专利名称：从微生物细胞中制取核酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备有机化合物的方法，具体地说是一种从微生物细胞中制取核酸的方法。
核酸是DNA和RNA的总称，是一切生命基因-细胞的核心物质，它决定着生物体的生长、发育、繁殖、遗传，以及人体的衰老和患病都是由于缺乏核酸使基因受损而致，世界卫生组织建议成年人每天应补充外源核酸1-1.5克，以促进正常的新陈代谢，延缓衰老，中国发明专利公开了一种制取核酸的方法，其专利申请号为94115437.8，名称为“从天然植物细胞中提取核酸的生产工艺”，它以脱脂大豆粕为原料，经过溶胀、匀浆制备、细胞裂解、溶剂抽提、透析处理等生产工艺制得核酸提取液和核酸纯化干品，其不足是利用化学试剂如酚或乙醇抽提，提取液需要进行透析处理，通常需要48-72小时，而且每隔6-8小时更换一次透析液，其生产周期长，成本高，有害液体的排放还会污染环境，不适合于工业化生产。
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种从微生物细胞中制取高纯度核酸原料的方法，其原料来源广泛、工艺简单、生产成本低、与人的基因相同缘，宜吸收且无毒害。
为达到上述发明目的，本发明可以通过以下措施来实现一种从微生物细胞中制取核酸的方法，主要包括如下工艺步骤1、基础原料及初加工选择以微生物-酵母细胞为基料，将其加工成为生物活性物，2、培养高核酸细胞将生物活性物-酵母基料进行稀释，稀释成稠粥状稀释液，对稀释液中的酵母细胞植入动物胎体的细胞基因，进行细胞培养，使稀释液中酵母细胞核酸的含量增高，得到高核酸基料，3、细胞的裂解往高核核酸基料中加入含有0.1M-0.25M的氯化钠溶液进行稀释，在稀释液中加入适量的碱调整PH值，使之PH在8-12之间，然后在90℃-100℃的条件下蒸煮2-4小时，再以10000转/分-12000转/分的速度在匀浆机中进行匀质、裂解40分钟-60分钟，同时进行高温灭菌，得到核酸裂解液，3、提取核酸采用分离、浓缩、压滤的力法从核酸裂解液中提取核酸制品。
本发明还可以通过以下措施来实现用弱酸调节核酸裂解液的PH值，使之PH值在6-8之间，然后输入离心机以1000转/分-3000转/分的转速离心15分钟-30分钟，所得上部液态即为核酸提取液，将核酸提取液加入饱和硫酸铵进行稀释，核酸提取液与饱和硫酸铵的比例为1∶8-16，然后离心10分钟-20分钟，以除去蛋白质，在去除蛋白质的液态核酸中加入助滤液-氯化钠，使液态核酸中氯化钠的含量为3M-6M，再离心10分钟-20分钟，在所得沉淀核酸中加蒸馏水稀释，两者的比例为1∶1-2，然后用生物膜真空抽滤除去氯化钠，将去除氯化钠的核酸液进行干燥，所得制品即为纯净核酸原料。
本发明还可以通过以下措施来实现采用压滤方法过滤核酸裂解液，提取纯核酸，核酸裂解液经上述蒸煮步骤后，其粘度比较大，固体颗粒已相当小(＜5um=，在压滤机过滤核酸裂解液之前，清洗并装好滤布，助滤液的每次用量为压滤机容积的2-3倍，开始泵入裂解液，为了使裂解液粘度变得较小，泵入核酸裂解液的温度一般控制在50℃-90℃，为了保证滤速和滤量，泵压一般控制在0.1-0.5Mpa。过滤结束时，在滤板和隔膜之间通入压缩空气，压力为0.3-0.7Mpa，通过压缩空气来压榨滤饼，将液体核酸挤压出来，关闭空压机，打开压滤机，卸出滤饼，滤饼的含水量一般为50％左右，滤饼经烘干粉碎是含50％以上的蛋白质，可进一步加工成蛋白粉氨基酸等，压滤机将挤压出来的液体为液态核酸，提纯核酸在等电点罐沉淀工艺中进行，A、核酸在等电点罐沉淀之前，须将液态核酸进行降温，温度一般应控制在4℃-16℃之间，B、等电点罐是具有隔热性能的保温罐，首先缓慢搅拌液态核酸，按液态核酸的重量加入0.1-1％的氯化钙或氯化钙溶液，使之充分溶解混合，然后缓慢加入硫酸(浓度3-6M)，使分离液的PH值在2-3之间，此时产生大量絮状核酸的沉淀物，停止搅拌，保温静止，C、排放上清液，等电点罐中液态核酸，调节等电点并静止6小时以上，固体和液体自动分离，排出上清液，沉淀物即为湿核酸，D、酒精清洗湿核酸，湿核酸中含有大量的水分及杂质，此过程加入2-3倍湿核酸体积的高浓度酒精(酒精度＞80％)，开启搅拌机，用酒精对湿核酸进行脱水及溶出杂质，搅拌20分钟后停止搅拌，静止4小时以上，使酒精与核酸自然分离，E、酒精的回收，待酒精与核酸自然分离后，放出酒精上清，因该酒精已被稀释，可在酒精回收塔中重新浓缩，使酒精循环使用，F、核酸干燥粉碎，经酒精脱水清洗的核酸放入干燥盘，在干燥室中85℃烘干，冷却后用粉碎机粉碎即为成品核酸。
本发明与现有技术相比具有如下特点1、采集饮、食品工厂排放的酵母为原料，加工成为生物活性固体状物；将活性酵母基料稀释，进行细胞培养，使其核酸的含量增高，经高温、高速匀质等物理方法进行细胞与核蛋白的裂解，对核酸大分子进行物理与化学的切割，其原料来源广泛、工艺简单、适合工业化生产。
2、在整个生产过程中，不需添加有害的化学试剂进行抽提、透析，不会污染环境，还可保留微生物本身营养成分，其基因又与人体生命的基因相同，吸收率可达99％以上，宜于推广和使用。
3、在等量原料中提取的纯核酸是现有技术的4-5倍，制得核酸纯度高，生产成本低。
4、原料来源于酒厂和食品生产厂，已经进行了卫生免疫的前处理，经过二次酵母培养和提纯，卫生标准高于现有技术的产品，无任何直接和间接的毒副作用，并且原料属二次利用，来源广泛、价格便宜，设备投资小，生产工艺简单，产品成本低。物理离心提取和金属离子及等电点沉淀两种方法共用，使核酸的提取率和产品纯度大幅度提高；工艺稳定，操作简单，适宜大规模工业化生产。
实施例1将固体状物的生物活性酵母基料进行稀释，在稀释液中对酵母基料植入从动物胎体中精选优质健壮的种细胞进行培养，使其核酸的含量增高，将稀释发酵生产的高核酸酵母10吨(含干物质10％)放入配料池，开启搅拌机，缓慢加入1吨含有0.1-0.25M的氯化钠并使之溶解混匀，在搅拌中加入氢氧化钠调PH值在9-11之间，采用高温蒸煮，停止搅拌。用泵泵入蒸煮罐，在圆形蒸煮罐的下方沿切线方向通入蒸汽加热，待加热至95℃时，关小蒸汽阀门使之保温4小时。酵母细胞的裂解率大于90％，然后以10000-12000转/分的速度在匀浆机中进行匀质、裂解40-60分钟，以加速细胞与核蛋白的裂解并加强了对核酸大分子的切割，促进蛋白质的水解，同时进行高温灭菌。
所得裂解液用盐酸调PH值至7，然后输入离心机并以3000转/分的转速离心15分钟，所得上部液态即为食用核酸提取液；取液态核酸以1∶10的比例饱和硫酸铵混合稀释，然后离心10-20分钟，在去除蛋白质的液态核酸中加入氯化钠为助滤液，使液态核酸中氯化钠的含量为4.5M，离心10-20分钟，在所得沉淀核酸中加蒸馏水稀释，两者的比例为1∶1.2，然后用生物膜真空抽滤除去氯化钠，将去除氯化钠的核酸液进行干燥，所得制品即为纯净核酸原料，经测定计算，核酸的收率为干酵母重的5.2％，对核酸的总提取率为81.7％，核酸纯度84％。纯净核酸原料中含核酸可达95％以上。
实施例2将发酵生产的高核酸酵母10吨(含干物质10％)放入配料池，开启搅拌机，缓慢加入1吨食盐并使之溶解混匀，停止搅拌，用泵泵入蒸煮罐，在圆形蒸煮罐的下方沿切线方向通入蒸汽加热，待加热至95℃时，关小蒸汽阀门使之保温4小时。
在溶积为1立方米的双面充气板框式压滤机上装好隔膜、隔板、滤布(滤布型号为610)并连接好充气管线。在助滤液勾兑池中加入2立方米清水，搅拌混合均匀，一边搅拌，一边泵入压滤机，此时从压滤机中流出清水，泵完2立力米助滤液为止。将蒸煮液预冷至80℃左右，在泵完助滤液后泵入蒸煮液，泵入压力开始时要低，控制在0.2MPa左右，压力的控制是由节流阀控制液体的回流与进入压滤机的比例来实现，随着压滤机内滤饼的形成，压力会逐渐增大，控制节流阀使之不要超过0.5MPa。泵入8-10立方米蒸煮液后(时节间为3小时)，停止泵液，开启空气压缩机，向橡胶隔膜中泵入空气，空气压力控制在0.6MPa待压滤机没有液体流出后(冲气时间约为20分钟)，关闭空压机，打开压滤机，卸出滤饼，滤饼的含水量一般为50％左右。滤饼经烘干粉碎是富含50％以上的蛋白质，可进一步加工成蛋白粉氨基酸等。
从压滤机过滤出的分离液流入预贮藏，在预贮罐中冷却至自然气温，然后开启制冷机组及换热器，分离液的冷却温度通过调节换热器中的冷却液和分离液的节流阀的节流阀来实现，分离液在换热器中出口温度为8℃然后流入等电点罐。分离液冷却注入等电点罐的体积是9.2立方米，开启等电点罐的搅拌机，加入含氯化钙20％的氯化钙溶液300公斤，测定等电点罐中的PH值，缓慢慢加入30％的H2SO4使PH值逐渐降低，直至PH值为2.2时停止加入H2SO4，此时产生大量的絮状核酸，停止搅拌，保温静止8小时，使絮拜谢核酸自然沉淀。打开等电点罐上清液放出阀放出上清液，上清液放出阀直通等电点罐内部并具有弯形导管结构，通过调节弯形导管的角度达到控制放出上清液的液位，直至上清液基本排出。关闭上清液放出阀，向等电点罐注入2立方米的95％的工业酒精，再次开启搅拌机，搅拌20分钟，关闭搅点注入2立方米的95％的工业酒精，再次开启搅拌机，搅拌20分钟，关闭搅拌机，静止4小时，打开上清液放出阀放出酒精上清。将等电点罐中经酒精脱水清洗的核酸沉淀装入干燥盘。干燥盘放入干燥室，85％拱干10小时，将干燥盘搬出预冷并将核酸掰至块状。块状核酸经粉碎机粉碎后包装即为成品核酸粉。经测定计算，核酸的收率为干酵母重的8.2％，对核酸的总提取率为92％，核酸纯度95％。
权利要求
1.一种从微生物细胞中制取核酸的方法，其特征在于采用如下工艺步骤(1)基础原料及初加工选择以微生物-酵母细胞为基料，将其加工成生物活性物，(2)培养高核酸细胞将生物活性物-酵母基料进行稀释，并对稀释液中的酵母进行细胞培养，使稀释液中酵母细胞的核酸含量增高，得到高核酸基料，(3)细胞的裂解往高核酸基料中加入含有0.1M-0.25M的氯化钠溶液进行稀释，在稀释液中加入适量的碱调整PH值，使之PH在8-12之间，然后在90℃-100℃的条件下蒸煮2-4小时，再以10000转/分-12000转/分的速度在匀浆机中进行匀质、裂解40-60分钟，同时进行高温灭菌，得到核酸裂解液，(4)提取核酸采用分离、浓缩、压滤的方法从核酸裂解液中提取核酸制品。
2.根据权利要求1所述的一种从微生物细胞中制取核酸的方法，其特征在于所说的提取核酸的方法是用弱酸调核酸裂解液的PH值，使PH值在6-8之间，然后输入离心机以1000-3000转/分的转速离心10-30分钟，所得上部液态即为食用核酸提取液。
3.根据权利要求1、2所述的一种从微生物细胞中制取核酸的方法，其特征在于所说的提取核酸的方法是将核酸提取液加入饱和硫酸铵进行稀释，核酸提取液与饱和硫酸铵的比例为1∶8-16，然后离心10-20分钟，以除去蛋白质，在去除蛋白质的液态核酸中加入助滤液-氯化钠，使液态核酸中氯化钠的含量为3M-6M，再离心10-20分钟，得到沉淀核酸，在沉淀核酸中加入蒸馏水进行稀释，两者的比例为1∶1-2，然后用生物膜真空抽滤除去氯化钠，将去除氯化钠的核酸液进行干燥，得到核酸制品。
4.根据权利要求1所述的一种从微生物细胞中制取核酸的方法，其特征在于所说的提取核酸方法是用压滤方法过滤核酸裂解液，核酸裂解液的温度为50℃-90℃，过滤核酸裂解液过程中采用清水为助滤液，过滤后将液体核酸挤压出来。
5.根据权利要求1、4所述的一种从微生物细胞中制取核酸的力法，其特征在于所说的提取核酸方法是将压滤出来的液态核酸进行提纯，提纯核酸在等电点罐沉淀中进行，核酸在等电点罐沉淀之前，须将液态核酸降温，温度应控制在4-16℃之间，并搅拌液态核酸，然后加入浓度为3M-6M的硫酸，得到分离液，使分离液的PH值在2-3之间，当产生大量絮状核酸的沉淀物时，应停止搅拌，保温静止，等电点罐中液态核酸，经调等电点静止6小时以上，固体和液体自动分离，排出上清液，沉淀物即为湿核酸。
6.根据权利要求1、4、5所述的一种从微生物细胞中制取核酸的方法，其特征在于所说的提取核酸方法是采用酒精清洗湿核酸，加入2-3倍湿核酸体积的高浓度酒精，搅拌15-25分钟，再静止4小时以上，待酒精与核酸自然分离后，放出酒精上清液，并进行干燥制成纯核酸。
全文摘要
本发明公开了一种从微生物细胞中制取核酸原料的方法,其工艺步骤分别是基础原料及初加工;培养高核酸细胞;细胞的裂解;提取核酸,本发明具有原料来源广泛,其基因又与人体生命的基因相同,吸收率可达99%以上,宜于推广和使用,制得核酸纯度高,生产成本低,无任何毒副作用,设备投资小,生产工艺简单,工艺稳定,操作简单,适宜大规模工业化生产。
文档编号C12P19/00GK1308130SQ0012944
公开日2001年8月15日 申请日期2000年12月26日 优先权日2000年12月26日
发明者李永武 申请人:李永武