专利名称：胶陀螺或其菌丝体人工培育方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蘑菇栽培技术领域。
自然界有野生胶陀螺，但国内外均未见有关于将其用于临床医疗的报导，也未见有用人工方法培育栽培胶陀螺的报导，也没有对其进行过人工分离训化工作。由于发现胶陀螺有很高的临床医疗价值，而目前自然界的野生及胶陀螺又很少，故解决其人工分离训化栽培技术问题具有重要的应用价值。
本发明的任务是提供一种胶陀螺或其菌丝体人工培育方法及应用，它很好地解决了胶陀螺或其菌丝体人工分离训化栽培的问题，可人为提高重量，而且可用胶陀螺作为治疗皮肤病的特效药物，用于治疗银屑病、白癜风、皮炎或湿疹等皮肤病。
本发明目的之一是这样实现的a、进行菌种分离，从胶陀螺科真菌胶陀螺的整个子实体中分离出胶陀螺菌丝体，作为胶陀螺母种原种；b、进行一级菌种母种培养，采用加富培养基进行母种分离后转接，菌种萌发后沿培养基表面生长，形成明显菌落，菌落至少生长10天以上，作为胶陀螺菌种，上述加富培养基的重量份数配比为薯类 100-300葡萄糖或蔗糖 10-30维生素B1 5-15 琼脂10-30 水1000方法是将薯类切成小条或薄片，放于锅中加水煮沸至著条熟而不烂，过滤，加维生素B1于滤液中，将滤液入于锅中，加糖和琼脂，用文火加热，搅拌，使琼脂溶化，加热水补足水分，趁热分装于培养器中；c、胶陀螺二级及三级培养，先制作培养基，灭菌后接种，培养温度为15-35℃，待长势良好，即可。
以上二级及三级培养方法同，三级培养结果是长出子实体。
上述培养基可用玉米粒培养基，其重量份数配比为蒸熟玉米60-95，米糠10-30，石膏0．5-1．5，料水比为1∶1．5-2．0，灭菌。
培养基也可用木屑培养基，其重量份数配比为硬杂木屑60-90，米糠或麦皮10-30，蔗糖0．5-1．5，碳酸钙或石膏粉0．1-1．5，料水比为1∶1．5-2．0，按配比称取原料，把糖加入水中，其他原料混匀，加入糖水。
培养基也可用玉米芯培养基，其重量份数配比为玉米芯60-95，米糖10-30，石膏0．5-1．5，料水比为1∶1．5-2．0，灭菌。
本发明目的之二是一种胶陀螺或其菌丝体的应用，将胶陀螺或其菌丝体药材用常规中药乙醇浸泡法提取其有效成分，回收乙醇，将该有效成分用于制作治疗银屑病、皮炎、白癜风或湿疹皮肤病的口服药物。
本发明之一的优点是，设计的人工分离驯化培养技术合理，可达到预定的目的，生长快，产量高，适合大量栽培，采用人工方法首次解决了胶陀螺或其菌丝体人工分离驯化的难题，具有较高的实际应用价值。利用胶陀螺或其菌丝体的有效成分，制作治疗银屑病、皮炎、白癜风或湿疹等皮肤病的药物，具有很好的治疗效果。
以下通过实施例作详细说明，但不作为对本发明的限定。
实施例1一、胶陀螺来源及生物学特征。
(1)来源胶陀螺为胶陀螺科真菌胶陀螺的整个子实体。
(2)产地吉林省长白山区。
(3)形态特征未成熟子囊盘中间凹陷，上粗，下稍细，呈圆锥形子囊背面土褐色，上部色浅，下部色深，盘面为黑褐色。子实体单生或丛生，丛生多者6-9个，也有3-4个的，成熟子囊盘平展，子囊盘背面成黑褐色，颜色较深，有黑色粉状物为担孢子，多单生，丛生较少，有的子囊盘面不平整，边缘呈波浪形，开伞后弹射出大量黑色子囊孢子，粉状，黑色柄呈短圆锥形，子囊盘如同伞菌平展菌盖状。未成熟子实体高1．93cm，备用面宽1．34cm，成熟开伞子实体，高2．13cm，盘面宽3．95cm，柄长1．12cm。
二、菌种分离采用树皮(长有菌丝体)，茹木、菌肉组织和孢子弹射四种方式，在子实体中间分离胶陀螺菌丝体，其中采用菌肉组织法并采用严格无菌操作，20天长满管的胶陀螺母种原种。
三、母种培养(一级菌种)采用加富培养基进行母种分离后转接，菌种萌发后沿培养基表面有水珠的地方生长，该菌萌发快，菌种接后3-5天内形成以水珠点为基点的明显菌落。菌落大小不一，以接种点处最明显，且菌落较大，菌落点片状发生，表面有白灰色菌丝体，从菌落背面看菌落底部成褐色班块，班块大小与菌落大小相近，且老菌落色深，小菌落色浅，老菌落在生成后期有少数较大班块联合，而小菌落独立成点状，大约20天左右菌落长满管，但不是在培养基表面平展覆盖全部培养基，仍有较多空白处不长菌落，菌落生长初期发育速度快，后期生长速度变慢，可能与培养基表面水份逐渐减少有关。通过茹木及子实体分离母种进行相互鉴别，确定为胶陀螺菌种，菌种对PH值不敏感，通过对母种的驯化，现已能进行保藏及繁育。
四、胶陀螺二级菌种培养设计3种配方配方1为玉米粒培养基，配方2为杂木屑培养基，配方3为玉米芯培养基(见附录)，PH值设计为5、6、7三个数值常压灭菌冷却后接种，培养温度为22-25℃或15℃-35℃。可看出配方1生长速度快，菌丝强壮，500ml罐头瓶一般生长45天左右，配方2配方3菌丝较弱，但生长速度快，一般35-40天可长满全瓶，发现胶陀螺菌丝对PH值不敏感，5、6、7三个数值无明显生长培养。
上述4种配方实施例如下，其配制方法可按上述操作。
加富培养基组分
注马铃薯可用红薯、白薯、山药等代替。
玉米培养基配方
木屑培养基配方
玉米芯培养基配方
五、三极培养。即胶陀螺的栽培筛选3个配方分别进行瓶栽和袋栽。方法同二级，生长发育良好。
实施例2提取工艺取胶陀螺或其真菌丝体粉碎(3-5目)，依次用5倍量乙醇回流提取3次(2h，1h，1h)，滤过，合并滤液，减压加收乙醇，取药液1份，辅料1．5份混合，搅匀，干燥(约60℃)粉碎过80目筛，装胶囊或制成片剂、丸剂、冲剂、口服液等。
本品微苦，微酸，归肺肝心经，可清热解毒，活血祛瘀，用于治疗银屑病、皮炎、白癜风、湿疹等皮肤病。
以下是本发明用于治疗皮肤病的动物学试验资料某医科大学试验结论胶囊对表皮细胞增生模型(小鼠雌激素期阴道上皮细胞有丝分裂)具有抑制作用；对表皮细胞角化不全模型(小鼠尾部表皮颗粒细胞形成)具有促进角化作用；并对间接发显示表皮细胞DNA合成的淋巴细胞3H-TdR掺入具有抑制作用；说明可减轻或可逆转银屑病病理改变。本胶囊可明显提高豚鼠磷酸细胺致痒阈；对大鼠角叉菜足跖肿胀急性炎症模型及棉球肉芽肿慢性炎症模型，均具有明显拮抗作用；对小鼠耳廓微血管可使细动脉、细静脉口径显著增加，毛细血管开放数量明显增多，并在血瘀模型大鼠可明显减轻血液流变学的异常改变；表明具有明显止痒、抗炎及活血化瘀作用。免疫学试验表明对反映非特异免疫功能的网内系统吞噬功能及反映T细胞特异免疫功能的皮肤迟发型超敏反应无明显影响，但可使反映体液免疫的血清免疫球蛋白IgG和IgA明显增加，IgM无明显影响。
1、对银屑病动物模型的影响目的银屑病的基本病理特点为皮损部位表皮细胞过度增殖和角化不全。某种药物如能抑制表皮细胞过快增生或诱导表皮颗粒细胞生成，促进皮肤角化，则可能具有治疗银屑病的药理作用。处于雌激素期小鼠的阴道上皮细胞增殖活跃，上皮细胞转换加快。小鼠尾部表皮的角化形成与人类银屑病者相似，缺少颗粒细胞。因此，国内外学者，以其做为银屑病动物模型，评价治疗银屑病药物的作用。另外，淋巴细胞DNA合成在一定程度上反映皮肤角朊细胞DNA合成和细胞增殖，间接显示对表皮和真皮细胞增殖的影响。为此，选取上述三种试验观察本胶囊对银屑病的药效。
(1)对小鼠雌激素期阴道上皮细胞有丝分裂的影响方法昆明种小鼠60只，20-30g。腹腔注射乙烯雌酚0．2mg／只，每日1次，连续3日，使其处于雌激素期。第4日随机分为5组，每组12只。每日灌胃给药1次，灌胃容积0．25ml／10g，连续3日。末次药后2小时腹腔注射秋水仙碱2mg／kg4小时后处死小鼠取阴道，10％福尔马林固定，石蜡包埋常规制片，HE染色。光镜下计数300个阴道上皮基底细胞的有丝分裂数，其百分率为有丝分裂指数。
结果本发明胶囊0．28、0．56g／kg(相当临床日用量7、14倍，下同)。对小鼠雌激素阴道上皮细胞有丝分裂具有明显的抑制作用(P＜0．05、0．01)。
(2)对小鼠尾部表皮颗粒细胞生成的影响方法昆明种小鼠60只，20-30g。按表2随机分为6组，每组10只，雌雄各半。每日灌胃给药1次，灌胃容积为0．25ml／10g，连续给药20日。末次给药后2小时处死全部小鼠，取距鼠尾根部1．8cm处背侧皮肤一长条，用10％福尔马林固定，石蜡包埋常规制片，HE染色。于光镜下(400X)观察并计数鳞片(10个)中目镜测微尺范围(132μm)内颗粒细胞数。
结果本胶囊0．28、0．56g／kg对小鼠尾部颗粒细胞的生成具有明显促进作用(P＜0．05、0．01)。0．56g／kg加光照组颗粒细胞增多，而且皮肤角化层也明显增厚。
(3)对小鼠T淋巴细胞DNA合成的影响方法昆明种小鼠70只，20-22g，雌雄各半。按性别、体重随机分为7组。空白对照组(同容积蒸馏水灌胃)，阳性药对照组(环磷酸胺15mg／kg腹腔注射)光照对照组*(同容积蒸馏水灌胃，并于2小时后接受日光照射20分钟，光照剂量8焦耳／cm2)，本胶囊小、大剂量加光照组*(胶囊剂量及光照条件同前)，每组10只。每日灌胃给药1次，灌胃容积为0．25ml／10g)，连续给药7日。末次给药并光处死，取脾脏。按ConA淋转试验3H-TdR掺入法测定掺入放射性强度(cpm)，以此反映DNA合成速率。
本胶囊用于临床治疗时，患者除服用药物外，还于服药后12小时接受日光照射20分钟，故在本试验中增设光照组及胶囊加光照组。
结果本胶囊0．56g／kg及0．28、0．56g／kg加光照者均可明显抑制ConA所致淋巴细胞DNA合成(P＜0．01或0．001)。加光照组其抑制作用有所增强。
结论本胶囊对表皮细胞增生模型(小鼠雌激素期阴道上皮细胞有丝分裂)具有抑制增生作用；对表皮细胞角化不全模型(小鼠尾表皮颗粒细胞生成)，具有促进角化作用；并对间接显示表皮细胞DNA合成的淋巴细胞3H-TdR掺入具有抑制作用，药后光照可增强其抑制作用。综上，本胶囊可减轻或可逆转银屑病病理改变。
权利要求
1.一种胶陀螺或其菌丝体人工培育方法，其特征在于a、进行菌种分离，从胶陀螺科真菌胶陀螺的整个子实体中分离出胶陀螺菌丝体，作为胶陀螺母种原种；b、进行一级菌种母种培养，采用加富培养基进行母种分离后转接，菌种萌发后沿培养基表面生长，形成明显菌落，菌落至少生长10天以上，作为胶陀螺菌种，上述加富培养基的重量份数配比为薯类 100-300 葡萄糖或蔗糖10-30维生素B1 5-15琼脂10-30水 1000方法是将薯类切成小条或薄片，放于锅中加水煮沸至著条熟而不烂，过滤，加维生素B1于滤液中，将滤液入于锅中，加糖和琼脂，用文火加热，搅拌，使琼脂溶化，加热水补足水分，趁热分装于培养器中；c、胶陀螺二级及三级培养，先制作培养基，灭菌后接种，培养温度为15-35℃，待长势良好，即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于培养基用玉米粒培养基，其重量份数配比为蒸熟玉米60-95，米糠10-30，石膏0．5-1．5，料水比为1∶1．5-2．0，灭菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于培养基用木屑培养基，其重量份数配比为硬杂木屑60-90，米糠或麦皮10-30，蔗糖0．5-1．5，碳酸钙或石膏粉0．1-1．5，料水比为1∶1．5-2．0，按配比称取原料，把糖加入水中，其他原料混匀，加入糖水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于培养基用玉米芯培养基，其重量份数配比为玉米芯60-95，米糖10-30，石膏0．5-1．5，料水比为1∶1．5-2．0，灭菌。
5.一种胶陀螺或其菌丝体的应用，其特征是将胶陀螺或其菌丝体药材用乙醇浸泡法提取其有效成分，回收乙醇，将该有效成分用于制作治疗银屑病、皮炎、白癜风或湿疹皮肤病的口服药物。
全文摘要
本发明涉及胶陀螺或其菌丝体人工培育方法及应用,首先从胶陀螺真菌胶陀螺子实体中分离出胶陀螺菌丝体,再采用加富培养基进行一级菌种因体培养;再在培养基上进行二级及三级培养,培养温度为15—35℃。其培养基可用马铃薯培养基、玉米粒培养基、木屑培养基及玉米芯培养基等。其培养工艺合理、生长快、产量高,首次解决了胶陀螺人工分离驯化栽培的难题。其胶陀螺或其菌丝体有效成分可用于制作治疗银屑病、皮炎、白癜风或湿疹等皮肤病的口服药物。
文档编号C12N1/14GK1279005SQ0012219
公开日2001年1月10日 申请日期2000年8月4日 优先权日2000年8月4日
发明者马哲, 刘宏伟, 宋华斌 申请人:河北万岁药业有限公司