到雪莲花托外植体。
[0052]以上涉及的百分比均为体积百分比。
[0053](2)外植体接种及诱导培养:
[0054]将雪莲花托外植体移入到灭菌后的第一培养基中，将温度设定为23± TC，以蓝光灯为光源，光照强度控制为800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，每十天更换一次培养基，直到诱导出愈伤组织。
[0055]所述第一培养基的组成成分为:KNO3 1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1200mg/L，KH2PO4 450mg/L,CaCl2.2H20 350mg/L,MgSO4.7H20 240mg/L，EDTA 180mg/L,FeSO4.7H2050mg/L，MnS04.4H2O 80mg/L，ZnS04.7H2O 30mg/L，H3B03 I Omg/L,KI 10mg/L，Na2Mo04.2H2O 5mg/L，CoCl2.6H2O 0.5mg/L，4_碘苯氧乙酸0.20mg/L，肌醇80mg/L，甘氨酸1.0mg/L，维生素BI 0.75mg/L，维生素B6 I.5mg/L，烟酸I.5mg/L，蔗糖50g/L，琼脂15g/L，激动素KT
1.0mg/L，萘乙酸NAA 0.4mg/L，山梨醇70g/L，生物素0.20mg/L，盐酸卩比卩多醇1.0mg/L，盐酸硫胺素I.0mg/L，甲基亚硝基脲2.0mg/L，卩引噪丁酸2.0mg/L，丙氨酸10mg/L，叶酸10mg/L，调环酸钙2.0mg/L，秋水仙碱2.0mg/L，水解蛋白2.5g/L。
[0056](3)转移诱导培养:
[0057]将步骤(2)得到的愈伤组织转移到第二培养基，温度为27± 10C，以荧光灯为光源，光照强度控制为2500Lx，光周期控制为光14h/暗1h，愈伤组织诱导出嫩芽后，将嫩芽从雪莲花托外植体上完整地切下，转移到第三培养基内继续以相同的条件培养至形成雪莲幼苗；
[0058]所述第二培养基的组成成分在步骤(2)所述第一培养基基础上添加了吲哚丁酸
2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯2.0mg/L。
[0059]所述第三培养基的组成成分在所述第二培养基基础上添加了6-苄氨基嘌呤2.0mg/Lο
[0060](4)幼苗的驯化与炼苗:
[0061]将雪莲幼苗移栽到炼苗基质中，并逐步转移到外部环境中，在幼苗适应外部环境正常生长后，再移栽至普通土壤中正常培养。
[0062]所述逐步转移到外部环境中的方法为:将雪莲幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中逐天降低温度并逐天增加光照强度，至与外部环境相同时，再培养3天即可移栽至普通土壤中，转移过程的周期根据室外环境不同而调节，转移过程的周期持续15天。
[0063]所述炼苗基质的组成成分为:珍珠岩100g、輕石150g、锯末80g、松树皮80g、水笞50g、花泥15g、泥炭土 15g以及钙镁磷钾肥1.5g。
【主权项】
1.一种雪莲离体培育方法，其特征在于:具体步骤如下: (1)花托外植体预处理: 选取雪莲的花蕾，在4°C环境中冷藏3?5天后，将花蕾取出自然恢复至室温，剥去苞片和小花，用纯净水冲洗，先在0.05%的升萊水溶液中消毒5?8min，再用70%的酒精消毒20?40s，之后用无菌水冲洗3次，即得到雪莲花托外植体；以上涉及的百分比均为体积百分比； (2)外植体接种及诱导培养: 将雪莲花托外植体移入到灭菌后的第一培养基中，将温度设定为23± 1°C，以蓝光灯为光源，光照强度控制为400?800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，每十天更换一次培养基，直到诱导出愈伤组织； (3)转移诱导培养: 将步骤(2)得到的愈伤组织转移到第二培养基，温度为27 ± TC，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800?2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，愈伤组织诱导出嫩芽后，将嫩芽从雪莲花托外植体上完整地切下，转移到第三培养基内继续以相同的条件培养至形成雪莲幼苗； (4)幼苗的驯化与炼苗: 将雪莲幼苗移栽到炼苗基质中，并逐步转移到外部环境中，在幼苗适应外部环境正常生长后，再移栽至普通土壤中正常培养。2.根据权利要求1所述的一种雪莲离体培育方法，其特征在于:步骤(2)所述第一培养基的组成成分为:KNO3 800?1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800?1200mg/L，KH2PO4 300?450mg/L，CaCl2.2H20 320?350mg/L，MgS04.7H20 180?240mg/L，EDTA 120?180mg/L，FeSO4.7H20 30?50mg/L，MnS04.4H20 50?80mg/L，ZnS04.7H20 15?30mg/L，H3B03 8?.10mg/L，KI 5?10mg/L，Na2Mo04.2H2O I?5mg/L，CoCl2.6H2O 0.2?0.5mg/L，4_鹏苯氧乙酸0.15?0.20mg/L，肌醇30?80mg/L，甘氛酸0.5?1.0mg/L，维生素BI 0.5?0.75mg/L，维生素B6 I.0?I.5mg/L，烟酸I.0?I.5mg/L，蔗糖30?50g/L，琼脂10?15g/L，激动素KT 0.5?I.0mg/L，萘乙酸NAA0.3?0.4mg/L，山梨醇50?70g/L，生物素0.15?0.20mg/L，盐酸卩比口多醇0.5?1.0mg/L，盐酸硫胺素0.5?1.0mg/L,甲基亚硝基脲1.5?2.0mg/L，卩引噪丁酸1.5?.2.0mg/L，丙氨酸5?10mg/L，叶酸5?10mg/L，调环酸|丐1.5?2.0mg/L，秋水仙碱1.5?.2.0mg/L，水解蛋白 2.0?2.5g/L。3.根据权利要求1或2所述的一种雪莲离体培育方法，其特征在于:所述第二培养基的组成成分在步骤(2)所述第一培养基基础上添加了吲哚丁酸0.5?2.0mg/L和2，4-二氯苯氧乙酸丁酯1.5?2.0mg/L; 所述第三培养基的组成成分在所述第二培养基基础上添加了 6-苄氨基嘌呤1.5?.2.0mg/L.4.根据权利要求1所述的一种雪莲离体培育方法，其特征在于:步骤(4)所述逐步转移到外部环境中的方法为:将雪莲幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中逐天降低温度并逐天增加光照强度，至与外部环境相同时，再培养2?3天即可移栽至普通土壤中，转移过程的周期根据室外环境不同而调节，转移过程的周期持续10?15天。5.根据权利要求1所述的一种雪莲离体培育方法，其特征在于:步骤(4)所述炼苗基质的组成成分为:珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土以及钙镁磷钾肥。6.根据权利要求5所述的一种雪莲离体培育方法，其特征在于:所述炼苗基质中，珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土、钙镁磷钾肥的质量比为1: 0.5?1.5:0.2?0.8:.0.2?0.8:0.1?0.5:0.05?0.15:0.05?0.15:0.005?0.015。7.根据权利要求6所述的一种雪莲离体培育方法，其特征在于:所述炼苗基质中，珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土、钙镁磷钾肥的质量比为1:1:0.5:0.5:0.3:0.1:.0.1:0.01.
【文档编号】A01H4/00GK106069766SQ201610493766
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】许建中, 孟剑华, 安剑石
【申请人】无锡南理工科技发展有限公司