带abcb4的转基因斑马鱼系及其建立方法
【专利摘要】本发明公开了一种转基因斑马鱼系及其建立方法，该转基因斑马鱼系是以不改变斑马鱼abcb4基因表达为前提，而通过增强型绿色荧光蛋白（EGFP）监测abcb4基因表达变化情况的转基因斑马鱼系。即该转基因斑马鱼系是以abcb4基因启动子来驱动EGFP表达的Tg(abcb4:EGFP)转基因斑马鱼系。本发明建立一个以不改变斑马鱼abcb4基因（同源于人类ABCB1基因）表达为前提，而通过增强型绿色荧光蛋白（EGFP）监测abcb4基因表达变化情况的转基因斑马鱼系。即以abcb4基因启动子来驱动EGFP表达的Tg(abcb4:EGFP)转基因斑马鱼系。为接下来的abcb4基因在多药耐药机制研究提供前期实验基础。
【专利说明】
带abcb4的转基因斑马鱼系及其建立方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种转基因斑马鱼系及其建立方法，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 多药耐药(multidrug-resistance，MDR)是肿瘤化疗失败的常见原因，然而对于目 前来说，化疗依旧癌症治疗的主要方法。故在判断癌症预后和存活率上，多药耐药的是否产 生成为了重要的指标。而多药耐药的定义是指，对于结构及药理不同的多种药物，肿瘤同时 产生了耐药。多药耐药产生的机制有多种，传统的观点认为是因为肿瘤中的某些细胞发生 了基因突变而导致的，但是一些病理生理因素，如缺氧、调控癌基因、肿瘤抑制基因、细胞凋 亡因子的变化也都可能促进对多药耐药的发生。然而，由ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白家族所介导的细胞药物外排作用，才是多药耐药产生的主要机制。
[0003] ABCB1作为ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运体成员之一，在生理状态 下，主要参与内、外源物质和毒素的吸收、分布、排泄等，对组织器官起保护和防御作用，其 主要分布于哺乳动物的上皮细胞表面顶层，包括结肠、小肠、胰腺、胆管、胆汁、肾脏近端小 管、肾上腺等。它还分布在血脑屏障(bloodbrain barrier，BBB)的内皮细胞，可将内皮细胞 的毒素和药物排泄到血管腔中，从而保护脑组织。
[0004] 大量研究显示，ABCB1的高表达在产生多药耐药的肿瘤细胞中普遍存在，尤其是在 血液系统肿瘤和实体肿瘤中。检测患者肿瘤细胞中ABCB1的mRNA表达水平，发现易发生多药 耐药的患者中，其ABCB1的mRNA表达水平都较高于其他患者。并且大量体外肿瘤耐药细胞株 中的研究表明，ABCB1基因以及其编码的蛋白在肿瘤耐药细胞中都有明显升高，在多药耐药 中起着关键作用。
[0005] 斑马鱼ABCD4基因启动子及其预测和克隆方法同样为ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运体成员之一，斑马鱼AB⑶4基因启动子及其预测和克隆方法基因位于人 类第7号染色体上。肝细胞对于各种化合物的外排，主要是由ABC转运体蛋白介导转运作用。 而斑马鱼ABCD4基因启动子及其预测和克隆方法存在于人类的肝脏的肝细胞的小管膜上， 同样通过水解ATP获得能量，将磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)透过肝小叶胆管 膜，转运进入胆汁并与胆汁酸形成微胶粒，从而能保护胆管不受胆汁酸所引起的损害，在正 常胆汁中有着重要作用。
[0006] 在研究肿瘤多药耐药机制的同时，如何克服肿瘤多药耐药的问题一直是广大学者 广泛关注的问题。尤其是在药物开发的过程中，如何预见抗肿瘤药物的多药耐药性形成的 可能性?故用ABCB1作为多药耐药筛选的靶点进行药物耐药性的初筛研究已成热点。如在肿 瘤细胞株中过度表达ABCB1，使该细胞株作为抗肿瘤药物筛选的靶点判断其疗效，以及在体 外肿瘤细胞株中，研究针对ABCB1及其相关ABC转运蛋白的抑制剂来克服肿瘤多药耐药。后 者目前已批准进行临床研究，其临床应用效果尚不令人满意。
[0007] 动物模型研究中，早在1994年荷兰肿瘤研究所的Schinkel等就建立了Abcbla基因 (同源于人类ABCB1基因）等位基因缺失的小鼠。通过该小鼠与正常小鼠的比较发现，P-gp大 量的分布于血脑屏障（b 1 oodbrain barri er，BBB);同时，该小鼠许多组织中的药物浓度明 显增高，尤其是脑部组织。且药物自身清除率也明显降低。而关于P-gp在Abcbla(-/_)小鼠 中的研究，至今依旧备受关注。并且针对的ABCB1(或P-gp)抑制剂的研发，也小鼠上也有所 进行。而斑马鱼abcd4基因启动子及其预测和克隆方法基因（同源于人类斑马鱼AB⑶4基因 启动子及其预测和克隆方法基因）等位基因缺失的小鼠，也在1993年被Smit等建立，通过该 小鼠与正常小鼠的比较发现，这种小鼠不能分泌卵磷脂进人胆汁。而至今斑马鱼abcd4基因 启动子及其预测和克隆方法(-/_)小鼠模型依旧作为研究肝脏、胰腺肿瘤发生、进展中相关 的致癌因素的工具同样也备受关注。
[0008] 然而，目前已开展的研究仍存在诸多局限性。肿瘤细胞株的体外研究相对于体内 并不系统，不能系统性的反应ABCB1基因体内多药耐药中的作用，以致肿瘤药物多药耐药筛 选的片面性。而使用小鼠类哺乳动物建模由于动物生长周期长，无法连续和有效地示踪沾 染基因的表达和细胞的分化发育过程，同样为Abcbla基因在肿瘤药物多药耐药筛选中带来 很大的困难。所以在肿瘤药物多药耐药的筛选过程中，尚缺乏有效的高通量、活体的动物筛 选模型，故建立一个有效的、高通量的、活体的、多药耐药筛选动物模型，是一项具有创新性 的研究工作，不但可深入系统地开展了ABCB1基因及其编码蛋白ABCB1 (或P-gp)的功能研 究，同时对于寻找针对多药耐药的靶向方法和药物，开发出选择性高，毒副作用小并不易发 生多药耐药的抗癌新药提供重要的活体高通量筛选模型，具有重要的科学价值和巨大的应 用前景。
[0009] 斑马鱼（zebrafish)是近年来新兴的"四维"模式生物，其为原产于印度的硬骨鱼 类。在高通量、小分子筛查中体现出来了体积小、易吸收和相对经济等优点，且繁殖力强(每 周可产胚胎200枚左右）、生长发育快(2个月就可成年），这是其他实验动物所不具备的。斑 马鱼在转基因筛、基因敲除、基因突变中也体现出了特定的优势，是研究脊椎动物发育机制 及其基因功能的理想模式生物。斑马鱼在进化过程中，发育与同其他脊椎动物一样高度保 守，是目前生物发育学研究中重要的模式生物。同时，斑马鱼作为新兴的模式生物，它的全 基因组测序工作已经完成，其具有与人类高度保守的发育和疾病基因及信号传导通路，是 研究人类发育和疾病信号传导路径及活体内进行高通量先导药物筛选的最佳模式生物之 〇
[0010] 斑马鱼自上世纪末开始逐渐成为生命科学研究的优势实验模式生物。近年来，斑 马鱼的应用和研究进展尤为迅速。目前许多斑马鱼疾病模型已经建立，涉及心脏疾病、白血 病以及多器官肿瘤包括黑色素瘤、胰腺癌、肝癌和结肠癌等。这些疾病模型能够帮助研究者 深入系统地研究各类疾病发生发展的机制和干预手段，目前这类研究成果层出不穷，被公 认为生命科学领域热门的研究工具。
[0011]生物信息学分析证实斑马鱼中不存在abcbl基因，但与人类ABCB1基因具有同源性 的斑马鱼abcd4基因启动子及其预测和克隆方法、abcb5基因及其相关基因的研究却有所报 道。根据国外文献报道，斑马鱼斑马鱼abcd4基因启动子及其预测和克隆方法在鱼体内中与 多种有毒化合物转运密切相关，且参与阻碍化学物质的吸收。而人类斑马鱼ABCD4基因启动 子及其预测和克隆方法同样为ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运体成员之一， 斑马鱼ABCD4基因启动子及其预测和克隆方法编码基因位于人类第7号染色体上。肝细胞对 于各种化合物的外排，主要是由ABC转运体蛋白介导转运作用。而斑马鱼ABCD4基因启动子 及其预测和克隆方法存在于人类的肝脏的肝细胞的小管膜上，同样通过水解ATP获得能量， 将磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)透过肝小叶胆管膜，转运进入胆汁并与胆汁酸 形成微胶粒，从而能保护胆管不受胆汁酸所引起的损害，在正常胆汁中有着重要作用。但在 斑马鱼中目前并没有检测到磷脂酰胆碱或者胆汁，故相较于人类斑马鱼ABCD4基因启动子 及其预测和克隆方法，斑马鱼斑马鱼abcd4基因启动子及其预测和克隆方法的功能可能更 近似于ABCB1且不同于斑马鱼AB⑶4基因启动子及其预测和克隆方法。而对于abcb5基因来 说，硝苯地平、克霉唑、大黄素等药物也能诱导abcb5基因的mRNA和蛋白质表达水平增高。但 是在长春新碱、长春花碱、麝香以及菲等药物和化合物的研究中，斑马鱼abcd4基因启动子 及其预测和克隆方法作为对抗化学毒物的细胞毒物转运体而被报道。其中提到通过抑制物 和Morpho 1 ino下调斑马鱼的斑马鱼abcd4基因启动子及其预测和克隆方法基因，可以增加 荧光底物在胚胎组织中的累积量和对有毒化合物的敏感性，但是相比abcb5基因却不存在 这种影响。所以斑马鱼abcd4基因启动子及其预测和克隆方法、abcb5基因在斑马鱼多药耐 药机制中的所起的作用尚不完全清楚。且基于多药耐药研究的斑马鱼abcd4基因启动子及 其预测和克隆方法转基因斑马鱼动物模型尚未有建立。
【发明内容】
[0012] 本发明要解决的主要技术问题是提供一种带abcb4的转基因斑马鱼系及其建立方 法，通过预测、克隆斑马鱼abcd4基因启动子，并构建出转基因斑马鱼系，从而建立一种可以 用于评估肿瘤药物耐药性的动物模型。
[0013] 本发明的技术方案包括以下内容： 首先，进行斑马鱼abcb4基因启动子预测及克隆，并进行斑马鱼abcb4基因启动子测效 后，建立Tg(abcb4:EGFP)转基因斑马鱼并对其进行鉴定，从而获得一种能够用于评估抗肿 瘤药物耐药性的动物模型。
[0014] 具体的，本发明的转基因斑马鱼系是这样的：该转基因斑马鱼系是以不改变斑马 鱼abcb4基因表达前提，而通过增强型绿色荧光蛋白（EGFP)监测abcb4基因表达变化情况的 转基因斑马鱼系。该转基因斑马鱼系是以abcb4基因启动子来驱动EGFP表达的Tg(abcb4: EGFP)转基因斑马鱼系。
[0015] 该转基因斑马鱼系的建立方法，包括如下步骤： 步骤1:带abcb4基因启动子的T〇12重组质粒的构建； 步骤2: To 12转座酶mRNA体外转录； 步骤3:将转座子T〇12体系，进行胚胎显微注射。
[0016] 其中，步骤1中abcb4基因启动子Τ〇12重组质粒构建按照以下步骤进行： (1) 通过氯化钙法，将E.coli DH5a制备感受态菌； (2) 通过转化方式，向E.coli DH5a感受态菌内转入7WJ?质粒，并经氨苄青霉素抗性药 物筛选，挑选阳性克隆； (3) 选取氨节青霉素抗性阳性的单克隆，移至3ml加有氨节青霉素的LB液体培养基中， 置于恒温摇床上，190rpm，37°C振荡培养10~14小时； (4) 取出过夜培养的菌液，通过Axygen质粒小抽试剂盒，取提扩增的质粒DNA; (5) 将EGFP基因 PCR片段以及提取得到的粒分别进行Mel以及feoR访双酶切； (6) 酶切完毕后，将酶切过的EGFP基因 PCR片段以及提取得到的rWJ?质粒进行割胶回 收； (7) 将回收的经Mel以及价〇政双酶切的EGFP基因 PCR片段以及提取得到的7WJ?质 粒，通过T4连接酶进行连接，25 °C连接过夜； (8) 将连接产物通过转化的方式转入E.coli DH5a感受态菌中，并经氨苄青霉素抗性 药物筛选，挑选阳性克隆;菌落扩增后运用Axgen质粒小抽试剂盒提取质粒DNA; (9) 7b以-及重组质粒的鉴定： (10) 通过转化方式，向E.coli DH5a感受态菌内转入鉴定正确的7b以-五质粒，并经 氨苄青霉素抗性药物筛选，挑选阳性克隆； (11) 选取氨节青霉素抗性阳性的单克隆，移至3ml加有氨节青霉素的LB液体培养基 中，置于恒温摇床上，190rpm，37°C振荡培养10~14小时； (12) 取出过夜培养的菌液，通过Axygen质粒小抽试剂盒，提取扩增的孤逆质粒； (13) 将akM基因启动子PCR产物以及提取得到的TbM-及;质粒分别进行处〇1以及 A*el双酶切； (14) 酶切完毕后，将酶切过的akM基因启动子PCR产物以及提取得到的五G/y质 粒进行割胶回收； (15) 将回收的经处〇1以及A*el双酶切的akM基因启动子PCR产物以及提取得到的 TbM-及;质粒，通过T4连接酶进行连接，25°C连接过夜； (16) 将连接产物通过转化的方式转入E.coli DH5a感受态菌中，并经氨苄青霉素抗性 药物筛选，挑选阳性克隆。菌落扩增后运用Axgen质粒小抽试剂盒提取质粒DNA; (17) 7b以重组质粒的鉴定。
[0017] 其中，步骤2中Tol2转座酶mRNA体外转录按照以下步骤进行： (1) 将组质粒经Notl单酶切后线性化质粒DNA，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，再 割胶回收线性化后的质粒DNA; (2) 将线性化/7CS-TP质粒作为模板，使用Sp6聚合酶进行体外转录，经2小时，37 °C反应 后，得到Tol2转座酶mRNA; (3) 经NucAway? Spin Columns纯化吸附柱回收mRNA后，经2%琼脂糖凝胶电泳进行定 性分析，以及经One Drop仪器进行定量分析，将分装mRNA后于-70°C保存。
[0018] 其中，步骤3中转座子T〇12系统胚胎显微注射按照以下步骤进行： (1) 将7b以-akM.·抓重组质粒DNA及To 12转座酶mRNA进行纯化和混合，冰上待用； (2) 选取发育正常的野生型斑马鱼单细胞期胚胎，置于琼脂糖凝胶注射板上； (3) 将摆放完毕的斑马鱼胚胎置于体视显微镜下，显微注射针吸取混合溶液约2μ1; (4) 通过显微注射仪，向斑马鱼单细胞期胚胎的细胞中，以每枚胚胎约0.005 μL注入 7b以沪/重组质粒DNA及To 12转座酶mRNA混合溶液； (5) 将注射完毕的斑马鱼胚胎进行饲养，待以后实验所用。
[0019] 本发明建立一个以不改变斑马鱼abcb4基因（同源于人类ABCB1基因）表达为前提， 而通过增强型绿色荧光蛋白（EGFP)监测abcb4基因表达变化情况的转基因斑马鱼系。即以 abcb4基因启动子来驱动EGFP表达的Tg(abcb4:EGFP)转基因斑马鱼系。为接下来的abcb4基 因在多药耐药机制研究提供前期实验基础。同时也解决了目前已开展的研究仍存在诸多局 限性。如肿瘤细胞株的体外研究相对于体内并不系统，不能系统性的反应ABCB1基因体内多 药耐药中的作用，以致肿瘤药物多药耐药筛选的片面性。而使用小鼠类模式动物建模，存在 动物生长周期长，无法连续和有效地示踪转染基因的表达和细胞的分化发育过程等缺陷。
【附图说明】 [0020] 图1是Tol2(abcb4-EGFP)重组质粒图； 图2是转基因斑马鱼(fi游切6bcb4:EGFP)荧光表现示意图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0022] 实施例1: 1斑马鱼基因启动子预测及克隆 1.1斑马鱼基因启动子预测 根据NCBI网站，通过生物信息学分析，将斑马鱼基因转录起始位点至上游adaml5 基因之间约8000bp左右的基因序列作为模板，经Promoter 2.0 Prediction Server启动子 预测网站，进行启动子范围预测。
[0023] 1.2斑马鱼基因启动子克隆 (1) 选取5dpf斑马鱼胚胎约20~30枚，放入RNAse-Free的1 · 5ml Epp管中，1 Xros溶液 清洗胚胎； (2) 清洗完毕后，加入500μ1 Lysis Buffer(其中含有蛋白酶K，终浓度为0.17mg/ml)， 密封后55 °C水浴消化1小时； (3) 室温14000rpm离心10分钟，取上清至新的RNAse-Free 1.5ml Epp管中； (4) 向上述Epp管中加入500μ1酚/氯仿混合液（1:1)，剧烈震荡15秒，室温14000rpm离 心10分钟； (5) 取上清，移至新的RNAse-Free的1.5ml Epp管中，加入冰上预冷的900μ1 75%乙醇+ 1〇〇μ1醋酸钠(浓度3Μ，ΡΗ6.0)，轻柔混匀，冰上放置10分钟，14000rpm，4°C离心30分钟； (6) 弃上清，加入lml冰上预冷的70%乙醇，洗涤沉淀后，7500rpm，4°C离心5分钟，此步 骤重复两遍； (7) 弃上清，室温干燥20分钟后，加50μ1 DEPC水，密封后于55 °C水浴10分钟，助沉淀溶 解； (8) 取ΙμL基因组DNA样品，通过1%琼脂糖凝胶电泳，检测所提取DNA片段大小情况。检 测完毕后于_70°C冰箱保存。
[0024] (9)根据预测范围，并加 入处〇1、油61酶切位点以及保护碱基序列通过Primer Premier 6.0软件设计特异性引物，并由北京奥维森基因科技有限公司合成。序列如下:F: 5'- CCGCTCGAGGGCCTGGAAACATTTCTTC-3' R: 5 '-CTAGCTAGCTTGCTGTTATCTCAGATGCT-3' (1 〇)以提取的斑马鱼基因组DNA为模板，进行基因启动子PCR扩增。条件如下:94 °C预变性2min;94°C变性158、60°(：退火3〇8、68°(：延伸1111丨11共35次循环；最后延伸68 1€ 1 Omin。PCR产物大小约为1532bp，1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
[0025] 2斑马鱼akM基因启动子测效 2.1 组质粒构建 (1) 通过氯化钙法，将E.coli DH5a制备感受态菌； (2) 通过转化方式，向E.coli DH5a感受态菌内转入质粒，并经氨苄青霉素 抗性药物筛选，挑选阳性克隆。转化方式如下： 1) 于-70°C冰箱中，取装有200μ1 E.coli DH5a感受态菌的〇.6ml Epp管，置于冰上融 化12分钟； 2) 待融化过后，向E.coli DH5a感受态菌中，加入〇.5μ1 质粒，并吹吸混 匀，置于冰上30分钟； 3) 冰上30分钟结束后，将Epp管密封置于42°C水浴箱中，热激90秒后，立即插入冰中5 分钟； 4) 向Epp管中加入300μ1无抗性LB液体培养基，置于恒温摇床上，160rpm，37°C温育45 分钟； 5) 充分混匀后，通过划线接种的方式，将E.coli DH5a感受态菌涂于加有氨苄青霉素 的LB固体培养基平板中； 6) 正放5分钟后，37 °C倒置培养过夜； (3) 选取氨节青霉素抗性阳性的单克隆，移至3ml加有氨节青霉素的LB液体培养基中， 置于恒温摇床上，190rpm，37°C振荡培养10~14小时； (4) 取出过夜培养的菌液，通过Axygen质粒小抽试剂盒，提取扩增的质粒DNA。方 法如下： 1) 取3ml菌液至1.5ml Epp管中，12000rpm离心1分钟； 2) 弃上层清液，加入250μ1经RNase A处理过的Buffer S1重悬； 3) 充分重悬完毕后，立即加入250μ1 Buffer S2,上下温和翻转4~6次； 4) 待溶液透亮后，加入350μ1 Buffer S3,同样上下温和翻转6~8次后，12000rpm离心 15分钟； 5) 吸取上层清液，移至套上回收管的DNA制备管中，12000rpm离心1分钟； 6) 弃掉废液，并加入500μ1 Buffer Wl，12000rpm离心1分钟； 7) 弃掉废液，并加入700μ1 Buffer W2，12000rpm离心1分钟;此步骤重复两次； 8) 弃掉废液后，12000rpm空甩离心1分钟； 9) 将回收管换为新的1.5ml Epp管，在DNA制备管的膜中央加入50μ1 DEPC水，静止2分 钟后，12000rpm离心1分钟； 10) 弃制备管，从Epp管中吸取lyl提取产物，经One Drop进行定量，并用1%琼脂糖凝胶 进行电泳鉴定； (5) 将akM基因启动子PCR产物以及提取得到的质粒分别进行A*el以及 觅〇1双酶切； (6) 酶切完毕后，将酶切过的akM基因启动子PCR产物以及提取得到的 粒进行割胶回收，具体方法同前； (7) 将回收的经以及ΙΑοΙ双酶切的akM基因启动子PCR产物以及提取得到的 质粒，通过T4连接酶进行连接，25°C连接过夜； (8) 将连接产物通过转化的方式转入E.coli DH5a感受态菌中，并经氨苄青霉素抗性 药物筛选，挑选阳性克隆。菌落扩增后运用Axgen质粒小抽试剂盒提取质粒DNA，具体方法同 、r ' 刖； (9) 组质粒的鉴定： 1) 经油61以及觅〇1双酶切冰HakM/重组质粒，进行酶切鉴定，并通过1%的琼脂糖 凝胶电泳鉴定目的DNA片段大小是否正确； 2) 将重组质粒送至北京奥维森基因科技有限公司进行序列测定鉴定。 [0026] 2.2 K562细胞脂质体转染重组质粒 使用Gibco ? RPMI 1640培养基(其含有10%胎牛血清)对K562细胞于5%C02、37°C、饱和 湿度的条件下进行细胞培养。细胞于培养基中悬浮生长，选取对数生长期细胞用于实验。
[0027] (1)取Lipofectamine? 2000 Reagent 10μ1 加至Opti-MEM? Medium 100μΙ中混 匀。
[0028] (2)取两组质粒（即和你质粒组、你质粒 组）各lyg(每种质粒500ng)分别加入50μ1 Opti-MEM? Medium中混勾。
[0029] (3)取步骤（1)中混匀试剂各50μ1，分别与步骤2中两混匀组各50μ1混合，混匀并 室温孵育5min。
[0030] (4)将K562细胞以800rpm/min离心后，用Opti-MEM? Medium重悬。重悬充分后以 每孔2 X 105个细胞接种于24孔板中。两质粒组，每组5孔。
[0031] (5)将步骤3中孵育液在25min内分别加入步骤4中对应孔内，每孔加入孵育液100 μL。保证每孔每种质粒终量约为500ng，Lipofectamine? 2000 Reagent每孔终量约为1 ·0~ 2·5μ1。轻轻摇匀后，置于37°C，5%C02中培养4~6h。之后每孔各补Opti-MEM? Medium 500μ 1，继续放置于37°C，5 %C02中培养3天。3天后进行akM基因启动子测效分析。（注:培养体 系中未加双抗，不影响实验结果。） 2.3转染后K562细胞荧光素酶活性测定 (1) 将24孔板中质粒转染的两组K562细胞，及正常培养的K562细胞从恒温孵箱中取 出，各吸取至无菌25ml离心管中，以800rpm/min离心后使用1 XPBS溶液清洗细胞，2次； (2) 各加入Gibco? RPMI 1640 Medium重悬，重悬充分后以75μ1加入不透光的96孔板 中，每孔每组细胞终量约1 X 1〇4个细胞； (3) 向每孔中加入75μ1 Dual-Glo? Luciferase Reagent，充分混勾； (4) 待25°C孵育1.5小时，让细胞充分裂解后，在BioTek Synergy2多功能酶标仪中测 量萤火虫萤光； (5) 向每孔中加入75μ1 Dual-Glo? Stop & Glo? Reagent，充分混勾； (6) 25°C孵育1.5小时后，在BioTek Synergy2多功能酶标仪中测量海肾萤光； (7) 样品数据通过Gen5软件进行处理，计算公式为： 3 转基因斑马鱼的建立
3.1 akM基因启动子组质粒构建 (1) 通过氯化钙法，将E.coli DH5a制备感受态菌； (2) 通过转化方式，向E.coli DH5a感受态菌内转入7WJ?质粒，并经氨苄青霉素抗性药 物筛选，挑选阳性克隆。转化方式如下： 1) 于-70°C冰箱中，取装有200μ1 E.coli DH5a感受态菌的〇.6ml Epp管，置于冰上融 化12分钟； 2) 待融化过后，向E.coli DH5a感受态菌中，加入〇.5μ1 质粒，并吹吸混匀，置于 冰上30分钟； 3) 冰上30分钟结束后，将Epp管密封置于42°C水浴箱中，热激90秒后，立即插入冰中5 分钟； 4) 向Epp管中加入300μ1无抗性LB液体培养基，置于恒温摇床上，160rpm，37°C温育45 分钟； 5) 充分混匀后，通过划线接种的方式，将E.coli DH5a感受态菌涂于加有氨苄青霉素 的LB固体培养基平板中； 6) 正放5分钟后，37 °C倒置培养过夜； (3) 选取氨节青霉素抗性阳性的单克隆，移至3ml加有氨节青霉素的LB液体培养基中， 置于恒温摇床上，190rpm，37°C振荡培养10~14小时； (4) 取出过夜培养的菌液，通过Axygen质粒小抽试剂盒，取提扩增的质粒DNA。方 法如下： 1) 取3ml菌液至1.5ml Epp管中，12000rpm离心1分钟； 2) 弃上层清液，加入250μ1经RNase A处理过的Buffer S1重悬； 3) 充分重悬完毕后，立即加入250μ1 Buffer S2,上下温和翻转4~6次； 4) 待溶液透亮后，加入350μ1 Buffer S3,同样上下温和翻转6~8次后，12000rpm离心 15分钟； 5) 吸取上层清液，移至套上回收管的DNA制备管中，12000rpm离心1分钟； 6) 弃掉废液，并加入500μ1 Buffer Wl，12000rpm离心1分钟； 7) 弃掉废液，并加入700μ1 Buffer W2，12000rpm离心1分钟;此步骤重复两次； 8) 弃掉废液后，12000rpm空甩离心1分钟； 9) 将回收管换为新的1.5ml Epp管，在DNA制备管的膜中央加入50μ1 DEPC水，静止2分 钟后，12000rpm离心1分钟； 10) 弃制备管，从Epp管中吸取lyl提取产物，经One Drop进行定量，并用1%琼脂糖凝胶 进行电泳鉴定； (5) 将EGFP基因 PCR片段以及提取得到的7WJ?质粒分别进行Mel以及双酶切； (6) 酶切完毕后，将酶切过的EGFP基因 PCR片段以及提取得到的rWJ?质粒进行割胶回 收，具体方法同前； (7) 将回收的经Mel以及价〇R贫双酶切的EGFP基因 PCR片段以及提取得到的7WJ?质 粒，通过T4连接酶进行连接，25 °C连接过夜； (8) 将连接产物通过转化的方式转入E.coli DH5a感受态菌中，并经氨苄青霉素抗性 药物筛选，挑选阳性克隆。菌落扩增后运用Axgen质粒小抽试剂盒提取质粒DNA，具体方法同 、r ' 刖； (9) 7b以-及重组质粒的鉴定： 1) 经崩^1以及及双酶切及沪/重组质粒，进行酶切鉴定，并通过1%的琼脂糖 凝胶电泳鉴定目的DNA片段大小是否正确； 2) 将7b^?_及重组质粒送至北京奥维森基因科技有限公司进行序列测定鉴定。
[0032] (10)通过转化方式，向E.coli DH5a感受态菌内转入鉴定正确的7b以-五质粒， 并经氨苄青霉素抗性药物筛选，挑选阳性克隆； (11) 选取氨节青霉素抗性阳性的单克隆，移至3ml加有氨节青霉素的LB液体培养基 中，置于恒温摇床上，190rpm，37°C振荡培养10~14小时； (12) 取出过夜培养的菌液，通过Axygen质粒小抽试剂盒，提取扩增的7WJ?-孤逆质粒； (13) 将akM基因启动子PCR产物以及提取得到的TbM-及;质粒分别进行处〇1以及 A*el双酶切； (14) 酶切完毕后，将酶切过的akM基因启动子PCR产物以及提取得到的7b^?_五G/y质 粒进行割胶回收，具体方法同前； (15) 将回收的经处〇1以及A*el双酶切的akM基因启动子PCR产物以及提取得到的 TbM-及;质粒，通过T4连接酶进行连接，25°C连接过夜； (16) 将连接产物通过转化的方式转入E.coli DH5a感受态菌中，并经氨苄青霉素抗性 药物筛选，挑选阳性克隆。菌落扩增后运用Axgen质粒小抽试剂盒提取质粒DNA，具体方法同 、r ' 刖； (17) 7b以重组质粒的鉴定： 1) 经处〇1以及Mel双酶切7b以-akM;及沢重组质粒，进行酶切鉴定，并通过1%的琼 脂糖凝胶电泳鉴定目的DNA片段大小是否正确； 2) 将及沪/重组质粒送至北京奥维森基因科技有限公司进行序列测定鉴 定。
[0033] 3.2 To 12转座酶mRNA体外转录 (1) 将/76^-77?组质粒经Notl单酶切后线性化质粒DNA，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，再 割胶回收线性化后的质粒DNA; (2) 将线性化/7CS-TP质粒作为模板，使用Sp6聚合酶进行体外转录，经2小时，37 °C反应 后，得到Tol2转座酶mRNA; (3) 经NucAway? Spin Columns纯化吸附柱回收mRNA后，经2%琼脂糖凝胶电泳进行定 性分析，以及经One Drop仪器进行定量分析，将分装mRNA后于-70°C保存。
[0034] 3.3转座子Tol2系统胚胎显微注射 (1) 将7^2-3/^1孤/;7重组质粒0嫩及1'〇12转座酶1111?嫩进行纯化和混合。混合后两者 终浓度均为250ng/yl，冰上待用； (2) 选取发育正常的野生型斑马鱼单细胞期胚胎，置于琼脂糖凝胶注射板上； (3) 将摆放完毕的斑马鱼胚胎置于体视显微镜下，显微注射针吸取混合溶液约2μ1; (4) 通过显微注射仪，向斑马鱼单细胞期胚胎的细胞中，以每枚胚胎约0.005 μL注入 7b以沪/重组质粒DNA及To 12转座酶mRNA混合溶液； (5) 将注射完毕的斑马鱼胚胎进行饲养，待以后实验所用。
[0035] 4 转基因斑马鱼的鉴定 4.1 转基因斑马鱼荧光表达及基因组测序鉴定 (1)收集显微注射完毕后的胚胎，通过荧光显微镜选取存在绿色荧光信号的胚胎进行 饲养。将其定为及沪朽转基因斑马鱼Fo代。
[0036] (2)随后将Fo代的成鱼与野生型斑马鱼成鱼进行交配，产出h代斑马鱼胚胎，选取 存在正确绿色荧光信号的Fi代胚胎提取基因组DNA，根据akM.·及转基因特定序列，经 Primer Premier 6.0软件设计引物，进行PCR鉴定： F: 5'-GGCCTGGAAACATTTCTTC-3' ，R: 5'-GTCCATGCCGAGAGTGAT-3' PCR扩增条件：94°C预变性2min;94°C变性15s、60°C退火30s、68°C延伸lmin共35次循 环;最后延伸68°C lOmiruPCR产物大小为约为2260bp，1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
[0037] (3)再将基因组鉴定正确的FHf胚胎进行饲养，待为成鱼后与野生型斑马鱼成鱼 进行交配，通过胚胎绿色荧光情况，筛选出产出h代纯合子。
[0038] (4)通过Fi代纯合子自交的方式，产出F2代纯合子胚胎，选取存在正确荧光信号的 F2代进行同样基因组鉴定工作。
[0039] (5)再将基因组鉴定正确的^代纯合子胚胎进行饲养，待为成鱼后进行交配，产 出F3代纯合子胚胎，选取存在正确荧光信号的F 3代纯合子胚胎进行同样基因组鉴定。
[0040] 4.2 身专基因斑马鱼功能性初步鉴定 在体式显微镜下，挑选发育正常的rgfakM.·及;7史」转基因斑马鱼纯合子4~8个细胞期 阶段的受精卵胚胎，于6孔培养板中进行川你〇2阿霉素药物处理，每孔20枚，28°C恒温保 存，暴露时间为120小时。
[0041 ] 收集药物处理中48、72、96、120小时四个时相的斑马鱼胚胎，对绿色荧光表达变化 进行初步鉴定及评估。为确保实验准确，相同实验条件下重复3次。
[0042]当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同 替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种带abcb4的转基因斑马鱼系，其特征在于:该转基因斑马鱼系是w不改变斑马鱼 abcb4基因表达为前提，而通过增强型绿色巧光蛋白（EGFP)监测abcb4基因表达变化情况的 转基因斑马鱼系。2. 根据权利要求1所述的带abcb4的转基因斑马鱼系，其特征在于：该转基因斑马鱼系 是W abcb4基因启动子来驱动EGFP表达的Z化(怎份甲)转基因斑马鱼系。3. -种如权利要求1或2所述的带abcb4的转基因斑马鱼系的建立方法，其特征在于包 括如下步骤： 步骤1:含abcb4基因启动子的To 12重组质粒的构建； 步骤2: To 12转座酶mRNA体外转录； 步骤3:将转座子Το12转基因体系，进行胚胎显微注射。4. 根据权利要求3所述的带abcb4的转基因斑马鱼系的建立方法，其特征在于:步骤1中 abcb4基因启动子Το12重组质粒构建按照W下步骤进行： (1) 通过氯化巧法，将大肠杆菌D册α制备为感受态菌； (2) 通过转化方式，向大肠杆菌D册α感受态菌内转入7b质粒，并经氨节青霉素药物 抗性筛选，挑选阳性克隆； (3) 选取氨节青霉素抗性阳性的单克隆，移至3ml加有氨节青霉素的LB液体培养基中， 置于恒溫摇床上，190巧m，37°C振荡培养10~14小时； (4) 取出过夜培养的菌液，通过Axygen质粒小抽试剂盒，取提扩增的jOC*妙质粒DNA; (5) 将EGFP基因 PCR片段W及提取得到的7b公质粒分别进行^61 W及仿〇帖双酶切； (6) 酶切完毕后，将酶切过的EGFP基因 PCR片段W及提取得到的7WJ?质粒进行割胶回 收； (7) 将回收的经励el W及怎CO晚双酶切的EGFP基因 PCR片段W及提取得到的7WJ?质粒， 通过T4连接酶进行连接，25°C连接过夜； (8) 将连接产物通过转化的方式转入E.coli DH5a感受态菌中，并经氨节青霉素抗性 药物筛选，挑选阳性克隆;菌落扩增后运用Axgen质粒小抽试剂盒提取质粒DNA; (9) 7b公寸佛7垂组质粒的鉴定： (10) 通过转化方式，向E.coli D册α感受态菌内转入鉴定正确的風并7顿粒，并经 氨节青霉素抗性药物筛选，挑选阳性克隆； (11) 选取氨节青霉素抗性阳性的单克隆，移至3ml加有氨节青霉素的LB液体培养基 中，置于恒溫摇床上，190巧m，37°C振荡培养10~14小时； (12) 取出过夜培养的菌液，通过Axygen质粒小抽试剂盒，提取扩增的7b公寸佛7顿粒； (13) 将基因启动子PCR产物W及提取得到的7^^?-凤?巧颇粒分别进行姐olW及 Mel双酶切； (14) 酶切完毕后，将酶切过的基因启动子PCR产物W及提取得到的7b風并7顿 粒进行割胶回收； (15) 将回收的经逊〇1 W及励el双酶切的a基因启动子PCR产物W及提取得到的 7b公寸脚7顿粒，通过T4连接酶进行连接，25°C连接过夜； (16) 将连接产物通过转化的方式转入E.coli DH5a感受态菌中，并经氨节青霉素抗性 药物筛选，挑选阳性克隆； 菌落扩增后运用Axgen质粒小抽试剂盒提取质粒DNA; (17) 7b公-a6cM.·娜巧垂组质粒的鉴定。5. 根据权利要求3所述的带abcb4的转基因斑马鱼系的建立方法，其特征在于:步骤2中 Το12转座酶mRNA体外转录按照W下步骤进行： (1) 将/7仪-77垂组质粒经Notl单酶切后线性化质粒DNA，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，再 割胶回收线性化后的质粒DNA; (2) 将线性化/7CS-W质粒作为模板，使用Sp6聚合酶进行体外转录，经2小时，37°C反应 后，得到Το12转座酶mRNA; (3) 经NucAway? Spin Columns纯化吸附柱回收mRNA后，经2%琼脂糖凝胶电泳进行定 性分析，W及经化e化op仪器进行定量分析，将分装mRNA后于-70°C保存。6. 根据权利要求3所述的带abcb4的转基因斑马鱼系的建立方法，其特征在于:步骤3中 转座子Το12系统胚胎显微注射按照W下步骤进行： (1) 将7b公.·娜巧垂组质粒DNA及To 12转座酶mRNA进行纯化和混合，冰上待用； (2) 选取发育正常的野生型斑马鱼单细胞期胚胎，置于琼脂糖凝胶注射板上； (3) 将摆放完毕的斑马鱼胚胎置于体视显微镜下，显微注射针吸取混合溶液约化1; (4) 通过显微注射仪，向斑马鱼单细胞期胚胎的细胞中，W每枚胚胎约0.005 μ1注入 7b公.·風?巧垂组质粒DNA及To 12转座酶mRNA混合溶液； (5) 将注射完毕的斑马鱼胚胎进行饲养，待W后实验所用。
【文档编号】C12N15/66GK106070063SQ201610531446
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月7日
【发明人】舒莉萍, 何志旭, 孙琮杰, 胡荣英, 金璐, 何思佳, 吴西军
【申请人】贵州医科大学