专利名称：重组的抗人TNFα基因工程抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于中和肿瘤坏死因子α毒性的重组抗人TNFα基因工程抗体本(anti－human tumor necrosis facter－α genetic engineeringantibody)并涉及一种利用分子生物学手段制备抗人TNFα基因工程抗体的方法。
肿瘤坏死因子－α(Tumor necrosis factor α，TNF－α)是由巨噬细胞和活化T细胞产生的一种细胞因子，具有多种重要的生物学活性。由于TNF－α大量释放而致的炎症、损伤和感染性休克等，往往症状凶险，难以治疗，因此其拮抗物的研究受到广泛高度的重视。已有大量的动物实验证据和一些临床试验表明，抗TNF－α单／多克隆抗体能够预防和治疗因TNF－α过量产生而导致的炎症、损伤等疾病状态，但由于利用杂交瘤技术获得的抗TNF－α单克隆抗体多为鼠源性抗体，在临床治疗的重复使用过程中会产生人抗鼠抗体(Humananti－mouse autibody，HAMA)，引起免疫排斥反应，影响了人体正常的免疫反应，因而限制了抗TNF－α单抗在临床实践中的应用。
本发明的目的在于提供一种中和肿瘤坏死因子α毒性具有良好效果的重组抗人TNFα基因工程抗体，它对机体受到过量TNFα毒性的保护具有明显的预防作用并优于鼠源性单克隆抗体；同时本发明还提供一种重组抗人TNFα基因工程抗体的制备方法，该方法生产周期短、操作简单、成本低。
为实现上述目的本发明的技术方案以如下方式实现抗人肿瘤坏死因子－α单链抗体(mouse anti－TNF－α ScFv)的基因序列如下ATG CAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGA CCT GGC CTC GTG AAACCT TCT CAG TCT CTG TCT CTC ACC TGC TCT GTC ACT GGC CAC TCCATC AGC AGT GGT TAT TTC TGG AAC TGG ATC CGG CAC TTT CCAGGA AAC AAA CTG GAA TGG ATG GGC TAC ATA AGT TAC GAC GGTAGC AAT AAG TAC AAC CCA TCT CTC AAA AAT CGA ATC TCC ATCACT CGT GAC ACA TCT GAG AAC CAG TTT TTC CTG ATC TTG AAT TCTGTG ACT TCT GAG GAC ACA GCT ACA TAT TAC TGT GCA AGA GACGAT AAC TGG AAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGC ACC ACG GTCACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCTGGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC GTC ATG ACC CAG TCTCCA TCC TCC CTG GCT ATG TCA GTA GGA CAG AAG GTC ACT ATGAGC TGC AAG TCC AGT CAG AGT GTT TTA AAT AGC AAC ACT CAAAAG AAC TAT TTG GCC TGG TAC CAG AAG AAA CCA GGA CAG TCTCCT GAA CTT CTG GTA TAT TTT GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGGGTC CCT GAT CGC TTC ATG GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTCACT CTT ACC ATC AGC AGT GTA CAG ACT GAA GAC CTG GCA GATTAC TTC TGTCAG CAA CAT TAT AGG ACT CCG TTC ACG TTC GGC TCGGGG ACA AAG TTG。该基因序列在基因库(Geneback)中的收录号为AF252545和AF262753。
上述单链抗体的制备方法包括如下主要步骤(1)利用反转录聚合酶链式反应(RT－PCR)方式获取所需抗人TNFα可变区基因序列；(2)利用基因工程手段获得抗人TNFα单链抗体基因序列；(3)利用基因工程手段获得抗人TNFα单链抗体重组表达产物；(4)通过表达产物的纯化或变性复性和纯化后获得具有良好活性的重组抗人TNF α单链抗体。
上述的抗人TNFα单链抗体基因序列包括全序列和部分序列。
上述的利用基因工程手段包括利用各种原核系统，酵母系统，真菌系统和真核系统表达的抗人TNFα单链抗体。
上述的基因全序列和部分序列包括突变体以及与其它的目的基因的融合体。
通过大量体外细胞试验证实适当剂量的重组抗人TNFα单链抗体可刺激体外培养的成纤维细胞产生对TNFα的中和效应。特别是本发明具有中和TNFα毒性的作用，对组织损伤的保护作用显著，与亲本抗体有相同的抗原结合表位。并具有操作简单，生产周期短，可批量生产，产量高，成本低，纯度高，活性好，质量稳定，使用安全的特点。在平战时有广阔的应用前景。
以下结合具体实施方法和实验例对本发明作进一步说明。实施方法1．编码抗人TNFα可变区基因的获得根据已发表的抗体基因全序列，设计聚合酶链式反应(PCR)引物，从一株分泌抗人TNFα的小鼠杂交瘤细胞中扩增得编码抗人TNFα的轻、重链基因序列。2．编码抗人TNFα单链抗体基因的获得用连接肽将轻、重链基因拼接成单链抗体基因序列。3．抗人TNFα单链抗体的重组表达将编码抗人TNFα单链抗体基因序列克隆到大肠杆菌表达载体pBV220上，转化大肠杆菌，得到表达抗人TNFα单链抗体的工程菌。3．抗人TNFα基因工程产物的获得大肠杆菌表达产物经裂菌，层析纯化或包涵体分离、变性复性、经过合理组织的多种层析分离手段纯化，得到重组的抗人TNFα的基因工程产物。这里的重组抗人TNFα基因工程产物还包括其衍生的各种复合剂型和缓释剂型。
实验例1培养小鼠成纤维细胞L929接种96孔培养板5×104个／孔，ScFv以系列浓度(0．1 ug／ml～5 ug／ml)，与rHuTNF－α(4 ug／ml)等体积混合，37℃予作用1小时或立即加入培养细胞悬液中；结果显示ScFv抗体随其浓度的增高，抑制TNF－α对L929细胞毒性的作用也随着增强，在4 ug／ml抗体浓度，细胞存活率可达90％以上。细胞周期分析表明仅加TNF－α的阴性对照细胞的细胞周期消失，仅出现一明显的亚二倍体凋亡峰(98．6％)，正常L929培养细胞出现轻微的亚二倍体凋亡峰(1％)，ScFv与其亲本抗体E6mAb分别保护的L929细胞G1期、G2期及它们的CV值与正常L929活细胞相比变化不大，且没有凋亡峰出现，表明此ScFv具有保护L929细胞免受内源性或外源性TNF－α细胞毒的作用。
实验例2由于细胞内外环境的不同，有些在细胞外可以相互作用的蛋白在细胞内却不能相互作用。我们用酵母双杂交系统检测了ScFv与人TNF－α在酵母细胞内的相互作用。E6ScFv和人TNF－α基因分别按读框插入DNA结合域(DBD)的质粒pLexA和表达转录激活域(TAD)的质粒pB42AD，然后共转化酵母EGY48，用Leu和Trp营养缺陷进行筛选。挑选能在选择培养板上生长的克隆，在原位用X－gal检测其β－半乳糖苷酶的表达。结果表明两种质粒共转染后的酵母细胞克隆可检测到β－半乳糖苷酶的表达呈阳性，证明E6ScFv和人TNF－α可在酵母细胞内相互作用。
多次系统的实验都证明抗TNF－α单链抗体是一种有效的TNF－α毒性防护剂。
权利要求
1.一种重组的抗人TNF α基因工程抗体，其特征在于它为抗人肿瘤坏死因子－α单链抗体(mouse anti－TNF－α ScFv)，其基因序列如下ATG CAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGA CCT GGC CTC GTG AAACCT TCT CAG TCT CTG TCT CTC ACC TGC TCT GTC ACT GGC CACTCC ATC AGC AGT GGT TAT TTC TGG AAC TGG ATC CGG CAC TTTCCA GGA AAC AAA CTG GAA TGG ATG GGC TAC ATA AGT TACGAC GGT AGC AAT AAG TAC AAC CCA TCT CTC AAA AAT CGA ATCTCC ATC ACT CGT GAC ACA TCT GAG AAC CAG TTT TTC CTG ATCTTG AAT TCT GTG ACT TCT GAG GAC ACA GCT ACA TAT TAC TGTGCA AGA GAC GAT AAC TGG AAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGCACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGAGGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC GTC ATGACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG GCT ATG TCA GTA GGA CAG AAGGTC ACT ATG AGC TGC AAG TCC AGT CAG AGT GTT TTA AAT AGCAAC ACT CAA AAG AAC TAT TTG GCC TGG TAC CAG AAG AAA CCAGGA CAG TCT CCT GAA CTT CTG GTA TAT TTT GCA TCC ACT AGGGAA TCT GGG GTC CCT GAT CGC TTC ATG GGC AGT GGA TCT GGGACA GAT TTC ACT CTT ACC ATC AGC AGT GTA CAG ACT GAA GACCTG GCA GAT TAC TTC TGT CAG CAA CAT TAT AGG ACT CCG TTCACG TTC GGC TCG GGG ACA AAG TTG。
2.根据权利要求1所述重组的抗人TNFα基因工程抗体的制备方法，其特征在于它包括如下主要步骤(1)利用反转录聚合酶链式反应(RT－PCR)方式获取所需抗人TNFα可变区基因序列，该基因序列在基因库(Geneback)中的收录号为AF252545和AF262753；(2)利用基因工程手段获得抗人TNFα单链抗体基因序列；(3)利用基因工程手段获得抗人TNFα单链抗体重组表达产物；(4)通过表达产物的纯化，或变性复性和纯化后获得具有良好活性的重组抗人TNFα单链抗体。
3.根据权利要求2所述重组的抗人TNFα基因工程抗体的制备方法，其特征在于所述的抗人TNFα单链抗体基因序列包括全序列和部分序列。
4.根据权利要求2所述重组的抗人TNFα基因工程抗体的制备方法，其特征在于所述的利用基因工程手段包括利用各种原核系统，酵母系统，真菌系统和真核系统表达的抗人TNFα单链抗体。
5.根据权利要求3所述重组的抗人TNFα基因工程抗体的制备方法，其特征在于所述的基因全序列和部分序列包括突变体以及与其它的目的基因的融合体。
6.根据权利要求2所述重组的抗人TNFα基因工程抗体的制备方法，其特征在于所述的重组抗人TNFα单链抗体包括其衍生的各种复合剂型和缓释剂型。
全文摘要
本发明公开了一种用于中和肿瘤坏死因子α毒性的重组抗人TNFα基因工程抗体及其制备方法,其基因序列在基因库(Geneback)中的收录号为AF252545和AF262753,制备的主要步骤包括:利用反转录聚合酶链式反应方式获取所需基因抗人TNFα单链抗体全序列和部分序列;利用基因工程手段获得抗人TNFα单链抗体重组表达产物;通过对表达产物的纯化获得具有良好活性的重组抗人TNFα单链抗体。本发明具有中和TNFα毒性的作用,对组织损伤的保护作用显著,其操作简单,产量、纯度高,活性好,使用安全可靠。
文档编号C12N15/63GK1280190SQ0011387
公开日2001年1月17日 申请日期2000年7月14日 优先权日2000年7月14日
发明者陈萍, 邓健蓓, 韩骅, 药立波 申请人:中国人民解放军第四军医大学