专利名称：一种蓝藻穿梭质粒表达载体及其用于表达胸腺素α1的方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程。
蓝藻(Cyanophyte)又称蓝细菌(Cyanobacterium)，是一种特殊的微生物。蓝藻的基因组简单，除了裸露的染色体DNA外不含叶绿体和线粒体DNA，便于进行基因分析。近年来，已克隆了大量蓝藻基因，建立了一些蓝藻的基因转移系统以及外源基因表达系统。蓝藻作为表达外源基因的受体菌已取得了不少研究成果。
由于蓝藻质粒属于隐秘型质粒，无可供利用的选择性标记，又不能在E.coli中复制，所以无法直接用作基因工程的载体。而细菌的一些质粒或人工构建的很多载体虽有选择性标记，但不能在蓝藻中复制维持或转化效率极低。因此，将蓝藻内源质粒与E.coli质粒及其衍生的质粒载体重组构建穿梭载体(Shuttle vector)就成为蓝藻遗传操作的基本途径。这种杂合质粒含有两个复制起始位点，分别来自蓝藻质粒和大肠杆菌质粒，能在这两种生物中复制，便于利用二者的优势进行遗传操作。到目前为止，已构建的蓝藻穿梭质粒载体主要有pLS103、pBAS系列、pCB4、pPRS-1等。而利用穿梭质粒转化系统则可在蓝藻中表达包括真核基因在内的外源基因，如Tandeau de Marsac(Mol.Gen.Genet1987，209296～298)以pUC303为载体，在单胞蓝藻Synechococcus sp.PCC7942中表达了原核基因芽孢杆菌杀幼蚊毒素基因，转基因藻株普遍具有良好的杀幼蚊毒性，为蚊虫的生物防治开辟了新的途径。Fukuda等人(Biotech，Lett.1994，161～6)以pUC303为载体在Synechococcus sp.PCC 7942中表达了植物的乙烯合成酶基因。孙军等(生物工程进展，1994，14(6)39～42)将小鼠金属硫蛋白-I(mMT-I)cDNA基因片段与穿梭质粒pDC-8重组在固氮丝状蓝藻Anabaena sp.PCC7120中表达了金属硫蛋白，表达量约为40μgMT/g藻鲜重；Price等人(Plant physiol.1989，91505～513)通过穿梭表达载体pCA在蓝藻Synechococcus PCC7942中表达了人的碳酸酐酶基因，表达产物具有活性，并对细胞的光合作用产生了显著影响。Takeshima(Proc.Natl.Acad.Sci.USA1994，919685～9689)把合成的人过氧化物歧化酶(hSOD)基因置于1，5-核酮糖二磷酸羧化酶基因(rbc)的启动子下，在Synechococcus sp.PCC6301中表达，表达产物达总蛋白的3％，并在胞内具有良好的生物活性。
胸腺(Thymus)是免疫系统中重要的中枢器官，负责T细胞的分化和成熟，在抗感染、抗肿瘤和抗自身免疫性疾病中起着重要作用。从胸腺素混合物中分离出的胸腺素α1(Tα1)，是一个二十八肽，它可以预防免疫抑制病人感染条件致病菌，提高机体的细胞免疫能力，可用于治疗多种疾病如红斑狼疮、乙肝、艾滋病等，还可作为治疗某些癌症的辅助药物。现在胸腺素制剂已广泛应用于临床，但均是从猪、牛的胸腺中提取的多组分胸腺肽，提取时易混入猪、牛的某些蛋白，注射后可能导致人产生过敏反应。采用人胚胎提取的人胸腺素虽疗效不错，但人胚胎来源困难，难以形成规模生产。用多肽合成仪可合成胸腺素α1，但价格太贵。王震熙等(浙江医科大学学报，1989，18(3)106～109)把Tα1基因导入PWR590菌株，用SPA-ELISA改良法在转化的菌株中检测到Tα1的表达；Wetzel等(Biochemistry1980，196096～6104)根据Low和Goldstein(1979)确定的氨基酸序列人工合成了Tα1基因，与质粒pBR322连接后导入E.coli中表达，虽得到与天然Tα1活性相同的表达产物，但表达量低。
本发明的目的旨在构建一种新的蓝藻穿梭质粒表达载体，该载体上有大肠杆菌源质粒和蓝藻源质粒的复制起始位点，能在这两种宿主中复制，具有选择标记、启动子、终止区等表达元件，可作为外源基因在蓝藻中表达的表达系统；另外，本发明还提供一种运用穿梭质粒表达载体系统，将泛素融合的胸腺素α1基因插入新构建的穿梭表达载体，将获得的含目的基因的重组质粒转化进单胞蓝藻中以高效得到含胸腺素α1的表达产物的方法。
下面为本发明的具体内容。
一、蓝藻穿梭表达载体的构建本发明从织线藻Plectonema boryanum中提取出内源小质粒pPBS1，并对其序列进行测定，测出的序列已收入于DNA数据库，编号为Genbank Accession No.AF176225，其序列如下1 cgattctggg aaagctcatc tactgcccaa agcgtggtat ttctgcaccc aagttttgct61 tgagcgtata aaaaaggcga ctagggtcgt cagcggaaat ttagcacacg aaatatacga121 acacgtacta tctcacgcta ccgagtacct aaactaccat cggaatataa aggcaaaatg181 ctccgatggg cgggaaataa cggttggatg gtatggatac ctgacaaagc gaggtatgca241 ggaattaggg aaacctctgg gtgtggtcta gggggcagtc ccctctggga gatttagacg301 caccgtcgct gttaacaaca gccatgcgaa gcctagcata ctccggcaaa ttacggatgc361 tgcgatcgca ctggttggaa ccaataaggc tgtaaccctc tatctgttaa gtgatcgagg421 gtgttaggta ctgctgtcaa ggacggagcg aagcgaagcc gaagggtatc cttagcagca481 atacctaaca ccctaaaacc cgttcagata gagggttaca gacgttcaga aaagtattgc541 aagacatgaa aataggggct atgctagccc ctatcaaata agtgtttttc caatgaacaa601 cctaatcact ttgtgcgatc gcacagagaa cctttaccga tcggtaaggg ggcattcatg661 gatttgatta aagtctaccc ctgtgggcaa ataacagcaa gttcgcagcg tagattcacc721 cctgagcctc taccgaggga gaaaaaactc actgtagatg aagcattcaa cctttcggca781 ctgaaatcat tcggctatga acgcgcccgt gagattctgc aagccgaagg ctaccttggt841 ttatcaaagc ccgctaaatc ggagaaaacc aaaaaaccga ggggacagaa gggaataact901 tcccacggtc gccgcattat tcgtggggga gtgacattgc ttgagcgtac atacggacgt961 aacaggctgt cgtttatcac tctgactctg cctccagcgg tcgctgaaga tttgagtggg1021 cggtgggcac atgtggtcga tttgatgaaa cggcggctca tctactccaa tggactgcat1081 gggctaccca ccgagataat agcgtgtact gaggttcaag agaagcggta tgaaagaact1141 ggtgaagttg ccttgcactt gcacattgtc atggtcggac ggcatagtag aggagcttgg1201 tgctatagtc ctagacagtt ggaaaaaatg tggagtgaat gctgcgaaac tgccgtcagg1261 aatgttattg agccaaacga gagagttact agcagagtta ctaatagtag aactgagagt1321 gaatctaacg gaaatggaaa cgctactggt aatacaagca gcaatgcaaa tagcaatgga1381 aatgctaatg ggaatataca tacggaagtg aattggaatg cagcggtaaa tgtgcaaagg1441 atcaaaaaat ctgcatctgc atacatgggg aaatatctat ctaagggaac gcaaacgaca1501 cagaaaatta t
该小质粒DNA序列全长1511bp，GC含量为47.1％。常用的限制性内切酶酶切位点有Acc I(840)，AccⅡ(713)，Alu I(321和1502)，Cla I(3)，Hpa I(1203)，HpaⅡ(1171)，Pvu I(877、899和1152)，Taq I(3、477和1099)。
将质粒pPBS1克隆进质粒pBR322的Cla I位点上，构建成穿梭质粒载体pPRS-1；为了降低所构建的穿梭表达载体的大小，提高载体容纳外源DNA片段的能力，按
图1设计，用EcoRV、PvuⅡ双酶切质粒pPRS-1，电泳回收3.97kb的EcoRV-PvuⅡ大片段，然后用T4DNA连接酶进行平端连接，连接物转化受体菌E.coli JM101，在Apr板上筛选转化子，得质粒pPRS-1’；按图2设计，用EcoR I和Sal I双酶切含有启动子、终止区、报告基因等部件的质粒pKYLX-71-35S，电泳分离、回收含CaMV 35SRNA启动子、MCS、rbcS polyA终止区和Kmr基因的6.5kb片段，与经同样双酶切、电泳回收纯化的pEBFP2.6kb片段连接重组，连接物转化E.coli JM101，在含Km和Ap的固体培养基上筛选双抗克隆子，得质粒pKE；按图3设计，用EcoR I和Pst I完全双酶切pPRS-1′，电泳回收含蓝藻内源质粒和大肠杆菌质粒ori区的3.1kb的酶切片段，用EcoR I完全酶切质粒pKE，再用Pst I部分酶切，电泳回收含表达元件和Kmr基因的6.5kb片段，将回收的两片段用T4DNA连接酶连接，连接物转化受体菌E.coli JM101，以Km进行筛选得穿梭表达载体质粒pPKE2，在此载体上组装有大肠杆菌源质粒和蓝藻质粒的复制起始位点，卡那霉素抗性选择标记以及能启动基因转录的CaMV35SRNA启动子、多克隆位点、终止区等部件。
二、含UBTα1基因的重组质粒的构建根据Tα1基因片段两端的序列设计一对PCR引物T1和T2，进行PCR扩增，得110bp的DNA片段；运用pUC18多克隆位点两端的通用引物U1和U2，以含有人工合成的泛素基因(UB)克隆至pUC18质粒的SphI/BamHI位点之间所构建的质粒pUCUB为模板，按常规PCR方法扩增出含UB基因的328bp的DNA片段；纯化328bp的UB DNA片段和110bp的Tα1DNA片段，用BamHI同时酶切，然后用T4DNA连接酶连接，以连接产物为模板，以U1和T2’为引物进行特异性扩增，得380bp的UBTα1DNA片段；纯化PCR扩增的UBTα1DNA片段，按图4设计，用HindⅢ和Spe I双酶切UB Tα1扩增片段，与用HindⅢ部分酶切、XbaI完全酶切的新构建的蓝藻穿梭质粒表达载体pPKE2连接，连接物转化E.coli JM109，在卡那霉素抗性平板上筛选转化子，得重组质粒pPKEUT。 ACAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’(2)UB引物U1(5′端引物)5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’U2(3′端引物)5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’(3)UBTα1引物 三、重组质粒pPKEUT转化受体蓝藻Synechococcus sp.PCC7942用重组质粒pPKEUT天然转化受体蓝藻Synechococcus sp.PCC7942，转化后，将蓝藻细胞与DNA混合液涂布于Millipore滤膜上，先在不含Km的BG-11固体培养基上恢复培养20hr，然后转移滤膜至含Km12～15μg/ml的BG-11固体培养基上进行筛选培养，7～10天后转化单藻落出现。经Southern杂交证实，目的基因UBTα1基因已转入蓝藻Synechococcussp.PCC7942细胞中。用Western印迹法检测到了Tα1的表达产物。
本发明以从织线藻Plectonema boryanum中提取出的内源小质粒pPBS1构建了一新的蓝藻穿梭表达载体pPKE2，该载体上有大肠杆菌源质粒和蓝藻源质粒的复制起始位点，能在这两种宿主中复制，具有卡那霉素抗性选择标记、及能启动基因转录的CaMV 35SRNA启动子、多克隆位点、rbcS polyA终止区等表达元件，便于目的基因的插入、表达及重组子的筛选，不仅可用于研究胸腺素α1在蓝藻中的表达，也可用于研究其他基因在蓝藻中的表达，即可作为外源基因在蓝藻中得以表达的载体系统。本发明利用泛素融合系统，将目的基因Tα1和泛素(UB)融合后插入穿梭表达载体pPKE2的多克隆位点，获得了含目的基因的重组表达质粒，并成功地转化进单胞蓝藻Synechococcus sp.PCC7942细胞中，经Southern杂交证实和Western印迹法检测到了Tα1表达产物，其表达效果好，成本低，具有很大的开发前景，为开发研究转Tα1基因蓝藻打下了基础。
图1为质粒pPRS-1’构建示意2为质粒pKE构建示意3为质粒pPKE2构建示意4为质粒pPKEUT构建示意图下面通过实施例对本发明作进一步说明。实施例1、蓝藻穿梭质粒表达载体的构建本发明从织线藻Plectonema boryanum中检测到一种1.5kb的小质粒pPBS1，并对它进行了序列测定(已被DNA数据库收入，Genbank Accession No.AF176225)，并使用DNASIS(Version7.05)软件(Pharmacia LKB Biotechnology)对序列进行分析，其序列如下1 cgattctggg aaagctcatc tactgcccaa agcgtggtat ttctgcaccc aagttttgct61 tgagcgtata aaaaaggcga ctagggtcgt cagcggaaat ttagcacacg aaatatacga121 acacgtacta tctcacgcta ccgagtacct aaactaccat cggaatataa aggcaaaatg181 ctccgatggg cgggaaataa cggttggatg gtatggatac ctgacaaagc gaggtatgca241 ggaattaggg aaacctctgg gtgtggtcta gggggcagtc ccctctggga gatttagacg301 caccgtcgct gttaacaaca gccatgcgaa gcctagcata ctccggcaaa ttacggatgc361 tgcgatcgca ctggttggaa ccaataaggc tgtaaccctc tatctgttaa gtgatcgagg421 gtgttaggta ctgctgtcaa ggacggagcg aagcgaagcc gaagggtatc cttagcagca481 atacctaaca ccctaaaacc cgttcagata gagggttaca gacgttcaga aaagtattgc541 aagacatgaa aataggggct atgctagccc ctatcaaata agtgtttttc caatgaacaa601 cctaatcact ttgtgcgatc gcacagagaa cctttaccga tcggtaaggg ggcattcatg661 gatttgatta aagtctaccc ctgtgggcaa ataacagcaa gttcgcagcg tagattcacc721 cctgagcctc taccgaggga gaaaaaactc actgtagatg aagcattcaa cctttcggca781 ctgaaatcat tcggctatga acgcgcccgt gagattctgc aagccgaagg ctaccttggt841 ttatcaaagc ccgctaaatc ggagaaaacc aaaaaaccga ggggacagaa gggaataact901 tcccacggtc gccgcattat tcgtggggga gtgacattgc ttgagcgtac atacggacgt961 aacaggctgt cgtttatcac tctgactctg cctccagcgg tcgctgaaga tttgagtggg1021 cggtgggcac atgtggtcga tttgatgaaa cggcggctca tctactccaa tggactgcat1081 gggctaccca ccgagataat agcgtgtact gaggttcaag agaagcggta tgaaagaact1141 ggtgaagttg ccttgcactt gcacattgtc atggtcggac ggcatagtag aggagcttgg1201 tgctatagtc ctagacagtt ggaaaaaatg tggagtgaat gctgcgaaac tgccgtcagg1261 aatgttattg agccaaacga gagagttact agcagagtta ctaatagtag aactgagagt1321 gaatctaacg gaaatggaaa cgctactggt aatacaagca gcaatgcaaa tagcaatgga1381 aatgctaatg ggaatataca tacggaagtg aattggaatg cagcggtaaa tgtgcaaagg1441 atcaaaaaat ctgcatctgc atacatgggg aaatatctat ctaagggaac gcaaacgaca1501 cagaaaatta t测序结果看出，该小质粒DNA序列全长1511bp，GC含量为47.1％。常用的限制性内切酶酶切位点有Acc I(840)，AccⅡ(713)，Alu I(321和1502)，Cla I(3)，Hpa I(1203)，HpaⅡ(1171)，Pvu I(877、899和1152)，Taq I(3、477和1099)。计算机分析结果揭示，在位置567-1460之间存在着多个重复序列。在该区中有一个13bp的重复序列(567-1448)、一个11bp的重复序列(892-1145)、一个10bp的重复序列(686-1051)和六个8bp的重复序列(1227-1255、1056-1183、986-1008、862-1239、779-1371、648-771)。分析pPBS1整个序列的发夹结构，发现能量最高的发夹结构在567-1460之间，位置处于945-961，其GC％高达70.6％，且该发夹上下游均为富含AT区，AT含量均在80％以上；此外，在该发夹结构的上游还可找到一个共有序列5’-TTGATA-3’，该共有序列是复制有关的Rep蛋白的靶序列，它可在5’-G↓ATA间产生缺刻。通过分析结果推测，pPBS1质粒的复制起始区位于567-1270之间，因此选用Cla I位点来构建穿梭载体不会破坏该质粒在蓝藻中的复制能力。
将质粒pPBS1克隆进质粒pBR322的Cla I位点上，构建成穿梭质粒载体pPRS-1；为了降低所构建的穿梭表达载体的大小，提高载体容纳外源DNA片段的能力，首先对5.8kb的穿梭质粒pPRS-1进行改造。如
图1设计，在不影响质粒穿梭功能的前提下，用EcoRV、PvuⅡ双酶切5.8kb的穿梭质粒pPRS-1，电泳分离3.97kb和1.9kb的大小两片段，胶回收3.97kb的EcoRV-PvuⅡ大片段，然后用T4DNA连接酶进行平端连接，连接物转化受体菌E.coli JM101，在Apr板上筛选转化子。使用EcoRI、HindⅢ对转化子的质粒进行酶切鉴定，发现所获得的酶切片段大小比原pPRS-1被EcoR I单切的片段小，约为3.97kb；用Cla I酶切可获得两个片段，一个为1.5kb(蓝藻内源质粒)，一个为2.47kb(含Apr基因和大肠杆菌质粒复制起始位点)，大小与预期相符，表明该质粒即为改造设计的更小的穿梭质粒pPRS-1’，大小为3.97kb，同时具有大肠杆菌和蓝藻的复制起始子。再按图2设计，用EcoR I和Sal I双酶切质粒pKYLX-71-35S，电泳分离、回收含表达元件和Kmr基因的6.5kb片段，然后与经同样双酶切、电泳回收纯化的pEBFP2.6kb片段连接重组，连接物转化E.coli JM101，在含Km和Ap的固体培养基上筛选双抗克隆子，提取质粒进一步用内切酶酶切分析，该质粒可被Xba I酶切成9.1kb大小的片段，这恰为原2.6kb片段和6.5kb片段之和；用EcoR I和Sal I双酶切该质粒，可切出一条6.5kb的片段和一条2.6kb的片段；另外，按预先设计，在质粒pEBFP、pKYLX-71-35S的回收片段上各有一个PvuⅡ酶切位点，而该质粒也恰能被PvuⅡ酶切成两个片段，片段大小也与预期相吻合，一个为6.4kb，一个为2.7kb。因此，该质粒为预期设计的质粒pKE，含有CaMV 35S RNA启动子、MCS、rbcS polyA终止区和Kmr基因诸元件。
按图3设计，用EcoR I和Pst I完全双酶切pPRS-1′，电泳回收含蓝藻内源质粒和大肠杆菌质粒ori区的3.1kb的酶切片段；用EcoR I完全酶切质粒pKE，再用Pst I部分酶切，电泳回收含表达元件和Kmr基因的6.5kb片段。然后将回收的两片段用T4DNA连接酶连接，连接物转化受体菌E.coli JM101，以Km进行筛选。挑取抗性克隆子，对克隆子质粒进行限制性内切酶酶切分析鉴定。酶切结果显示重组质粒可被Xba I单酶切成一个片段(9.6kb)，被EcoR I和Sal I双酶切成两个片段(6.5kb和3.1kb，分别来自pKE和pPRS-1′)；被EcoR I和Xba I双酶切成两个片段(8.3kb和1.3kb)，其中1.3kb为CaMV 35SRNA启动子；被ClaI酶切成三个片段(1.5kb、2.0kb和6.1kb)，其中1.5kb片段为蓝藻的内源质粒，2.0kb片段上含有35S启动子、MCS和rbcS polyA终止区。均与预期相符，从而可确定穿梭表达载体pPKE2克隆成功，在此载体上组装有大肠杆菌源质粒和蓝藻质粒的复制起始位点，卡那霉素抗性选择标记以及能启动基因转录的CaMV 35SRNA启动子、多克隆位点、终止区等部件。实施例2、含UBTα1基因的重组质粒的构建及表达胸腺素α1的方法步骤1．胸腺素α1基因(110bp)的PCR扩增首先按Tα1基因的序列设计了PCR引物T1、T2和T2’ 取T1和T2引物各2ul，加ddH2O至10ul，再加石蜡油30ul；先升至85℃，5min然后以1℃/1min的速度冷却至25℃；再依次加入ddH2O 30ul，10×Taq酶缓冲液5ul，4×dNTP(2.5mmol/L)4ul，Taq酶(1u/ul)1ulPCR反应参数先94℃预变性5min；接着94℃变性30S；60℃复性兼延伸20S；10个循环；最后60℃再延伸反应20S。反应结束后，取3ul进行2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得110bp的Tα1片段。
步骤2．UB片段(345bp)的PCR扩增除模板改为质粒pUCUB(人工合成UB基因并将其克隆至pUC18质粒的SphI/BamHI位点之间所构建成的质粒)，引物改为U1(通用引物M13/pUC Reverse SequencingPrimer(-48))和U2(通用引物M13/pUC Sequencing Primer(-47))外，其余反应组分同步骤1；PCR反应参数先94℃预变性5min；接着94℃变性30S；50℃复性30S；72℃延伸30S；30个循环；最后72℃再延伸反应3min。反应结束后，取5ul进行2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得345bp的UB片段。
步骤3．UBTα1片段(388bp)的PCR扩增用BamHI酶切Tα1和UB片段后连接，再以上述连接物为模板，以U1和T2’为引物扩增获得UBTα1片段。
UBTα1片段的PCR反应，除模板改为UB与Tα1之连接物，引物改为U1和T2’外，其余反应组分及反应参数同步骤2。
步骤4．目的基因UBTα1片段插入穿梭表达载体纯化PCR扩增的UB Tα1基因片段，根据预先引物设计，该片段两端分别具有HindⅢ和Spe I酶切位点，而穿梭表达载体pPKE2的多克隆位点上有HindⅢ和Xba I酶切位点。因此，按图4设计，用HindⅢ和Spe I双酶切UB Tα1扩增片段，与用HindⅢ部分酶切、XbaI完全酶切的pPKE2连接。连接物转化E.coli JM109，在卡那霉素抗性平板上筛选转化子。挑取若干转化子，提取质粒并进行酶切分析鉴定，对Xba I切不动的转化子质粒进一步进行内切酶酶切鉴定，因为SpeI和XbaI是同尾酶，连接后两个酶切位点都消失了。结果该质粒可被EcoRI切成一个片段(9.71kb)，被BamH I切成两个片段(7kb和2.71kb)；用EcoRI和SphI双酶切可使原2.77kb片段消失，而切出一条1.3kb的片段和一条1.82kb片段。这些结果与预期设计相符，表明目的基因UBTα1已克隆进穿梭表达载体pPKE2的多克隆位点，该质粒为预期设计的重组质粒pPKEUT。
步骤5．重组质粒pPKEUT转化Synechococcus sp.PCC7942在最适条件下培养蓝藻Synechococcus sp.PCC 7942至OD730=0.25～0.35。离心收集藻细胞，用10ml 10mmol/L NaCl洗一次。离心并浓缩藻细胞于原1/10体积的新鲜BG-11培养基中。加入2-3μg重组质粒pPKEUT，混匀。避光孵育过夜，供随后筛选转化子。
将孵育后的蓝藻与DNA混合液涂布于覆盖在BG-11固体培养基上的Millipore滤膜(φ9cm，孔径0.45μm)上，正常生长条件下培养20hr。转移滤膜至含卡那霉素15μg/ml的BG-11固体培养基上，培养7-10天后转化单藻落出现，挑取生长好的藻落移入2ml BG-11液体培养基中(含10～15μg/ml卡那霉素)，经常摇动，培养7天。挑生长最好的藻株进行逐级扩大培养(加Km至15μg/ml)。
阴性对照组除不加质粒外，亦进行同样的转化处理。一周后，pPKEUT转化组的滤膜上出现抗Km的绿色单藻落，而未用质粒转化，但经同样处理的阴性对照组不长藻落。可以认为，转化组与对照组在15μg/ml Km筛选压力下出现的显著差异是由于重组质粒pPKEUT转入受体蓝藻细胞中造成的。实施例3、pPKEUT转化藻株的杂交鉴定为了进一步证明外源基因已通过重组质粒pPKEUT转化入蓝藻细胞中并且获得表达，进行了DNA水平的Southern杂交鉴定，及蛋白质水平的Western杂交检测。1．探针的制备以重组质粒pPKEUT中含Tα1基因和部分Kmr基因的2.7kb的BamH I片段为探针模板，用随机引物法制备DIG标记的探针。经与DIG标准标记物比较估算，制备的探针浓度约为30μg/μl。2．Southern杂交分别提取野生型Synechococcus sp.PCC7942及其转化藻株的质粒，进行Southern转移、探针杂交及显色，首先以0.7％的琼脂糖凝胶电泳分离Synechococcus sp.PCC7942的质粒DNA。电泳完毕后，修切凝胶块成所需大小，在左上角切角。将凝胶浸泡在变性缓冲液中，轻轻摇动15min。将凝胶浸泡在中和缓冲液中，轻轻摇动30min。准备一张与凝胶等大的尼龙膜，先浸入水中再浸在10×SSC缓冲液中。在一大培养皿中倒扣一小培养皿，上置一张滤纸，加入适量的10×SSC缓冲液，并使滤纸的四周垂入SSC溶液中。滤纸浸透后，倒置凝胶于滤纸上，再将切好并浸湿的尼龙膜小心地放在凝胶上，避免气泡，边界对齐；取与尼龙膜等大的滤纸置于其上，接着放置吸水纸并压一个平的重物。室温转移过夜，但注意更换湿透的吸水纸。揭下尼龙膜，在6×SSC缓冲液中浸泡一下。晾干后，80℃烘烤2hr，即可用于杂交。
将杂交膜放入杂交袋中，注入20ml杂交缓冲液，封口，置于68℃水浴轻摇30min，进行预杂交。沸水浴5min使DIG标记的DNA探针变性，并快速在冰浴中冷却，与杂交缓冲液混匀，使探针浓度为5～25ng/ml。倒去预杂交液，加入10ml DIG探针/杂交缓冲液，68℃水浴杂交16hr。杂交结合后，倒出杂交液回收，将杂交膜移入洗膜液I，室温下漂洗两次，各5min。再将杂交膜移至洗膜液Ⅱ，于68℃轻摇漂洗两次，各15min。
将杂交膜在杂交缓冲液1中短暂平衡2min。在50ml杂交缓冲液2中封闭30min。在20ml抗体反应液中结合抗体(anti-DIG-Ap)30min。用杂交缓冲液1洗2次，各15min。在杂交缓冲液3中平衡2～5min。最后浸在10ml染色液(新鲜配制)，暗处显色，勿摇。显色完毕后，漂洗，烘干，拍照。
结果显示转化藻株与阳性对照均出现杂交信号，而阴性对照藻株无杂交信号。3．pPKEUT转化藻株的Western印迹鉴定重组质粒虽已转化入受体蓝藻细胞中，但目的基因是否能表达尚不能确定，必须通过Wesstern印迹法对转化藻株进行表达产物的检测。本发明利用兔抗UB抗体和鼠抗Tα1抗体，检测pPKEUT转化藻株是否表达出了UBTα1融合蛋白。
首先制样离心藻体，置于一预先称重的0.5ml离心管中，称出藻体的重量，加入3倍量(V/W)的制样缓冲液(溶液1∶上样缓冲液=1∶1)，沸水浴5min，离心，取上清，置-20℃保存备用。
SDS-PAGE电泳分离蛋白质制胶配制15％的分离胶，5％的浓缩胶。
点样分别将转基因藻蛋白提取液、野生藻蛋白提取液、阳性对照样品沸水浴处理3min。取适量处理后的样品加入凝胶样品孔中，记录加样顺序。采用50V恒压电泳，待溴酚蓝泳动出浓缩胶后，电压增至100V，溴酚蓝泳动至凝胶边缘时停止电泳。
电转移电泳结束后，取出凝胶，浸泡于电转移缓冲液中。剪取与凝胶等大的PVDF膜，先在无水甲醇中浸泡一下，再放至转移缓冲液中。再剪6张与膜等大的滤纸，浸于电转移缓冲液中备用。将转移装置中的海绵置于电转移缓冲液中浸湿。将滤纸(3张)整齐置于海绵上，再依次放上凝胶、尼龙膜、滤纸(3张)，注意赶尽气泡，边界对齐，然后用海绵、筛孔板固定，插入电转移槽中，并加入电转移缓冲液，保证凝胶在阴极方向，PVDF膜在阳极方向。电转移条件为100Vlhr，4℃。取下胶和膜，倒扣于滤纸上，用铅笔在膜上描出胶上点样孔位置，揭去胶，取下膜。
免疫学检测将转移后的膜置于TNT缓冲液中洗3次。转入含1％BSA的TNT缓冲液中，37℃封闭30min，并轻轻摇动。将封闭后的膜置于TNT缓冲液中漂洗3次，每次5min。加入用TNT稀释的第一抗体(兔抗UB抗体)2ml，37℃轻摇1hr。将结合了第一抗体的PVDF膜置TNT缓冲液中洗3次，每次5min。加入用TNT缓冲液适当稀释的酶标第二抗体(羊抗兔IgG-HRP)，37℃轻轻摇动1hr。将PVDF膜用TNT缓冲液洗四次，每次5min。加入TMB底物，显色10-15min，出现蓝色带者为阳性，用自来水冲洗以终止酶反应，取出晾干保存。拍照。
对转基因藻株进行Western印迹鉴定，从免疫杂交结果来看，转基因藻株检测出了能与UB抗体结合的特异性条带，而野生藻没有出现特异性条带。虽然我们检测的只是表达出的UB抗原，但由于UB基因和Tα1基因是融合表达的，因此可认为目的基因Tα1已在转基因蓝藻中获得了表达。
权利要求
1．一种蓝藻穿梭质粒表达载体，其特征在于载体上组装有大肠杆菌源质粒和蓝藻源质粒的复制起始位点、卡那霉素抗性选择标记、CaMV 35SRNA启动子、多克隆位点及rbcS polyA终止区等表达元件。
2．权利要求1所述的蓝藻穿梭质粒表达载体的构建，其特征在于从织线藻Plectonemaboryanum中提取出内源小质粒pPBS1，该质粒的序列已收入于DNA数据库，编号为GenbankAccession No．AF176225，其序列如下1 cgattctggg aaagctcatc tactgcccaa agcgtggtat ttctgcaccc aagttttgct61 tgagcgtata aaaaaggcga ctagggtcgt cagcggaaat ttagcacacg aaatatacga121 acacgtacta tctcacgcta ccgagtacct aaactaccat cggaatataa aggcaaaatg181 ctccgatggg cgggaaataa cggttggatg gtatggatac ctgacaaagc gaggtatgca241 ggaattaggg aaacctctgg gtgtggtcta gggggcagtc ccctctggga gatttagacg301 caccgtcgct gttaacaaca gccatgcgaa gcctagcata ctccggcaaa ttacggatgc361 tgcgatcgca ctggttggaa ccaataaggc tgtaaccctc tatctgttaa gtgatcgagg421 gtgttaggta ctgctgtcaa ggacggagcg aagcgaagcc gaagggtatc cttagcagca481 atacctaaca ccctaaaacc cgttcagata gagggttaca gacgttcaga aaagtattgc541 aagacatgaa aataggggct atgctagccc ctatcaaata agtgtttttc caatgaacaa601 cctaatcact ttgtgcgatc gcacagagaa cctttaccga tcggtaaggg ggcattcatg661 gatttgatta aagtctaccc ctgtgggcaa ataacagcaa gttcgcagcg tagattcacc721 cctgagcctc taccgaggga gaaaaaactc actgtagatg aagcattcaa cctttcggca781 ctgaaatcat tcggctatga acgcgcccgt gagattctgc aagccgaagg ctaccttggt841 ttatcaaagc ccgctaaatc ggagaaaacc aaaaaaccga ggggacagaa gggaataact901 tcccacggtc gccgcattat tcgtggggga gtgacattgc ttgagcgtac atacggacgt961 aacaggctgt cgtttatcac tctgactctg cctccagcgg tcgctgaaga tttgagtggg1021 cggtgggcac atgtggtcga tttgatgaaa cggcggctca tctactccaa tggactgcat1081 gggctaccca ccgagataat agcgtgtact gaggttcaag agaagcggta tgaaagaact1141 ggtgaagttg ccttgcactt gcacattgtc atggtcggac ggcatagtag aggagcttgg1201 tgctatagtc ctagacagtt ggaaaaaatg tggagtgaat gctgcgaaac tgccgtcagg1261 aatgttattg agccaaacga gagagttact agcagagtta ctaatagtag aactgagagt1321 gaatctaacg gaaatggaaa cgctactggt aatacaagca gcaatgcaaa tagcaatgga1381 aatgctaatg ggaatataca tacggaagtg aattggaatg cagcggtaaa tgtgcaaagg1441 atcaaaaaat ctgcatctgc atacatgggg aaatatctat ctaagggaac gcaaacgaca1501 cagaaaatta t该小质粒DNA序列全长1511bp，GC含量为47.1％，常用的限制性内切酶酶切位点有AccI(840)，AccⅡ(713)，Alu I(321和1502)，ClaI(3)，HpaI(1203)，HpaⅡ(1171)，PvuI(877、899和1152)，TaqI(3、477和1099)；将质粒pPBS1克隆进质粒pBR322的ClaI位点上，构建成穿梭质粒载体pPRS-1；用EcoRV、PvuⅡ双酶切质粒pPRS-1，电泳回收3.97kb的EcoRV-PvuⅡ大片段，然后用T4DNA连接酶进行平端连接，连接物转化受体菌E.coli JM101，在Apr板上筛选转化子，得质粒pPRS-1’；用EcoRI和SalI双酶切质粒pKYLX-71-35S，电泳分离、回收含CaMV 35SRNA启动子、MCS、rbcS polyA终止区和Kmr基因的6.5kb片段，与经同样双酶切、电泳回收纯化的pEBFP2.6kb片段连接重组，连接物转化E.coli JM101，在含Km和Ap的固体培养基上筛选双抗克隆子，得质粒pKE；用EcoR I和Pst I完全双酶切pPRS-1′，电泳回收含蓝藻内源质粒和大肠杆菌质粒ori区的3.1kb的酶切片段；用EcoR I完全酶切质粒pKE，再用Pst I部分酶切，电泳回收含表达元件和Kmr基因的6.5kb片段，将回收的两片段用T4DNA连接酶连接，连接物转化受体菌E.coli JM101，以Km进行筛选得穿梭表达载体质粒pPKE2。
3．蓝藻穿梭质粒表达载体用于表达胸腺素α1的方法，其特征在于首先构建含目的基因Tα1的重组质粒，根据Tα1基因片段两端的序列设计PCR引物T1、T2和T2’， PCR扩增得110bp的Tα1DNA片段；选用pUC18多克隆位点两端的通用引物U1和U2，以质粒pUCUB为模板，按常规PCR方法扩增出含UB基因的328bp的DNA片段，纯化328bp的UB DNA片段和110bp的Tα1DNA片段，用BamHI同时酶切，然后用T4DNA连接酶连接，以连接物为模板，以U1和T2’为引物进行特异性扩增，得380bp的UB Tα1DNA片段，纯化UB Tα1基因片段，用HindⅢ和Spe I双酶切UB Tα1扩增片段，与用HindⅢ部分酶切、Xba I完全酶切的蓝藻穿梭质粒表达载体pPKE2连接。连接物转化E.coli JM109，在卡那霉素抗性平板上筛选转化子，得重组质粒pPKEUT；然后用重组质粒pPKEUT转化受体蓝藻Synechococcus sp.PCC7942。
4．如权利要求3所述的蓝藻穿梭质粒表达载体用于表达胸腺素α1的方法，其特征在于所述的用重组质粒pPKEUT转化受体蓝藻Synechococcus sp.PCC7942为培养蓝藻Synechococcus sp.PCC7942至OD730=0.25～0.35，离心收集藻细胞，用浓度为10mmol/L的NaCl洗涤，离心并浓缩藻细胞于原1/10体积的新鲜BG-11培养基上，加入2～3μg重组质粒pPKEUT，混匀，避光孵育过夜，供随后筛选转化子；将孵育后的蓝藻与DNA的混合液涂布于覆盖在BG-11固体培养基上的Millipore滤膜上，正常生长条件下培养20hr，转移滤膜至含卡那霉素15μg／ml的BG-11固体培养基上，培养7～10天转化单藻落出现，挑取生长好的藻落移入含10～15μg/ml卡那霉素的BG-11液体培养基中，摇动培养7天，挑生长最好的藻株进行逐级扩大培养。
5．如权利要求3所述的蓝藻穿梭质粒表达载体用于表达胸腺素α1的方法，其特征在于所述的质粒pUCUB为以人工合成的泛素基因UB克隆至pUC18质粒的SphI/BamHI位点之间所构建的质粒。
6．如权利要求3所述的蓝藻穿梭质粒表达载体用于表达胸腺素α1的方法，其特征在于所述的引物U1为通用引物M13/pUC Reverse Sequencing Primer(-48)，引物U2为通用引物M13/pUC Sequencing Primer(-47)。
全文摘要
涉及一种基因工程,以从织线藻Plectonemaboryanum中提取的内源小质粒pPBS1构建蓝藻穿梭表达载体pPKE2, 其有大肠杆菌源和蓝藻源质粒的复制起始位点,有选择标记、启动子、多克隆位点及终止区,可作为外源基因在蓝藻中表达的受体菌,本发明将目的基因胸腺素α1(Tα1)基因和泛素基因融合后插入表达载体pPKE2的多克隆位点,获得含目的基因Tα1的重组质粒,并转化进单胞蓝藻Synechococcussp.PCC7942中,Southern杂交证实和Western印迹法检测到了Tα1表达产物。
文档编号C12N15/63GK1285409SQ0012960
公开日2001年2月28日 申请日期2000年9月29日 优先权日2000年9月29日
发明者章军, 徐虹, 楼士林, 欧阳青 申请人:厦门大学