专利名称：一种建立动物乳腺生物反应器的新方法
目前国内外用于建立转基因动物的主要方法仍然是受精卵显微注射法。虽然受精卵前核的显微注射技术在不断的提高，设备也在不断地改善，但其基本的技术路线并无新的突破，人们不得不承认，显微注射法使转基因动物的建立受到了很大的限制。其主要问题是，设备昂贵，技术要求高，难度大，实验周期长等，在采集受精卵时依然沿用的是“杀鸡取卵”的办法，这在小动物尚可被接受，但用于大动物，尤其是用于工业化生产时，费用相当可观，令人望而却步。另外在哺乳动物中只有小鼠的受精卵前核是透明可见的，其他动物的受精卵因卵黄较多或含有脂滴，使前核部位出现不同程度的浑浊，使得基因的注入带有很大的盲目性，这也是目前转基因动物技术用于大动物的成功率远远低于小鼠的主要原因之一。人们也曾尝试过许多其他的方法，如精子载体法、病毒载体法和胚胎干细胞介导法，但均因存在许多问题至今而没有得到普遍的应用。
动物乳腺生物反应器，是指应用动物乳腺来生产珍贵的药用蛋白和珍贵的营养物质等。目前建立动物乳腺生物反应器的方法主要是通过建立转基因动物来实现的，即将含有目的基因的乳腺定位表达载体构件通过动物的生殖系细胞转入到动物的基因组中，使其在动物的乳腺中定位表达，使乳汁中含有珍贵的药用蛋白和营养物质，这样的乳汁即可以作为保健品或药品直接饮用，也可以从中提纯出药用蛋白或制成药用和营养用奶粉，其应用价值十分好，市场前景也非常广阔。为此建立动物乳腺生物反应器的相关技术在高科技制药等科技开发领域展示出良好的应用前景。
应用转基因动物-乳腺生物反应器技术来制造基因药物是一种可以获取巨额经济利润的新型产业。如荷兰金发马(Genpharm)公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从乳中提炼出来营养奶粉的销售额是50亿美元。英国罗斯林研究所研究成功的转基因羊，其乳汁中含有a1-抗胰蛋白酶，可用于某种肺气肿的治疗，每升这种羊奶可售6000美元。椐国外经济学家预期，大约10年后，转基因动物生产的药品就会鼎足于世界市场。那时，每年单是药物的销售额就将超过250亿美元(还不包括营养蛋白和其它产品)，从而使转基因动物-乳腺生物反应器产业成为最具高额利润的新型工业。
本发明的目的就是针对上述现有技术的不足之处，提供一种投资小，周期短，操作简单，效率高，尤其适用于牛、羊等大动物乳腺生物反应器的建立，即建立动物乳腺生物反应器的新方法。
本发明的目的是这样实现的一种建立动物乳腺生物反应器的新方法，其特征在于将配制好的目的的转染源直接引入到动物的乳腺组织或乳腺管中。
本发明的目的还可以这样实现所述的转染源通过注射器直接注射到动物的乳腺组织或乳腺管中。所述的转染源可通过下列阶段直接引入到动物的乳腺组织或乳腺管中a、在动物的幼年期，乳腺组织刚刚开始发育的时候；b、在动物的妊娠晚期，即在妊娠期的后1/3时候；c、在动物的每次娩前的1-2个月内。所述的转染源的引入过程可以一次完成。所述的转染源的引入过程可以多次完成，其完成过程a、第一次引入引入剂量比第2、3次高；b、第一次引入后的第二天追加引入一次引入剂量比第一次引入量少；c、第一次引入后的第三天再追加引入一次引入剂量比第一次引入量少。所述转染源的主要组成成份是a、目的基因的重组质粒；b、阳离子脂质体；c、细胞培养基。所述转染源的各成份为a、目的基因的重组质粒0.3％～1.0％；b、阳离子脂质体1.0％～10％；c、细胞培养基适量。所述的目的基因的重组质粒包括WAP-PA，LSI-PA，WAP-GFP，改良奶质，珍贵蛋白等等；所述的细胞培养基含有1640，DMEM，MEM等。
本发明的目的也还可以这样实现所述的转染源还可以直接通过导管导入到动物的乳腺组织或乳腺管中。所述的转染源可通过下列阶段直接引入到动物的乳腺组织或乳腺管中a、在动物的幼年期，乳腺组织刚刚开始发育的时候；b、在动物的妊娠晚期，即在妊娠期的后1/3时候；c、在动物的每次娩前的1-2个月内。所述的转染源的引入过程可以一次完成。所述的转染源的引入过程可以多次完成，其完成过程a、第一次引入引入剂量比第2、3次高引入剂量比第一次引入量少；b、第一次引入后的第二天追加引入一次引入剂量比第一次引入量少；c、第一次引入后的第三天再追加引入一次。所述转染源的主要组成成份是a、目的基因的重组质粒；b、阳离子脂质体；c、细胞培养基。所述转染源的各成份为a、目的基因的重组质粒0.3％～1.0％；b、阳离子脂质体1.0％～10％；c、细胞培养基适量。所述的目的基因的重组质粒包括WAP-PA，LSI-PA，WAP-GFP，改良奶质，珍贵蛋白等。所述的细胞培养基含有1640，DMEM，MEM等。
下面结合实施例对本发明作进一步的详述首先将配制好的含有外源基因(或称为目的基因)的特殊的转染液，根据动物的体形大小不同，选择不同的注射器，接上特制的导管或针头，吸取一定量的转染液，操作时动物无需麻醉，只要适当的固定便可以，注射的时间有三种选择，第一种是，在动物的幼年，乳腺组织刚刚开始发育的时候，用适当的导管或针头，将转染液通过乳头管注入到乳腺组织内，随着乳腺组织的生长发育，外源基因便进入到乳腺上皮细胞中，泌乳时外源基因得以表达，乳汁中产生目的蛋白。第二种是，在动物妊娠晚期，一般是在妊娠期的后1/3时间里，如牛是在妊娠后的6个月左右，此时的乳腺腺泡在体内激素的作用下迅速发育，随着细胞的分裂增值，外源基因很容易随着转染液进入到乳腺上皮细胞内，待到泌乳期乳汁中便可含有目的蛋白。第三种注射的时间是，在动物每次分娩前的1-2个月，通过乳头管将外源基因导入到乳腺组织中，使其转染乳腺上皮细胞，泌乳期乳汁中也可含有目的蛋白。
上述的三种时间可根据不同的动物或不同的目的基因加以选择，也可以在一个动物身上三种注射时间都使用。
实施例1小鼠乳腺生物反应器的建立。首先要配制转染液，根据不同的目的采用不同的配方。配方一WAP-PA基因片断溶液50μl，脂质体1μl，其中WAP为乳腺特异性表达启动子，tPA为目的基因，脂质体为促转染剂。配方二WAP-GFP基因片断溶液50μl，脂质体1μl，其中GFP为目的基因即绿荧光蛋白，其余同前。在小鼠妊娠的第16天左右即小鼠妊娠的后期进行基因的传染，为了操作方便，可适当地麻醉，如腹腔内注射0.5-1ml的水合氯醛；操作时，将小鼠固定于操作台上，将经过处理并尖端钝化的直径约0.25mm的Pasteur玻璃吸管插入到小鼠的乳腺管中，通过此导管将转染液注入到乳腺组织中。当小鼠泌乳时采集乳汁进行检测。采用琼脂糖平板溶圈实验可以检测到乳汁中是否有tPA存在。采用荧光显微镜可以观察乳腺组织中和乳汁中绿荧光蛋白(GFP)表达，从而确定乳腺生物反应器的建立成功。
实施例2家免tPA乳腺生物反应的器建立。转染液的配方和比例同上述的配方一，在家兔妊娠的第25天进行注射，注射时采用少量多点注射的方法，将转染液注入到乳腺组织和乳腺的导管中。母兔产子后4天，采集乳汁，用琼脂糖平板溶圈实验观察到乳汁中tPA的表达量为580ng/ml。
实施例3山羊tPA乳腺生物反应器的建立。转染液的配方和比例同上述的配方一，在母羊妊娠至4-5个月时进行注射，由于山羊的乳头管粗大，肉眼即可观察到，采用兽医用的注射器和针头便可进行注射，操作十分方便。操作时无需麻醉动物，为了安全起见，可适当地对山羊加以固定。每次注入的转染液量约为20ml，也可根据情况，在第一次注射后的第二和第三天各追加注射一次，每次注射的量为10-15ml，这样可有利于提高目基因的表达量。母山羊产子后4天，采集乳汁，用琼脂糖平板溶圈实验观察到乳汁中tPA的表达量为1000ng/ml。
实施例4牛tPA乳腺生物反应器的建立。转染液的配方和比例基本同上述的配方一，乳腺特异性表达启动子由WAP更换为asl酪蛋白启动子，含目的基因的表达载体构件为asl-PA，在母牛妊娠至7-8个月时进行注射，操作方法与羊基本相同，奶牛乳头管更加粗大，操作起来更为方便。每次注入的转染液量约为30-60ml，也可根据情况，在第一次注射后的第二和第三天各追加注射一次，每次注射的量为20ml左右，以便提高目的基因的表达量。母牛产子后4天，采集乳汁，用琼脂糖平板溶圈实验观察到乳汁中tPA的表达量为1500ng/ml。
综上所述，本发明的主要优点是，将目的基因直接注引入到基因表达的部位。可快速建立乳腺生物反应器，克服了目前通过建立转基因动物来建立动物乳腺生物反应器所存在的投资大、周期长、效率低和操作复杂等问题，从而简化了建立动物乳腺生物反应器的方法，缩短了生产周期，降低了成本，提高了效率。该方法尤其适用于用动物乳腺生物反应器来生产珍贵的药用蛋白等生物制品和营养保健品的工业化生产。应用该方法，可通过选择适当的时机和条件，选择不同的动物，可以用更快、更方便、更经济的方法来建立动物乳腺生物反应器，达到生产药用蛋白、营养保健品、营养奶粉的提高动物奶的质量等目的。
利用动物乳腺生物反应器来生产基因药物是一种全新的生产模式，与以往的制药技术相比，具有不可比拟的优越性。哺乳动物乳腺生物反应器好比在动物身上建药厂，一旦建立成功，可以从动物的乳汁中源源不断地获得目的基因产品。它的优越性还表现在产量高，易提纯，表达产物已经过充分修饰和加工，具有稳定的生物活性。故具有投资成本低，药物开发周期短和经济效益高的优点。
用转基因动物(包括动物乳腺生物反应器)来生产药物，可极大地减低成本和投资风险。国外的经济学家曾作过这样的计算，若用其他生产工艺(如哺乳动物细胞株培养系统)来生产1克药用蛋白，成本需800-5000美元，而利用转基因动物只需要0.02-0.5美元。
权利要求
1.一种建立动物乳腺生物反应器的新方法，其特征在于将配制好的转染源直接引入到动物的乳腺组织或乳腺管中。
2.根据权利要求1所述的一种建立动物乳腺生物反应器的新方法，其特征在于所述的转染源通过注射器直接注射到动物的乳腺组织或乳腺管中。
3.根据权利要求1所述的一种建立动物乳腺生物反应器的新方法，其特征在于所述的转染源还可以直接通过导管导入到动物的乳腺组织或乳腺管中。
4.根据权利要求1所述的一种建立动物乳腺生物反应器的新方法，其特征在于所述的转染源可通过下列阶段直接引入到动物的乳腺组织或乳腺管中a、在动物的幼年期，乳腺组织刚刚开始发育的时候；b、在动物的妊娠晚期，即在妊娠期的后1/3时候；c、在动物的每次娩前的1-2个月内。
5.根据权利要求1所述的一种建立动物乳腺生物反应器的新方法，其特征在于所述的转染源的引入过程可以一次完成。
6.根据权利要求5所述的一种建立动物乳腺生物反应器的新方法，其特征在于所述的转染源的引入过程可以多次完成，其完成过程a、第一次引入，引入剂量比第2、3次高；b、第一次引入后的第二天追加引入一次，引入剂量比第一次引入量少；c、第一次引入后的第三天再追加引入一次，引入剂量比第一次引入量少。
7.根据权利要求1所述的一种建立动物乳腺生物反应器的新方法，其特征在于所述转染源的主要组成成份是a、目的基因的重组质粒；b、阳离子脂质体；c、细胞培养基。
8.根据权利要求7所述的一种建立动物乳腺生物反应器的新方法，其特征在于所述转染源的各成份为a、目的基因的重组质粒0.3％～1.0％；b、阳离子脂质体1.0％～10％；c、细胞培养基适量。
9.根据权利要求7所述的一种建立动物乳腺生物反应器的新方法，其特征在于所述的目的基因的重组质粒包括WAP-PA，LSI-PA，WAP-GFP，改良奶质，珍贵蛋白等等。
10.根据权利要求7所述的一种建立动物乳腺生物反应器的新方法，其特征在于所述的细胞培养基含有1640，DMEM，MEM等等。
全文摘要
本发明涉及一种建立动物乳腺生物反应器的新方法,其特征在于将配制好的转染源直接引入到动物的乳腺组织或乳腺管中。本发明具有投资小,周期短,操作简单,效率高,尤其适用于牛、羊等大动物乳腺生物反应器的建立等优点。
文档编号C12N5/06GK1278008SQ0011422
公开日2000年12月27日 申请日期2000年4月24日 优先权日2000年4月24日
发明者安靓 申请人:中国人民解放军第一军医大学