专利名称：用于药物筛选的多功能细胞微生理计的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于诊断的其他方法或仪器，是一种用于药物筛选的多功能细胞微生理计。
细胞微生理计是1992年由美国分子器件公司首次提出，其基本原理是将活细胞与光寻址电位传感器LAPS(Light Addresable PotentiometricSensor)相结合构成细胞传感器，细胞作为敏感外部刺激如药物的传感器，可以将药物的成分反映在细胞代谢中胞外酸碱度，即H+离子浓度或pH值的变化，此变化再由LAPS传感器检测出来。LAPS的基本结构为EIS(电解质/绝缘层/硅)，即在半导体硅Si上面生成一个绝缘层SiO2，然后在SiO2上面再沉积Si3N4层作为H+敏感薄膜，用来测量溶液的pH值变化。采用一定调制频率的光照射在器件的正面或背面，就可以在外电路中测量到电流。电流的大小，与光强、耗尽层的厚度(即外偏压)等有关。当光强不变时，光电流随耗尽层的增厚而增大。也就是说随外加偏压的增大，外电路上的电流从接近零(截止区)线性增大(过渡区)达到最大值(饱和区)。当固定其他参数，只考虑离子敏感膜与被测气体的响应电压对耗尽层的影响，那么外电流大小的变化就反映了敏感膜对离子的响应，因此可应用于溶液成分和浓度的检测。
图1是美国分子器件公司的细胞微生理计的结构示意图。通过信号源及驱动电路后产生一定调制频率的交变信号，带动激发光源在LAPS的上表面或下表面照射，测量外电路中被激发出相应的光电流，光电流的大小就反映了敏感膜对被测液体的响应。一般外电路采用如图1所示的三电极或二电极工作方式。参比电极用于提供固定的参考电位，对电极用于给LAPS提供一定的偏置电压，工作电极和LAPS衬底上采用欧姆接触并与对电极之间形成一个电流通路。传感器交变的光电流响应通过恒电流/恒电位仪将光电流转换为电压信号，恒电流/恒电位仪输出的电压信号用锁相放大器进行信号的放大和预处理，最终进入计算机给出测量结果。
美国分子器件公司发明的细胞微生理计在的药物应用方面是根据细胞外环境中H+离子浓度或pH值的变化速率来测定感兴趣的药物有效成分和有效浓度。可以由微生理计作出药物作用后细胞外环境中H+离子浓度的变化速率的响应曲线，如图2所示。同时可以得到微生理计最大响应的50％对应的药物激动剂的特征性浓度，如图3所示。其结果与传统的生物化学实验测得的数据是一致的。
目前的仪器存在的主要问题是只能检测细胞外的酸度变化，不能同时检测细胞外的多种离子和成分分析，如多种无机离子K+、Na+、Ca2+、Cl-的实时、动态检测等。而在许多药物筛选应用中，常常需要高通量、快速、同时检测药物作用细胞后引起细胞外多种离子及成分的变化。
本发明的目的是设计一种采用多离子敏感元件和并行快速检测的用于药物筛选的多功能细胞微生理计。
为了达到上述目的，本发明采取下列措施本发明利用LAPS的基本性质，在绝缘层Si3N4层上面制备其它离子敏感膜，在一定光源激发的情况下可以测量相应的离子浓度，同时采用同一波长而调制频率不同的多个光源同时激发这些离子敏感元件，在此基础上，采用并行处理技术实现了对被测细胞外环境多种无机离子的实时、动态检测。
本发明包括能使被分析药物和细胞培养液流入仪器的蠕动泵，细胞传感器，参比电极，对电极，工作电极，恒电位/电流仪，计算机，光源驱动电路，控制电路。细胞传感器为多功能细胞传感器，多功能细胞传感器中的多个激光源与多路信号的光源驱动电路连接，参比电极，对电极，工作电极接恒电位/电流仪，将多功能细胞传感器输出的电流信号转换为电压信号后进入模拟带通滤波器，滤波后的信号进入计算机，通过数字补偿滤波器完成传感器频率特性的修正，由计算机进行快速傅立叶(FFT)运算，计算出各个频率下的幅度变化，计算机经通用的数模转换控制电路控制蠕动泵转动。
本发明具有的有益的效果是1)设计了具有对活细胞胞外代谢产物多种离子敏感的多功能细胞传感器。在同一基底上设计制作了多种离子敏感元件；2)采用多种具有不同激发频率的光源激励相应的离子敏感元件；3)设计了一种数字补偿滤波器用于修正传感器的频响特性使其对多光源激发产生的响应信号具有同样的信噪比和检测精度。通过计算机的快速傅立叶变换，并行计算出各个激发频率下细胞传感器对多种被测物质的响应结果。
本发明可同时测量分析细胞胞外微环境中的H+、K+、Na+、Ca2+、Cl-等多种离子和有机成分的浓度变化，可以定量分析不同药物及不同浓度对刺激细胞的代谢及状态的影响，从而可以用于不同药物及其有效成分和浓度的定量筛选。
下面结合附图对本发明作进一步描述。
图1是美国分子器件公司的细胞微生理计的结构示意图；图2是细胞胞外微环境中H+离子浓度的变化速率；图3是药物激动剂的有效浓度响应曲线；图4是本发明的结构原理图；图5是本发明的多功能细胞传感器的结构示意图；图6是本发明的多功能细胞传感器下盖的俯视图；图7是多路信号的光源驱动电路图；图8是本发明的一个实施过程示意图；图9是数字补偿滤波器信号流程图；图10是上述实施过程的一个实验结果图；图11是该仪器在抗颠痫药物苯妥英钠作用于心肌细胞后细胞胞外微环境的H+、K+、Ca2+浓度变化的检测结果；图12是该仪器苯妥英纳在不同浓度作用于心肌细胞后细胞胞外微环境H+浓度变化的检测结果；图13是该仪器在抗衰老药物川芎不同浓度作用于肾细胞后细胞胞外微环境的H+浓度变化的检测结果。
如图4、图5、图6所示，它包括能使被分析药物和细胞培养液流入仪器的蠕动泵，细胞传感器，参比电极，对电极，工作电极，恒电位/电流仪，计算机，光源驱动电路，控制电路。细胞传感器为多功能细胞传感器2，多功能细胞传感器2中的多个激发光源与多路信号的光源驱动电路3连接，参比电极4，对电极5，工作电极6接恒电位/电流仪7，将多功能细胞传感器2输出的电流信号转换为电压信号后进入模拟带通滤波器8，滤波后的信号进入计算机9，通过数字补偿滤波器10完成传感器频率特性的修正，由计算机9进行FFT运算，并计算出各个频率下的幅度变化，计算机9经通用的数模转换控制电路11控制蠕动泵12转动。
如图5、图6所示，多功能细胞传感器2包括上盖的一端开有被分析药物和细胞培养液的进口2.2，在进口2.2内装有对电极5，上盖内装有与多路信号的光源驱动电路3连接的排列方式为方阵的多个激发光源2.5，上盖的另一端开有被分析药物和细胞培养液的出口2.6，在出口2.6内装有参比电极4；Teflon材料下盖基底2.12上装有加热铝板2.11，加热铝板2.11上的LAPS芯片2.9上制备有与多个激发光源2.5相同个数的离子敏感膜2.14，放置在离子敏感膜的梯形槽2.8中，在下盖上开有放置盖玻片的槽2.1中装有固定细胞的盖玻片和细胞2.13，下盖上还装有工作电极6。其连接关系分析药物和培养液从2.2进入到微型槽2.1和微型流动腔2.10内，通过LAPS芯片2.9及上面的敏感元件2.14，药物作用到2.1内的细胞2.13，产生的胞外H+、K+、Ca2+等离子浓度的变化被2.14检测出来，响应信号通过对电极5和工作电极6产生光电流信号变化。参比电极4提供传感器的偏置电压，2.11提供传感器的工作温度，2.5提供一组激发光源，2.4为与计算机接口的连接板，将计算机的控制信号与传感器连接起来，2.3为四支标准螺柱将传感器的上盖经垫圈2.7和下盖连接在一起。
如图7所示，多路信号的光源驱动电路[3]包括每一路信号源频率不同，均采用ICL8038专用信号发生器芯片，经1/2LM158P跟随电路、1/2LM158P放大电路和S9014、S9015互补三极管组成的功率驱动电路。
本发明通过对EIS结构的LAPS传感器的理论建模，提出了传感器结构的等价电路模型，在此基础上通过系统辨识技术建立了该传感器的数学模型，根据其数学模型提出了一种软件数字滤波器用于补偿该传感器的频率特性使其从窄带通特性变成宽带通特性。从而保证了多种不同频率的光源激发所产生的响应信号具有相同信噪比。此外，采用FFT(快速傅立叶变换)技术将传感器的总的时域响应信号进行频谱变换，得到各个光源激发下微生理计不同的敏感膜对被测细胞外环境不同成分的响应结果，从而实现了多功能检测。
如图4所示，为本发明发明的用于药物筛选的多功能细胞微生理计的结构示意图。1是被分析的药物和细胞培养液在计算机控制下轮流进入多功能细胞传感器2，它与通常结构的区别在于本发明采用了多种离子敏感元件。其检测细胞外环境离子的数目可以是4个(可以扩展为更多)，其排列方式为方阵且与每个光源照射的区域相对应，并要确定好扫描的初始位置。本发明设计的多光源信号源发生和驱动电路3驱动多光源用于激发多个离子敏感元件。4、5分别是参比电极和对电极，6是工作电极，与通常的结构相同。该三电极与LAPS组成一个电化学测试系统。7为EG&G公司的恒电位/电流仪，用于将传感器输出的电流信号转换为电压信号，该电压信号进入模拟带通滤波器[8]进行滤波处理，与通常的结构相同。从模拟带通滤波器8出来的信号进入计算机9，通过数字补偿滤波器10完成传感器频率特性的修正，最后由计算机9进行FFT运算，并计算出各个频率下的幅度变化。计算机9经过通用的数模转换电路11控制蠕动泵12完成细胞胞外微环境的检测。
模拟带通滤波器8是与现有仪器采用的锁相放大器不同的，采用标准SR560仪器。其带宽是根据所采用激发光源的个数以及频率范围选定。数字补偿滤波器10用于在所用光源的频率范围内，即模拟带通滤波器的带宽内完成传感器频率特性的修正。
用该仪器进行药物筛选的使用过程为首先，将细胞培养液通过1在蠕动泵12的控制下流入该仪器，持续时间为2分钟，然后将被测药物1在蠕动泵12的控制下流入该仪器，持续时间为也为2分钟，通过计算机9将采集到的信号通过数字补偿滤波器10完成传感器频率特性的修正，最后由计算机9进行FFT运算。上述过程将循环4-5个周期后，最后计算出各个频率下的幅度变化的平均值，它反映不同的离子浓度的变化。根据药物作用前后，该仪器测得的多种离子浓度的变化，可以判断出对于特定的细胞所分析的药物的作用效果、有效成分、有效浓度，从而实现药物的筛选。表1、2给出了三种敏感元件的灵敏度和选择性系数。
表1三种敏感元件的灵敏度
表2三种敏感膜的选择性系数
图7为本发明自行设计的由ICL8038为主构成的激发光源信号发生器和驱动电路图，这是其中的一路，其它几路的电路图相同，只是信号源的频率不同。该电路的特点是小型、易于制成多路独立的信号源电路提供给多光源。其主要功能是用ICL8038专用信号发生器芯片，产生正弦波信号输出，经过跟随电路和放大电路，最后经过互补三极管功率驱动电路驱动激光二极管。信号源的频率范围为0.5KHz到5.5KHz，采样频率为20KHz。通过对信号作快速傅立叶变换(FFT)的方法进行频谱分析，每采集1000个点作一次FFT，由于频率分辨率为20Hz，因此，在0.5KHz到5.5KHz的频率范围内最多可以选择250个具有不同频率的激发光源，一般为使FFT结果精度提高，频率间隔应大于频率分辨率，所以激发光源应小于250，如100个。
如图8所示，是此方案的一个实施过程，一组激光源激发细胞传感器产生一定的频率响应特性，传感器的响应经过计算机内部的数字滤波器补偿后，得到宽频带的响应频率特性，再经过计算机FFT运算，得到一组激发光源激发下各种离子浓度并行响应的频谱图。将LAPS系统的频率响应用传递函数描述，写成零极点形式H(s)=0.9451+0.00236s2.3933+0.001514s+0.000000135s2]]>式中S=jω(ω是角频率=2πf，f为频率，j为虚部)为了对LAPS的频响进行校正，本发明预先设计出一个理想的宽带通特性滤波器作为校正后的LAPS的频率响应。再根据实际的LAPS频响和校正后理想传遍函数即可求出校正环节滤波器的传递函数。可直接用延迟线、乘法器和加法镒实现，如图9所示。
则y(n)=b0x(n)+b1x(n-1)+b2x(n-2)-a1y(n-1)-a2y(n-2)-a3y(n-3)其中x(n)为传感器的实际响应信号y(n)为数字补偿滤波器的输出信号b0=0.05579×10-8b1=0.81×10-8b2=-0.0085×10-8a1=2.6765，a2=-2.3531，a3=0.6766。
采用波长相同、幅度相同而调制频率不同的多种光源激发传感器。传感器的实际频率特性具有窄带通特性，根据传感器数学模型设计的数字补偿滤波器可以将传感器的传递函数补偿后得到得到所需要的在有效频带内频响处于平坦区的宽带通特性。
图10给出了上述实施过程的一个实验结果。该实验采用三个激发光源，激发频率分别为3.6KHz、3.8Khz、4.0KHz，细胞传感器采用三种离子敏感元件，即H+、K+、Ca2+。细胞传感器的响应经过数字滤波补偿及FFT变换后对三个激发光源的响应特性如图10所示。可以清楚地看到在频谱图上可以区分出三种敏感膜在三个激发光源下的对被测物质的响应结果。
多功能细胞微生理计用于药物筛选的例子图11给出了该仪器在抗颠痫药物苯妥英钠作用于心肌细胞后细胞胞外微环境的H+、K+、Ca2+浓度变化的检测结果。图12给出了该仪器苯妥英钠在不同浓度作用于心肌细胞后细胞胞外微环境的H+浓度变化的检测结果。图13给出了在抗衰老药物川芎不同浓度作用于肾细胞后细胞胞外微环境的H+浓度变化的检测结果。
权利要求
1．用于药物筛选的多功能细胞微生理计，它包括能使被分析药物和细胞培养液流入仪器的蠕动泵，细胞传感器，参比电极，对电极，工作电极，恒电位/电流仪，计算机，光源驱动电路，控制电路，其特征在于细胞传感器为多功能细胞传感器[2]，多功能细胞传感器[2]中的多个激光源与多路信号的光源驱动电路[3]连接，参比电极[4]，对电极[5]，工作电极[6]接恒电位/电流仪[7]，将多功能细胞传感器[2]输出的电流信号转换为电压信号后进入模拟带通滤波器[8]，滤波后的信号进入计算机[9]，通过数字补偿滤波器[10]完成传感器频率特性的修正，由计算机[9]进行快速傅立叶运算，计算出各个频率下的幅度变化，计算机[9]经通用的数模转换控制电路[11]控制蠕动泵[12]转动。
2．根据权利要求1所述的用于药物筛选的多功能细胞微生理计，其特征在于多功能细胞传感器[2]包括上盖的一端开有被分析药物和细胞培养液的进口[2.2]，在进口[2.2]内装有对电极[5]，上盖内装有与多路信号的光源驱动电路[3]连接的排列方式为方阵的多个激发光源[2.5]，上盖的另一端开有被分析药物和细胞培养液的出口[2.6]，在出口[2.6]内装有参比电极[4]；下盖Toflon材料基底[2.12]上装有加热铝板，加热铝板[2.11]上的LAPS芯片[2.9]上制备有与多个激发光源[2.5]相同个数的离子敏感膜[2.14]放置在离子敏感膜的梯形槽[2.8]中，在下盖上开有放置盖玻片的槽[2.1]中装有固定细胞的盖玻片和细胞[2.13]，下盖上还装有工作电极[6]。
3．根据权利要求1或2所述的用于药物筛选的多功能细胞微生理计，其特征在于所述的多路信号的光源驱动电路[3]包括每一路信号源频率不同，均采用ICL8038专用信号发生器芯片，经1/2LM158P跟随电路、1/2LM158P放大电路和S9014、S9015互补三极管组成的功率驱动电路。
4．根据权利要求1所述的用于药物筛选的多功能细胞微生理计，其特征在于所述的数字补偿滤波器[10]为3阶FIR有限冲激响应数字滤波器，其运算方法为y(n)=b0x(n)+b1x(n-1)+b2x(n-2)-a1y(n-1)-a2y(n-2)-a3y(n-3)其中x(n)为传感器的实际响应信号；y(n)为数字补偿滤波器的输出信号；b0=0.05579×10-8b1=0.81×10-8b2=-0.0085×10-8a1=2.6765,a2=-2.3531,a3=0.6766。
5．根据权利要求1所述的用于药物筛选的多功能细胞微生理计，其特征在于模拟带通滤波器[8]为标准的SR560仪器。
全文摘要
一种用于药物筛选的多功能细胞微生理计,设计了具有对活细胞胞外代谢产物多种离子敏感的多功能细胞传感器,制作了多种离子敏感元件,采用多种具有不同激发频率的光源激励相应的离子敏感元件。用数字补偿滤波器修正传感器的频响特性使其对多光源激发产生的响应信号具有同样的信噪比和检测精度。由计算机进行FFT运算,计算出各个激发频率下细胞传感器对多种被测物质的响应结果。它可同时测量分析细胞胞外微环境中的H
文档编号C12M1/00GK1309295SQ0013479
公开日2001年8月22日 申请日期2000年12月4日 优先权日2000年12月4日
发明者王平, 吴一聪, 叶学松, 李蓉, 郑筱祥 申请人:浙江大学