专利名称：带内含子的卡那霉素抗性基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物转基因领域中筛选转化体用的抗生素抗性基因，尤其是关于带内含子的卡那霉素抗性基因及其应用。
在高等植物外源基因导入过程中，以根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的基因转化已经成为主要的，行之有效的方法(Schell1987，Sci，2371176～1183)。根癌农杆菌转化包括细菌对植物叶片、叶柄等外植体的侵染；受侵外植体在含有抗生素的培养基中生长，并筛选具有抗性外植体；抗性外植体分化出抗性芽；在一定的激素调节下再生出抗性植株。为了防止农杆菌侵染后在外植体上过度生长，造成外植体死亡，常在筛选培养基加入羧苄青霉素或头胞霉素，用来杀死农杆菌细胞。羧苄青霉素和头胞霉素都能抑制根癌农杆菌的生长和繁殖，因此在根癌农杆菌介导的转基因过程中，常采用这两种抗生素来消除转化后的农杆菌。但是研究表明，这两种抗生素都有类似植物激素的活性(Okkels 1988，Acta Hort，225199～207；Mathias 1986，Plant Sci，46217～223)。头胞霉素对不同的植物组织具有很强的毒性(Pollock 1983，Plant Cell Rep，236～39)，而羧苄青霉素具有类似2，4-D的结构和功能(Holford 1992，Plant Cell Rep，1193～96)，当羧苄青霉素和2，4-D混加时，很容易导致外植体的坏死，而在拟南芥菜转化过程中，筛选培养基中加入羧苄青霉素500mg/L后，调节细胞分裂素与生长素的比例有利于外植体再生频率的提高，外植体再生频率提高后，很容易出现假的抗性芽，在以后分化、再生出植株的过程中，增加了转接和检测的工作量。另一方面，由于羧苄青霉素和头胞霉素类拟植物激素的活性，在受侵外植体的筛选过程中，加入这两种抗生素后，培养基中的激素变得非常复杂，各类激素的比例很难调节，从而影响转化体的再生，有的外植体再生频率大幅度下降，导致筛选不出转化体(Lin 1995，Plant Sci，109171～177)。
如果能利用单一的抗生素作为抗性筛选可以减轻抗生素对转化的影响。在植物双元载体构建过程中，常常采用花椰菜花叶病毒35S启动子调控卡那霉素抗性基因的表达，并将这个表达单元和需要转化到植物的外源基因表达单元一起组装到整合区左右边界内，通过农杆菌共同整合到植物的染色体上，然后在植物细胞中表达，使转化成功的细胞具有卡那霉素抗性，因此，通过含有卡那霉素的培养基中培养植物的外植体可以筛选出转基因植株。然而，在根癌农杆菌中包括CaMV35S在内的多种启动子均具有一定活性(Vancanneyt 1990，Mol Gen Genet，220245～250)，以35S启动子和抗性基因相连，该抗性基因只能作为抗性植物的筛选标记，不能用一样的抗生素杀灭残存的农杆菌细胞，因此在抗性植株筛选过程中必须外加其他抗生素。
另一个更为重要的因素是转基因植物中利用卡那霉素等抗生素作为筛选标记，对环境构成了很大的压力。科学家担心抗性基因可能通过微生物在自然界蔓延，很多人类的病原菌经过基因重组、交换和转移可以获得这些抗性基因，导致抗生素类药失去效果，最终威胁到人类自身健康。
本发明的目的是为了克服羧苄青霉素和头胞霉素对受侵外植体再生的影响，减少卡那霉素抗性基因对环境造成的威胁，在农杆菌转化载体构建过程中，提供一种带内含子的卡那霉素抗性基因作为抗性选择标记，代替常用的卡那霉素抗性基因，用于植物转基因中筛选转基因植株。
本发明提供带内含子的卡那霉素抗性基因，它是采取连续延伸PCR扩增的方法，将修饰突变的CAT-1基因第一内含子(Ohta 1990 Plant CellPhysiol，31(6)805～813)插入卡那霉素抗性基因编码区的N端序列的第13位。此内含子长189bp大小，在三个不同的开放阅读框架内都含有终止密码TAG(参见图2)。利用PCR方法从载体pCMBIA1201(Hajdulciewicz P.1994，Plant Molecular Biology 25(6)989-994)中扩增出内含子片段，PCR产物电泳并回收。以pBBR1MCR2(HevreroM.1990，Journal ofBacteriology 172(11)6557-6567)为模板扩增出约800bp的卡那霉素抗性基因，PCR产物电泳并回收。以两个PCR产物为模板，利用PCR方法将两个片段连接成带内含子的卡那霉素抗性基因，PCR合成过程示意图参见图1。得到的带内含子的卡那霉素抗性基因的DNA核苷酸序列见图3。
将带内含子的卡那霉素抗性基因构建成植物双元表达载体pYP1202，通过农杆菌转化到植物中(见实施例3和4以烟草为例)利用不同浓度的卡那霉素和加有羧苄青霉素的培养基筛选转基因植物，检测带内含子的卡那霉素抗性基因对转化效率的影响。
将构建好的植物双元表达载体pYP1202由35SΩ启动子控制，该抗性基因表达单元与GUS基因的表达单元连接在一起，位于转化区内，通过GUS基因的表达可以用来作为转基因成功与否的检测。
本发明带内含子的卡那霉素抗性基因是利用原核生物缺少真核生物剪切加工的特点，在卡那霉素抗性基因编码区的N端加入一个内含子，在转基因植物中内含子能够正确剪切加工，使该基因产生有功能的蛋白，转基因外植体具有很高的卡那霉素抗性。当插入的内含子在不同的编码框里都有终止密码时，带内含子的抗性基因不能在农杆菌中表达出活性蛋白，低浓度的卡那霉素可以使细菌致死，因此在筛选培养基中加入卡那霉素后，转基因外植体能够生长而含有该基因的农杆菌不能生长。对于不同的转化材料，由于其本身对卡那霉素的耐受性有很大的差异，因此通过调节卡那霉素的浓度可以直接筛选转基因植株，从而避开了羧苄霉素和头胞霉素对转化的影响。
此外，由于带内含子的卡那霉素抗性基因不能在细菌中正确编码，细菌不能表现卡那霉素抗性，转基因植物释放后，该基因不构成对环境的抗性选择压力，这样，大大增加了转基因植物的安全性。目前我们正利用该套体系进行大规模的植物基因转化工作，相继获得了苹果、康奈馨，小青菜，甘蓝和油菜等多种转基因植株。由于抗性筛选培养基中激素的可控性，使外植体再生频率能够调节到正常水平，因此对于一些再生频率较低的植物，该套体系的作用更加明显。
本发明带内含子的卡那霉素抗性基因作为转基因植物的筛选标记具有如下优点(1)在植物转化过程中，只需在筛选培养基中加入卡那霉素即可以筛选转基因植物，不必利用羧苄青霉素和头胞霉素杀死农杆菌细胞。
(2)和正常的卡那霉素抗性基因相比，带内含子的卡那霉素抗性基因可以提高转基因植物的卡那霉素抗性，因此利用该基因作为抗性筛选标记，在很高浓度的卡那霉素培养基中容易得到真正的转基因植物。
(3)由于不受羧苄青霉素和头胞霉素的影响，被农杆菌侵染的植物外植体分化和再生条件容易控制，因此利用该基因作为选择标记，对一些再生特别困难的植物材料转化更加有利。
(4)由于该基因在细菌中没有活性，不会在细菌中扩展蔓延，因此不象卡那霉素抗性基因，该基因对环境不构成污染，转基因植物具有安全性。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但不限制本发明的范围。
图1是带内含子卡那霉素抗性基因PCR合成过程示意图。
图2是带内含子卡那霉素抗性基因N端序列。其中(A)为野生型基因N端，(B)为内含子插入后N端序列。
图3是带内含子卡那霉素抗性基因的DNA核苷酸序列，小写为内含子序列。
图4是带内含子卡那霉素抗性基因作为标记基因的植物双元载体pYP1202构建图。
图中Tac35Tac35启动子插入EcoRI-XhoI位点EEcoRI XXhoI AApaI NNcolMCS多克隆位点实施例1 PCR扩增得带内含子的卡那霉素抗性基因合成下列4个引物带内含子卡那霉素抗性基因两端的两个引物分别为5’端Km5(5’-AGAGCTCGAGGGCCCAACAATGGATCTGAGGGTAAATTTCTAGTTTTTCTCCTTC-3’)；3’端Kml1(5’-AGAGCTCGAGCGGCCGCTCTCAGAAGAACTCGTCGTCAAGAAG-3’)；插入的内含子3’端设计正反两个引物，分别为正向 Km9(5’-TATGATGATGATAGTTACAGGGATTGCACGCAGGTTC TC-3’)；反向Km8(5’-CTGTAACTATCATCATCATCATA-3’)。
采取连续延伸PCR扩增的方法(姚泉洪1999，上海农业学报15，11-16)，将修饰突变的CAT-1基因第一内含子(Ohta 1990，Plant CellPhysiol，31(6)805～813)插入卡那霉素抗性基因编码区的N端序列的第13位。以pCAMBIA 1201(Hajdulciewcz P.1994，Plant Molecular Biology25(6)989-994)为模板，Km5和Km8为引物，扩增出189bp大小的内含子片段，扩增条件为94℃ 20s，58℃ 20s，72℃ 30s共30个循环，PCR产物电泳检测结果与文献报道值相同，产物回收。以pBBR1MCR2(HevreroM.1990，Joumal ofBacteriology 172(11)6557-6567)为模板，Km9和Km11为引物扩增出约800bp的卡那霉素抗性基因，扩增条件为94℃ 30s，58℃30s，72℃ 90s共30个循环，PCR产物电泳检测结果与文献报道值相同，产物回收。以两个PCR产物为模板，Km5和Km11为引物，扩增出带内含子卡那霉素抗性基因，扩增条件为94℃30s，58℃30s，72℃90s共30个循环，PCR合成过程示意图见图1。得到的带内含子的卡那霉素抗性基因的DNA核苷酸序列见图3。
实施例2植物双元载体pYP1202的构建利用PCR扩增方法在35SΩ启动子两端加入EcoRI和ApaI酶切位点。35SΩ启动子两端的引物为35SZ1(5’-AAGAATTCATCTTCGTCAACATGGTGG-3’)；Ω2(5’-TGATTGGGCCCTCGTAATTGTAAATAGTAATTGTAAT-3’)；在Tac35启动子两端加入引物，Tac35启动子两端的引物为Tac3(5’-ACGAATTCAATGAGCTGTTGACAATTAATC-3’)，Tac5(5’-AACTCGAGCCATGGGGGCCCGATATATCTCCTTCTTATATAGTTA-3’)。PCR反应条件为94℃ 30s，58℃ 30s，72℃30s共30个循环。先将Tac35启动子片段用EcoRI和XhoI酶切后，插入PCAMBIA 1201载体，替换掉其中的潮霉素抗性基因表达单元，在ApaI和Xho间插入带内含子的卡那霉素抗性基因，然后用35SΩ启动子替换Tac35启动子，构建带内含子的卡那霉素抗性基因作为筛选标记的植物双元载体pYP1202(见图4)。
实施例3 对照菌珠pYPKm(含卡那霉素抗性基因作为筛选标记的载体)的构建利用PCR扩增方法在35SΩ启动子两端加入EcoRI和ApaI酶切位点。35SΩ启动子两端的引物为35SZ1(5’-AAGAATTCATCTTCGTCAACATGGTGG-3’)；Ω2(5’-TGATTGGGCCCTCGTAATTGTAAATAGTAATTGTAAT-3’)；在Tac35启动子两端加入引物，Tac35启动子两端的引物为Tac3(5’-ACGAATTCAAT GAGCTGTTGACAATTAATC-3)，Tac5 (5’-AACTCGAGCCATGGGGGCCCGATATATCTCCTTCTTATATAGTTA-3’)。PCR反应条件为94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s共30个循环。先将Tac35启动子片段用EcoRI和XhoI酶切后，插入PCAMBIA 1201载体，替换掉其中的潮霉素抗性基因表达单元，在ApaI和Xho间插入带卡那霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因两端的引物分别为5’端Km10(5’-AGAGCTCGAGGGCCCAACAATGGATCTGAGGGATTGCACGCAGGTTCTC-3’)3’端Km11(5’-GAGCTCGAGCGGCCGCTCTCAGAAGAACTCGTCGTCAAGAAG-3’)；PCR反应条件为94℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 90s共30个循环。然后用35SΩ启动子替换Tac35启动子，构建卡那霉素抗性基因作为筛选标记的植物表达载体pYPKm(见图4)。
实施例4 带内含子的卡那霉素抗性基因作为筛选标记的植物双元载体pYP1202转化烟草烟草品种为革新1号(Nicotiana tabacum var.Gexin No.1)，侵染外植体为苗龄6-10天的无菌苗子叶，切成2-4mm2小块，在诱导愈伤增养基中(MS基础培养基+BA2.5mg/L+IAA1.5mg/L)。根癌农杆菌在YEB(蔗糖5g/L，蛋白胨5g/L，牛肉5g/L，硫酸镁49mg。琼脂15g)+利福平50mg/L+卡那霉素50mg/L平板上培养48-72小时，培养温度为25-30℃，挑取单菌落在YEB液体培养基培养至对数生长期，菌的光密度0D600为0.2-0.5，用菌侵染烟草子叶10-30分钟后，用滤纸吸干菌液，移入无抗菌素的培养基中(MS基础培养基+BA2.5mg/L+IAA1.5mg/L)共培养1-3天，共培养后受侵外植体转接到选择培养基上(无抗菌素培养基+50-300mg/L卡那霉素)，筛选抗性植株(参见Horsch，1985，Sci，2271229-123 1)。
实施例5 带内含子的卡那霉素抗性基因在不同抗生素条件下对芽分化的影响200mg/L卡那霉素和50mg/L卡那霉素条件下，携带表达载体pYP1202的根癌农杆菌转化烟草叶片，抗性芽分化频率分别为44.5％和32.0％，高浓度卡那霉素反而有利于提高抗性芽分化，和对照菌株pYPKm相比，200mg/L卡那霉素和50mg/L卡那霉素条件下，抗性芽的分化频率分别为38.2％和15.4％，带内含子的卡那霉素抗性基因更有利于抗性芽的形成。当加入羟苄青霉素(Km+Cb)后，抗性芽分化频率大幅度提高，由原来的46.8％提高到91.4％(参见下列表1)，这种增长为不正常增长，说明羧苄青霉素具有类激素活性，细胞生长过快，很多细胞躲过抗性选择，然后分化出芽，因此假的抗性芽很多。另外，在抗性芽筛选过程中，利用带内含子卡那霉素抗性基因作为选择标记，只需加卡那霉素即可将细菌杀死，因此，在筛选抗性芽的过程中，不必加入羧苄青霉杀死细菌，从而避免假抗性芽产生。对照菌株即使在200mg/L卡那霉素筛选培养基中也不容易杀死，转化外植体培养7天后，可见根癌农杆菌污染。本实验说明带内含子的卡那霉素抗性基因转化到植物细胞后，植物细胞对卡那霉素的解毒能力加强，即使在高浓度的卡那霉素筛选压力下，抗性芽的分化正常，抗性愈伤能耐受到很高的卡那霉素。
表1 不同浓度卡那霉素和羧苄青霉素对抗性芽分化的影响
实施例6带内含子的卡那霉素抗性基因在不同抗生素条件下产生抗性芽的GUS活性检测GUS基因表达单元和抗性基因的表达单元连接在一起，GUS基因的表达可以用来作为转基因成功与否的检测。从每个处理之中随机挑取抗性芽进行GUS活性检测(参见Jefferson RA EMBO J，63901～3907)，当加入X-Gluc后，具有GUS活性的转基因植株将显现蓝色。每个处理取30个外植体，每个外植体上只取一个抗性芽。表2中显示，携带表达载体pYP1202的根癌农杆菌转化烟草叶片，随着Km浓度的升高，有GUS活性的转化体占抗性芽的比例也提高，当Km浓度为200mg/L时，转化体占抗性芽的比例高达93.3％，而在加有羧苄青霉素的培养基中，转化体占抗性芽的比例仅为26.7％。对照菌株pYPKm中转化体占抗性芽的比例很低，当Km浓度为200mg/L时，转化体占抗性芽的比例只有31.3％。本实验说明利用带含子的卡那霉素抗性基因作为筛选标记，可以减少其它抗菌素如羧苄青霉素对转化的影响。
表2带内含子卡那霉素抗性基因在不同抗性条件下对转化的影响
权利要求
1.一种带内含子的卡那霉素抗性基因，其特征在于具有如下的DNA核苷酸序列1 ATGGATCTGA GGGTAAATTT CTAGTTTTTC TCCTTCATTT TCTTGGTTAG GACCCTTTTC61 TCTTTTTATT TTTTTGAGCT TTGATCTTTC TTTAAACTGA TCTATTTTTT AATTGATTGG121 TTATGGTGTA AATATTACAT AGCTTTAACT GATAATCTGA TTCTTTATTT CGTGTGTCTA181 TGATGATGAT GATAGTTACA GGGATTGCAC GCAGGTTCTC CGGCCGCTTG GGTGGAGAGG241 CTATTCGGCT ATGACTGGGC ACAACAGACA ATCGGCTGCT CTGATGCCGC CGTGTTCCGG301 CTGTCAGCGC AGGGGCGCCC GGTTCTTTTT GTCAAGACCG ACCTGTCCGG TGCCCTGAAT361 GAACTGCAGG ACGAGGCAGC GCGGCTATCG TGGCTGGCCA CGACGGGCGT TCCTTGCGCA421 GCTGTGCTCG ACGTTGTCAC TGAAGCGGGA AGGGACTGGC TGCTATTGGG CGAAGTGCCG481 GGGCAGGATC TCCTGTCATC TCACCTTGCT CCTGCCGAGA AAGTATCCAT CATGGCTGAT541 GCAATGCGGC GGCTGCATAC GCTTGATCCG GCTACCTGCC CATACGACCA CCAAGCGAAA601 CATCGCATCG AGCGAGCACG TACTCGGATG GAAGCCGGTC TTGTCGATCA GGATGATCTG661 GACGAAGAGC ATCAGGGGCT CGCGCCAGCC GAACTGTTCG CCAGGCTCAA GGCGCGCATG721 CCCGACGGCG AGGATCTCGT CGTGACCCAT GGCGATGCCT GCTTGCCGAA TATCATGGTG781 GAAAATGGCC GCTTTTCTGG ATTCATCGAC TGTGGCCGGC TGGGTGTGGC GGACCGCTAT841 CAGGACATAG CGTTGGCTAC CCGTGATATT GCTGAAGAGC TTGGCGGCGA ATGGGCTGAC901 CGCTTCCTCG TGCTTTACGG TATCGCCGCT CCCGATTCGC AGCGGATCGC CTTCTATCGC961 CTTCTTGACG AGTTCTTCTG A
2.如权利要求1所述的带内含子的卡那霉素抗性基因的应用，其特征在于作为抗性筛选标记在转基因植物中筛选转基因植株。
全文摘要
利用PCR方法,在卡那霉素抗性基因编码区N端13位插入一个189bp植物内含子,合成带内含子的卡那霉素抗性基因。在转基因植物中,该基因不但可以用来替换卡那霉素抗性基因作为转化体抗性筛选,而且比卡那霉素抗性基因更具优点:(1)在转化过程中,不需加入其它抗生素即可完成植物转化体选择和杀灭农杆菌的双重目的,防止了其它抗生素对转化的影响,提高了转化效率。(2)该基因在原核细菌中没有活性,消除了抗性基因对环境的污染。
文档编号C12N15/11GK1337464SQ0011959
公开日2002年2月27日 申请日期2000年8月11日 优先权日2000年8月11日
发明者姚泉洪, 彭日荷, 熊爱生 申请人:上海市农业科学院生物技术研究中心