用于防止血小板粘附的蛋白的制作方法

专利名称：用于防止血小板粘附的蛋白的制作方法
发明概述本发明描述了一种从药用水蛭(-)医用水蛭(Hirudomedicinalis)唾液中分离的天然蛋白，这种蛋白可与胶原蛋白强烈结合，从而可作为与胶原蛋白粘附的血小板的抑制剂。此蛋白的分子量约为12000，具有酸性等电点，并且含有六个半胱氨酸。对此蛋白进行了测序，并且从医用水蛭的cDNA文库中克隆到了它的基因。通过重组技术制备这种蛋白的方法已经公开。此重组体和天然蛋白是胶原蛋白依赖性血小板粘附的有效抑制剂，因此对于治疗循环系统疾病和与顽固疾病相关的病况的治疗很有效。进一步，此蛋白可有效的包被天然或人工胶原蛋白的表面，从而防止细胞粘附和细胞的活化。
在血小板粘附到暴露于巩膜损伤(Van der Rest M.etal.；FASEBJournal，1991，5，2814-23)中的胶原质并且进一步开始形成阻塞的生理过程中，这一正常的的生理反应是相当重要的。依赖于隐藏位点及其程度，严重的并发症如心肌梗塞、中风、炎症或肺部栓塞可造成严重的后果。
肝素是一种可直接作用的抗血栓形成的药剂，它可阻断凝血酶的活性从而防止富纤维蛋白血栓症的形成，因而肝素是现今用于抗血栓的最著名的药物。肝素的广泛应用表明有如不稳定的咽痛和急性心肌梗塞。然而，尽管它有如此广泛的应用，它仍有一些缺点，如静脉内应用、要求抗凝血酶III作为协同因子、由与凝块相结合的凝血酶引起的亲和性降低、几种质膜蛋白引起的失活、偶然诱导的血小板减少以及其生物异质性仍然有待解决。因而肝素在临床应用上至今仍没有取得压倒性的结果。
最近低分子量肝素的发展有助于可用于皮下应用的药剂，然而其治疗效果与标准肝素相比提高不大。不幸的是它同样作用于那些直接作用的抗凝血酶如水蛭素、Hirulog及苄丙酮香豆素。这表明一个主要问题可能与在应用抗血栓治疗的情况下凝血酶的产量增加有关(Rao，A.D et al.，Circulation，1996，94，389-2395)。
因此最近针对它的策略聚焦在凝血素活化的过程上，而此活化是由Xa因子推动的。主要的问题是设计直接作用于此因子的适当抑制剂。因此，本发明的发明总结认为人们并没有意识到这种类型的发明的全部治疗潜力。
另一系列的治疗法是以溶解血栓的养生法为代表，其焦点集中在开发葡萄球菌激酶、链激酶、尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激活剂、组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂及anisoylated-血纤维蛋白溶酶原-链激酶激活剂复合体。对每一种溶解血栓的药剂来讲，在诱导重灌注上有显著不同，然而在降低整体的死亡率上效果是相同的。此外，血栓重阻塞和延长的流血是常见的并发症。这可归因于其对纤维蛋白相对较低的特异性以及这些化合物的短质膜半衰期。现今为了克服溶解血栓的治疗中的缺陷，已经检测了多种养生法的应用及不同血溶蛋白溶解原理的结合应用。然而期望得到的改进却相当微小。
最近出现了一组新病人，它们的问题为如急性血栓阻塞以及归因于一些技术如血管成形术、动脉粥样硬化斑切除术、动脉嫁接或血管壁斯滕特印模等技术的晚期再狭窄。可能的介入治疗包括抗血小板、抗血栓及血栓溶解策略。其它多种药剂如盐酸氯苄吡啶可用做ADP拮抗剂或钙离子载体A-23187、另外阿司匹林可直接影响血小板的功能，因而已经建议将其用于或已经用于防止或减少血小板聚合。按照本发明，新的抗血小板粘附物质当用于外科手术时也可有助于克服那些临床上的并发症。
如果人工表面与血液相接触，然后通过激活血小板和/或诱导凝结，血栓阻塞的可能性就增加了，这种情况下就产生了这样一种与主题相关的另一并发症。这些作用可导致血管嫁接、心脏阀、壁斯滕特印模、导尿管或其它与血液相接触的装置或物质的失败。此处公开的蛋白有能产生非形成血栓表面的能力，因此可通过将这种蛋白固定化到上述装置上来进一步利用这种蛋白。这样一种处理方法可给予这些物质或装置生物适应性和血栓形成抗性。
由于与可得的抗血栓形成药剂相关的多种局限性，因而实际上有对新的替代策略和治疗药物的实际需求。
几种可防止血小板粘附的新颖抑制剂是直接作用于vWF的单克隆抗体。这也表明糖蛋白IIb/IIIa抑制剂可有助于抑制血小板粘附。这些抑制剂中的一些如单克隆抗体c7E3已经进行临床检测，而另外的如KGD-和RGDF-抑制剂仍在研究之中。然而，大多数新抑制剂的特异性没有好好的研究，因而应用这些抑制剂而诱导的副作用谱仍然空白，有待于仔细研究。
用于筛选可干预胶原蛋白诱导的血小板粘附的新化合物的丰富资源存在于吮血动物的天然物质中。已经从天然物质中分离到几种抑制剂，如文献所述从医用水蛭中分离的一种叫做Calin的65KD蛋白(US5,587,360，WO 92/07005)(Munro，R.，et al.，Blood Coagulationand Fibrinolysis，1991，2，179-184)和从水蛭医用水蛭唾液腺中分离到的一种16KD蛋白(LAPP)(US 5,324,715)。这两种蛋白都描述为聚合抑制剂，这已经在对依赖胶原蛋白的血小板聚合的静态化验中检测到了。
尽管已经证明体内有活性的LAPP不能在几种公认的体外模型中发挥作用(Schaffer L.W.et al.；Arterioscler.Thromb.，1993，13，1593-1601)and Connolly T.M.et al.；Thromb.Haemostas.，1993，69，589。但软蜱(soft tick)，Ornithodoros moubata也含有一种抗血小板蛋白(Moubatin)，这种蛋白在防止胶原蛋白刺激的血小板聚合方面有活性(Waxman，L.et al.；J.Biol.Chem.，1993，268，5445-49)。另一种从吮血臭虫中分离到的抗血小板聚合的蛋白在Noeske-Jungblut C.等、Smith等的专利WO 9309137中有公开。已经从蛇毒液中分离到一种50 kDa蛋白，另外从一种吮血臭虫Triatomapallidipennis的唾液中分离到一种19 kDa的蛋白。发现在这些蛋白中含有一种特异的抑制胶原蛋白诱导的血小板聚合的因子。这种命名为pallidipin的19 kDa蛋白可抑制质膜上胶原蛋白介导的血小板聚合。但没有探测到它对由其它效应物(ADP、凝血酶、凝血噁烷A2模拟物U46619、佛波醇酯)刺激产生的聚合有抑制作用。Pallidipin对血小板与胶原蛋白的粘附没有作用，但它可抑制从血小板中释放ATP。它可与血小板反向相互作用，并且它与胶原蛋白在血小板上有共同的靶。这种蛋白的具体作用机制机及其治疗效益正在研究之中。Gan等将Echistatin描述为一种可结合到纤维蛋白原受体GP IIa/IIIb上的抑制剂(J.Biol.Chen，1988，263，19827-32)。
尽管有这些令人心动的发展，但进一步提供抗凝血剂和抗凝血酶的需求仍然存在，这些抗凝血剂和抗凝血酶指那些具有在抑制凝块形成、vWF-诱导的激活或内皮细胞激活方面有提高的效率的抗凝血剂和抗凝血酶，以及那些可用做药物、又可生产商业上可行的量的抗凝血剂和抗凝血酶。
鉴于至今描述过的已知蛋白中没有一种能发展成为具有理想治疗效果的化合物，本发明的发明者决定提出一种新筛选策略，以发现相关蛋白。
目前为止，文献中没有肯定的示例来表明利用能从天然化合物中排除聚合抑制剂和细胞溶解酶蛋白的筛选方法来发现新的抗粘附机制或化合物。然而在本发明中应用了这种策略。鉴于已知在胶原蛋白粘附中至少涉及六种不同的血小板表面糖蛋白，此外还涉及几种已经证明可作为胶原蛋白—血小板粘附的间接介质的血小板衍生化合物如vWF、纤连蛋白及血小板反应蛋白，开始时对于发现一种新的粘附抑制剂的可能性是不乐观的。
然而，并不全部排除与有记载的或未知的vWF相关的抑制剂或那些可直接作用于血小板受体的化合物，在这种情况下，我们将这种方法用于对医用水蛭唾液的筛选。筛选结果非常令人吃惊从经过仔细研究的属医用水蛭种的水蛭的分泌物和组织中分离到一种对血小板具抗粘附活性的新蛋白，命名为Saratin。
本发明包括从医用水蛭中分离到的活性多肽Saratin。这种蛋白是从其唾液中分离到的，分离步骤包括加压透析、至少经一步色谱如阴离子交换层析，以及至少一步反向高效液相色谱(RP-HPLC)。在从唾液中分离Saratin时，加压透析绝对重要，因为唾液的强浓缩有助于克服具生物活性的Saratin的大量损失。这种分离的Saratin与多种胶原蛋白有强结合，从而以一种剂量依赖的方式阻止了这些表面包被的胶原蛋白与血小板的粘附。
为了优化筛选级联，目前已有的技术已发展来区分血小板粘附与血小板聚合血小板减缓或停止血液流经纤维、血小板对体内凝块形成的贡献、玻璃珠粘附实验、或在可调压力梯度下全血流经滤膜或抗富含血小板的质膜对含有玻璃纤维或胶原蛋白的滤膜的粘附。
此蛋白(命名为Saratin)特征于其序列(SEQ.ID.NO.2)中的氨基酸序列，此序列由103个氨基酸组成，其理论上的相对分子量为12068道尔顿±1KD。此蛋白含有与其它前述序列没有显著相似的、特有的一级结构。此蛋白富含天冬氨酸和谷氨酸，这使得其通过IEF-PAGE测得的等电点较低，为pH3.7±0.5.
SDS-PAGE分析表明在电泳之前还原蛋白质，迁移率有一强推移，这暗示翻译后修饰。多肽测序已经证明有六个半胱氨酸分子存在，正是它们造成了蛋白的翻译后修饰。Saratin的电喷射质谱显示起实际分子量为12061，这表明至多有三个二硫键参与蛋白天然形式的次级结构的形成。
按照本发明的粘附抑制剂是新的，这是因为它与已知的从水蛭、尤其是从Calin中分离的聚合抑制剂或LAPP在分子量、等电点及氨基酸序列和生物活性上都不同。
本发明也提供了分离的DNA序列，这种DNA序列编码源于水蛭的血小板粘附抑制剂，而这些抑制剂含有序列表中所示的蛋白的氨基酸序列。表示cDNA克隆的核苷序列在SEO.ID.NO.1中有示，1-63位核苷序列代表公认的前导序列，64-372位核苷序列含有可编码103氨基酸残基的多肽和SEQ.ID.NO.2中的成熟蛋白的氨基酸序列的开放阅读框架。
本发明还涉及到重组载体，这些载体包括编码本发明中的、源于水蛭的血小板粘附抑制剂的合成基因、以及含有重组载体的宿主细胞。获得和分离已表达的蛋白的方法是基于标记技术或由应用于天然Saratin的纯化方法改编而来。依赖在经合适载体转化的酵母细胞、昆虫细胞、幼龄仓鼠肾细胞及大肠杆菌细胞的细胞外或细胞内表达的单个方案，利用专业人士熟知的技术对从上清液或沉淀中获得重组蛋白的步骤作了变动。在大肠杆菌宿主细胞中的表达非常好，此处插入的一种pelB前导序列有助于其周质表达。在渗透作用和离心后，从大肠杆菌(E.coli)中回收产品(大约5mg/l)。在平行实验中采用的是含有其它酵母所携带的载体的酿酒酵母(S.cerevisiae)(＞10mg/l培养液)。对分泌物进行离心分离。通过交叉流过滤和离子交换层析进行纯化。在另一种表达方法中，利用COS细胞或CHO细胞，产物表达大约为750ng/ml。通过电泳和色谱分析的方法对纯化的重组物质的纯度和均一性进行证明，事实证明在氨基酸测序和分子量确定下证明其与源于唾液的Saratin完全相同。
本发明还包含从水蛭唾液粗提物中纯化活性蛋白以及通过静态或动态检测测定其抗血小板的活力的方法，以及这些方法在分离重组蛋白中的应用。
生产Saratin的技术，包括示例6、7、8和13，但应用的表达方法并不局限于这些示例。例如转基因鼠或其它生物体，包括其它哺乳动物，也可用于表达Saratin。
本发明中的蛋白包括保持着公开序列的变体，它包括保持有活性的片段或亚基、天然变体、等位基因变体、随机产生的人工突变体及有目的的序列变更如添加。片段或亚基指含有比完整蛋白少的氨基酸的部分序列，例如排除完整蛋白的N-和/或C-末端的部分序列。
本发明进一步包括杂种蛋白，例如融合蛋白或在表达载体中的多基因表达产物，以及可通过肽键与另一种多肽交联、又具有已公开的蛋白的特异活性的多肽。值得注意的是本发明的蛋白的其它变体，它们包括，尤其是那些与仅仅通过保守氨基酸替代而得到的分离蛋白不同的变体。这样的保守氨基酸替代在Taylor等的J.Mol.Biol.，1986，188，233中有定义。
本发明还包括利用蛋白来抑制胶原蛋白—血小板相互作用，进而防止或延迟血小板活化。本发明中的蛋白在防止、预防、治疗和处理血栓疾病方面是有效用的。与前述的其它作用于多种血小板表面蛋白的蛋白不同，本发明的蛋白具有独特的作用机制。它紧紧结合到胶原蛋白的表面，此作用机制就是通过覆盖特异胶原蛋白的侧面，使其不能与血小板相互作用和结合。这类新机制具有很大的优点在使用这种蛋白的过程中，血小板保持功能性上的完整，因而这种处理方法可能有非常低的流血，甚至没有流血。
另一重要的应用方面就是利用本发明中的蛋白来处理多种表面，从而使得它们与血小板不具粘合性，因而就可创造一种生物适应性的装置。
如上文所表明的，本发明中的多肽适合于用做多种药物化合物中用作药物的有效成分及适于这些药物化合物的结合使用。
按照本发明，药物制剂可含有额外的活性成分如阿司匹林、抗凝血剂如水蛭素或肝素，或溶解血栓的药剂如血纤维蛋白溶酶原激活剂或链激酶。
按照本发明，新颖的多肽可与非毒性的、有机的或无机酸形成药物上可接受的盐。无机酸有，如盐酸、氢溴酸、硫酸或磷酸，以及酸性金属盐例如正磷酸氢氧化钠，亚硫酸氢钾。有机酸的例子有单、二或三羧酸如乙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、谷氨酸、延胡索酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、安息香酸、羟基安息香酸、苯基乳酸、苯乙烯酸、水杨酸和磺酸如甲基磺酸。羧基末端氨基酸盐包括与合适的无机或有机碱基形成的非毒性盐。这些盐包括，如与碱金属如钠和钾，碱土元素如钙和镁，IIIA族轻金属包括铝、以及有机伯、仲和叔有机胺如三烷基胺包括三乙基胺、普鲁卡因、二苄胺、1-乙烯胺(ethenamine)、N，N’-二苄基亚乙基-二胺、dihydroabietylamine及N-烷基哌啶。
此处所用的名词“药物学上可接受的载体”指一种惰性的、非毒性的固体或液体填充物、稀释液或胶囊包被物，它们不逆向与活性化合物或病人发生作用。在本领域中熟知的、合适的、优选的液体载体有如无菌水、碱金属盐、水性葡萄糖、糖溶液、乙醇、乙二醇及油类，包括石油、动物油、植物油或合成的油类如花生油、大豆油和矿物油。
按照本发明，其制剂可以含有传统的非毒性药物学可接受载体、稀释液、助剂或典型的用于肠胃外给药的载体的单位剂量来给药。
名词“肠胃外”包括此处的皮下、静脉、关节内和气管内注射，以及灌输技术。另外其它的给药如口服给药和局部给药也是合适的。肠胃外给药的组合物和结合物最优选的给药方式是静脉给药，可将药物制成大丸药形式，或按照已知方法进行持续融合。
口服用药片和胶囊含有传统的赋形剂如结合因子、填充物、稀释液、成片因子、润滑剂、分散剂、以及润湿因子。片剂可按照本领域中熟知的的方法进行包被。
口服液体制剂可以水性或油性悬浮液、溶液、乳状液、糖浆或酏剂的形式存在，或可以干制品形式存在，只需在使用前添加水或其它合适载体。这些液体制剂可含有传统的添加剂如悬浮因子、乳化因子、非水性载体和防腐剂。
局部给药时可以水性或油状悬浮液、溶液、乳状液、果子冻，优选乳状油膏的形式。
按照本发明，本发明中的单位剂量可含有本发明中蛋白的日常所需量，或构成所需剂量的蛋白的Submultiple量。对一个给定病人(哺乳动物，包括人)来讲，最佳的治疗上可接受的剂量和服药频率依赖于多种因素，如服用的特定活性物质的活性、年龄、体重、身体状况、性别、饮食、给药时间、给药方式、去除率、处理的目的，也即治疗和预防、以及待处理的血栓疾病的性质、抗血小板或抗凝血剂活性。
因此，在对于治疗的病人(体内)有效的抗血栓组合物和结合物中，本发明中的肽段在药物学上的日常有效剂量是0.01-100mg/kg体重，优选0.1-10mglkg体重。按照本发明，每一分离剂量的给药可含有0.5-10mg凝血酶抑制剂。为了在体外血液中收到抗凝血剂的效果，本发明的肽段的药物学有效剂量为0.2-150mg/l体外血液，优选剂量为1-20mg/l体外血液。
本发明的另一目标是提供可植入的或可体外治疗的装置来与体液接触，从而给予此装置表面基本的血栓抗性，在其表面包被一层上文所讲的和权利要求中提及的固定的多肽。按照本发明，此多肽是固定在医疗装置上的，这样就可给予装置表面生物适应性和血栓抗性。这样的装置有时含有典型诱导血小板聚合的表面性质，这是与血液或其它体液接触的可植入或体外装置在其有目的应用中的一个缺陷。这些装置的示例一般是用塑料物质和合成纤维制作的，它们可用做protheses、人造器官、眼镜镜片、缝合用线、人造脉管片段、导尿管、透析器、装血液用的试管和容器。
尽管现代的外科技术和镜片应用在治疗程序中，后被膜浑浊化(PCO)是cateract extraxtion后的常见并发症。PCO是由晶状体上皮细胞增殖或迁移过后被膜而造成视觉敏锐度降低造成的。已经有人提出物理学处理的和化学修饰的晶状体可减少PCO的形成。已经用肝素晶状体包被或局部肝素眼药水来减少PCO的形成，这表明抗血栓机制也与PCO的形成有关。
已经证明Saratin较肝素在防止和阻止血栓形成方面有显著的优势。因此，本发明的另一特征就是提供了含有Saratin的一种包被，这种包被可降低晶状体物质的血栓形成，而这些晶状体物质可用于折射那些通过外科手术植入眼睛的前腔或后腔植入物。这一新型包被避免了由细胞生长刺激产生的问题。与其它，例如可使细胞死亡药剂结合使用，Saratin可有助于完全征服后被膜浑浊化。图表简述图表的细节在示例1-10中有阐释。


图1唾液组分的分离。Seratin的洗脱以*表示，a)显示了唾液经DEAE阴离子交换之后的分离情况。Saratin片段从峰3来收集(例2)。
b)显示了经过收集的级分在Mono Q HR5/5上的反向层析。样品从主要峰的后部收集，如条形图所示(例2)。
c)显示了在Saratin阳性片段的半制备分析RP-HPLC上的最后色谱步骤，此片段从Mono Q HR5/5上收集(例2)。活性Saratin从主峰(第3峰)收集。
图2
从RP-HPLC收集的SDS-PAGE级分。Saratin阳性片段用※标记(例2和3)。
图3Saratin的大肠杆菌表达载体(例7)图4Saratin的Baculo供体质粒(例8)图5将全血暴露于人造胶原蛋白表面，通过染色就可用观察到血小板粘附。Saratin用做抑制剂(蛋白#607)例9图6shere条件下，在胶原蛋白类型III包被的盖玻片上的血小板粘附的抑制。唾液与Saratin的对比。例9图7shere条件下，Saratin表现出对血小板与胶原蛋白类型III包被的盖玻片的结合粘附的抑制。例9图8Saratin的酵母表达载体(例13)发明详述例1筛选粘附抑制剂血小板与胶原蛋白的粘附是筛选唾液组分的功能性背景。此外，目前已有四种可用于评估各种抗血栓药物功能的检测方法，如AZOCOLL检测、酰胺酶活性检测、vWillebrand依赖性结合检测及血小板聚合检测，这些方法已经用于排除那些与粘附抑制剂没有理想的联系的功能特性。虽然此处所用的绝大多数检测法是标准检测法，但仍不得不对血小板粘附检测进行改变来适应我们的特定需求。简而言之利用浓度为20ug/ml的酸化胶原蛋白将Horm胶原蛋白(Nycomed)包被到96孔的平皿上，培育过夜。用PBS冲洗平皿三次，平皿的表面剩余物用1％BSA来阻断。将通过层析柱步骤得到的片段与从新鲜citronylated血液中分离到的血小板同时加入其中。在TBS中，在二价镁氧离子存在下，在使用前培育血小板从而使其进行必需的预活化。配制总蛋白标准浓度为200ug/ml粗唾液，将其作为基准物来对抑制活力进行对比。血小板检测结果证明其极易受缓冲液变化和盐浓度增加的影响。由于所有的样品都是经离子交换层析来处理，在抑制检测中对这些片段的直接检测结果较复杂和不可信。因此，待检测的所有样品通过基于Centricon的浓缩步骤，这样检测前可同时降低离子强度及增加其浓度。
例2天然抑制剂的纯化本发明应用从医用水蛭收集的唾液，已知其中含有大量生物活性蛋白如水蛭素、弹性蛋白酶抑制剂、胶原酶，以及血小板聚合抑制剂如calin(Munro，R.et al..；Blood Coagulation and Fibrinolysis，1991，2，179-184)和LAPP(Schaffer，L.W.et al.；Arterioscler.Thromb.，1993，13，1593-1601)。除了这种特征蛋白之外，通过SDS-PAGE检测到的大约有8种蛋白的主要蛋白仍然是未知的。在本发明中，应用了例1中所述的片段化唾液及筛选策略，以此来筛选可直接干预血小板-胶原蛋白相互作用的新颖蛋白。
从粗唾液中分离一种粘附抑制剂是一项关键的任务，主要是因为在第一步色谱步骤中绝大多数粘附抑制活力有不可恢复的损失。Munro，R.等建议使用的添加剂如12％乙醇和二价阳离子也不能改善这种情况。然而唾液中的高盐浓度及低总蛋白浓度(190-250ug/ml)使得进行起始浓缩或缓冲液交换成为必须的。因此，试验了几种富集、浓缩或缓冲液交换方法。传统的透析方法使活力全部损失。绝大多数其它的标准技术如离子交换、亲和柱层析、分子排阻(填充树脂造成的损失可不计)都不成功，而这些方法不受分离技术性质、所用的缓冲液和添加剂的限制。但令人吃惊的是对500ml唾液进行增压透析证明是一种成功的唾液蛋白浓缩方法(约30-40倍)，并且同时去除了不需要的缓冲成分。意想不到的是通过这种方法处理的唾液粗物质是进一步纯化的理想出发物质，从唾液中回收有生物活性的抗粘附组分不再成为一个问题。由于阳离子交换剂或亲和层析在纯化过程中是一不充分的步骤，因而使用了快速DEAE或EMD-DEAE Fractogel作为填料。对12％乙醇和二价阳离子进行了检测，然而结果与添加剂相似或没有添加剂时相同。进一步优化色谱步骤，最终的步骤为DEAE柱、Mono Q-柱，最后一步是反向RP18柱。利用Pharmacia.的分析柱在BiaCore色谱体系中优化色谱条件。在DEAE-柱、Mono Q-柱及RP18柱上操作时的浓度梯度在
图1a，b，c中给出。通过FPLC技术增大了基于BiaCore的分离规模。除过RP18柱外，其余各柱按照厂家的使用说明使已优化的过柱条件直接转化为半制备规模的过柱条件，而RP18柱仍旧使用BiaCore技术以减少纯化物质的损失。利用快速真空离心方法从最后一步RP-色谱回收纯化的蛋白。从最后一步RP步收集的样品经SDS-PAGE进行回收和分析(图2)。随后样品重新悬浮到PBS中，用来进行分析和功能检测。一般来讲从未处理的唾液中可回收到大约750ug/l的Saratin。
例3生物化学特性按照例1中公开的纯化方法可制得基本上纯的Saratin蛋白，经还原性条件下的SDS-PAGE测得其表观分子量大约为21KD(图2)。通过对纯化蛋白的前48个氨基酸直接测序得到其氨基酸序列，并且通过对经酶法降解产生的几个内部肽段进行测序得到其完全氨基酸序列。完整的蛋白序列在SEQ.ID.NO.2中已公开。
这种蛋白含有103个氨基酸，其计算分子量为12067，9，而从ESI-质谱推算的分子量为12061，9。在理论分子量和实测分子量间的差异表明Saratin中的六个半胱氨酸全部参与形成二硫桥。这一发现对在还原性条件下和非还原性条件下利用色谱法分离SDS-PAGE的产物时的蛋白质迁移率变化是一支持。此外，此蛋白富含酸性氨基酸，如谷氨酸和天冬氨酸。通过IEF-PAGE(固定)进行的等电聚焦技术证明其等电点为pH 3.7±0.5。在对比研究中，我们利用纯化的水蛭蛋白作为参考物，将它与从baculo、酵母及大肠杆菌表达产物中得到的重组Saratin的物理化学性质进行对比。通过对SDS-PAGE进行考马斯亮蓝染色(图2)或银染色观察，或通过Western印记分析显示所有的这三种蛋白在性质上完全相同，它们都是均一的，以非糖基化形式存在。
例4mRNA制备和cDNA合成RNA是从医用水蛭中制备的；使用的是胍基硫氰酸盐法。利用“Oligotex mRNA试剂盒”(QIAGEN)从总RNA中纯化mRNA。利用“Marathon cDNA扩增试剂盒”(CLONTECH)来合成cDNA。按照厂家的使用说明，利用PCR寡核苷引物起始扩增编码Saratin DNA序列。合成完cDNA后，将一种通用连接物连接到cDNA的两端。这种通用连接物和通用引物AP1或AP2是按照该试剂盒供应商提供的使用说明进行选择的。
例5通过PCR扩增和分离Saratin简并引物是基于反向翻译的Saratin的直接N-末端氨基酸序列合成的。
引物01和引物02是设计来与Saratin cDNA的5′-端特异杂交的。引物设计是基于通过实验确定的、已纯化的Saratin蛋白的八个N-末端氨基酸的反向翻译序列之上的。合成的引物01和引物02保持尽可能低的简并性，并且在关键的3′-端有与Saratin cDNA完美结合的八个延长的碱基对，以此来保证模板DNA的特异的和高效的扩增。按照DNA简并字母(IUPAC密码)，R＝A或G；M＝A或C；Y＝C或T；及N＝A或G或C或T。
利用引物01和引物02及一种通用引物AP1或AP2的混合物进行了3’-RACE PCR反应。将PCR产物克隆到TA克隆载体r pCR2.1或pCRScript SK(+)载体中，并对其进行测序。对获得的几种3’-RACE PCR片段。进行测序后，就得到了除5′-未翻译区、信号肽序列和编码成熟蛋白N-末端几个氨基酸的序列外的Saratin基因序列。为了获得丢失的Saratin cDNA序列信息，就利用从Saratin cDNA中部得到的特异引物和一种通用引物AP1或AP2进行了5’-RACE PCR实验。在对几种5’-RACE PCR片段进行测序之后，就得到了完整的Saratin基因序列。利用从Saratin基因3’-和5’-末端得到的基因特异的、非简并的引物进行PCR扩增Saratin基因，就得到了全部长度的Saratin基因。
通过多于15种不同的PCR克隆进行了DNA测序。然而，仅在一个克隆里发现引起氨基酸序列改变的一种显著改变。极有可能这种改变是由PCR引起的。另外发现的5个沉默改变没有引起氨基酸序列的改变。因此这些改变不大可能是由PCR引起的，因为在不同的克隆中发现了相同的改变。
Saratin基因ORF有372个bp，并且含有一个含有21个氨基酸的信号序列，以及编码成熟蛋白的103个氨基酸。此外发现从PCR扩增得到的氨基酸序列与对从天然唾液得到的蛋白测序得到的氨基酸序列完全相同。
例6在COS细胞中的表达以及对表达蛋白的检测为了在哺乳动物细胞如COS或CHO中表达Saratin基因，所以利用Xhol+Xbal将Saratin基因从载体pCR Script SK(+)中切割下来，并且将其克隆到哺乳动物细胞表达载体pCl-neo(Promega)中。选择pCl-neo是因为它含有用于体内表达的T7和T3引物，以及含有可用于G418选择的抗新霉素基因，并且它可用于在COS和CHO中的表达。
在信号序列和成熟蛋白序列之外含有插入序列，此插入序列在5’-末端含有有助于高效翻译的Koz序列，而在3’-末端(C-末端)含有有助于蛋白表达、纯化和浓缩的组胺酸标记MRGS(H)6。质粒结构命名为pNC-31。
pNC-31质粒DNA用于转染COS细胞。用PBS冲洗两遍处于对数期的COS，将其溶解在PBS中，使其浓度为1×107/ml.。然后将12μg质粒DNA(在水中或TE缓冲液中少于50μl加入到0.7-0.8ml COS细胞悬浮液中，将其混合在电穿孔玻璃小管。在1.9kv、25μFD下电穿孔10分钟，然后转移到直径90mm的平皿中。添加8ml含有10％FCS和抗生素的培养基后，培养3天。上清液和细胞用于进一步的蛋白分离与检测。利用抗MRGS(H)6抗体进行western印记来检测已表达的蛋白。利用鏊合剂如固定化在柱基质上的NTA或酰亚胺乙酸来纯化，以及用金属离子如Co、Ni或Cu来修饰。
例7构建大肠杆菌表达载体并进行表达由于可变密码子在不同生物体系中的应用，因而一些密码子在大肠杆菌中很少应用。为了在大肠杆菌中表达优化的蛋白，就要按照标准方法将此基因转化为大肠杆菌中使用的密码子。
利用经修饰过的质粒pASK75在大肠杆菌中进行表达，此质粒携带tet启动子区(P20，L21-22)。简而言之通过克隆一个在Xbal和HindIII位点间的新连接体(图3)来进行修饰。新的连接体含有ompA前导序列、另一个克隆位点和取代锁链状球菌标记的6x组胺酸标记。
要想构建Saratin的表达载体就必须通过PCR导入5’ClaI和3’Eco47III限制性位点。因此引用了5’引物03和3’引物04。PCR产物首先克隆到PCRII载体体系(Invitrogen)中，并且对其进行测序。第二步利用5’ClaI和3’Eco47III限制性位点将Saratin基因克隆到修饰过的pASK75载体中。然后在第二个PCR反应中表达和证明重组Saratin的活力。去除组胺酸标记，并且将Saratin基因起始密码子直接融合到ompA前导序列中。这一步PCR反应的5’引物05和3’引物06的序列组成在序列表中已给出。
作为在大肠杆菌中表达的一个例子，含有融合到ompA前导序列中的结构基因表达载体pRG72(图3)转化到W310感受态细胞中。当生长到对数中期后细胞就会被激活，一小时后就可清楚的检测到重组Saratin的存在。
例8构建Baculo供体质粒并进行表达为了在Baculo病毒表达体系中表达Saratin，我们选用了GibcoLife Technologies的Bac-To-BacTM杆病毒表达体系。为了得到一种选择体系，我们将蜜蜂蜂毒肽前导序列融合到Saratin基因中，并且为了导入限制性位点5’BamHl和3’Kpril，因而利用5’引物07和3’引物08进行了一个分离的PCR反应。将相应的PCR产物克隆到PCRII载体体系(Invitrogen)中，并且对其进行测序。利用限制性位点5’BamHl和3’Kpril将蜂毒肽-Saratin融合体克隆到pFastBac载体中形成pTDl3(图4)。利用Bac-To-Bac表达体系产生重组杆病毒并表达Saratin。将供体质粒pTDl 3转化到含有具有mini-attTn7靶位点的杆粒及辅助质粒的DhlOBac感受态细胞中。在辅助质粒提供的转座蛋白存在下，供体质粒上的mini-Tn7元件移换到杆粒的mini-attTn7位点上。通过破裂LacZ基因来鉴定含有重组杆粒的克隆。从精选的含有重组杆粒大肠杆菌克隆中制备高分子量mini-prep DNA，然后将此DNA转染到昆虫细胞中。在表达试剂盒的使用手册中有详细的描述。
例9血小板在流动条件下与胶原蛋白粘附(动态检测)进行血小板粘附检测时，人全血流经平行流动室，以此来检测血小板与在高剪切流动条件下(模拟体内动脉环境)包被到盖玻片胶原蛋白的粘附活性，而这种高剪切流动环境最早是由Sakariassen等描述的(Met k.Enz.，1988，169，37-70)。将人胎盘胶原蛋白类型III(Sigma)溶解在50mmol/L乙酸中，利用润饰油漆喷雾器将其喷到洁净的玻璃盖玻片(18mm×18mm)上。盖玻片贮存在PBS中4℃过夜。
使用前，将新鲜的人全血(与低分子量肝素结合抗凝血；20U/ml)37℃预热10分钟。将本发明中的蛋白制剂吸到盖玻片上(30ul每盖玻片)，插入灌注室之前，室温下将其在湿润的室中培育10分钟。然后才可将这些血灌注过此平行流动室(37℃下，15分钟，剪切率为1300s-1)。
随后，将盖玻片移出，在PBS中冲洗，然后在0.25％戊二醛中固定30分钟，然后利用May-Grunwald Giemsa染色。图9是一典型的例子。在未处理的对照表面能见到经染色的血小板的粗放覆盖。经Saratin预处理过的对照表面上血小板的结合急剧减少(有80％)。如图5所示(放大率m×1000)，利用与计算机图象处理器(Leica)相连接的光学显微镜对血小板粘附进行定量。结果以覆盖有血小板的表面与覆盖有血小板聚合物表面的百分比来表示。
将唾液的抑制活性与纯化蛋白的抑制活性相对比，如图6所示。与对照相比，在含有粗唾液(#616)的条件下，以1300s-1的剪切率在胶原蛋白类型III包被的盖玻片上进行的血小板粘附有大约48％抑制。标准蛋白浓度的纯化蛋白(#607；Saratin)表现出大约能降低81％的血小板粘附。如图7所示，Saratin诱导的抑制以一种对高浓度纯化蛋白剂量依赖的方式增加。
例10免疫和抗体当得到第一批高纯天然蛋白后，我们立刻进行了动物免疫。在兔体内制备免疫血清，并且得到了高效价的试剂以做进一步的筛选。但在得到完整蛋白的肽段序列和合成了三种合成多肽(氨基酸序列83-103、13-30、58-69)后就得到了额外的抗血清，并且通过标准连接体方法将其与KLH偶联以便用于动物免疫。已经确定了指令N-末端肽段的三种血清和特异于C-末端肽段的两种血清。在得到高效价的免疫血清的情况下就有可能对天然纯化的蛋白和重组蛋白的纯度进行定量。因而就可以用它替代这种既耗时、工作量又大的血小板抑制检测法，而后者就可以仅仅用于确定最终纯化蛋白抑制潜力。
例11用于估测Saratin结合免疫检测将经过酸化处理的Horm胶原蛋白(Nycomed)用于包被96孔微量滴定平皿(Nunc)。用50ul胶原蛋白溶液(20μg/ml)包被过夜。在检测之前用PBS冲洗三次，然后与BSA溶液(1％)共培育来防止非特异性粘附。50μl Saratin以系列稀释的形式添加，并且培育1小时。在进行抗Saratin抗体检测之前将平皿冲洗3次。在额外的1小时培育步骤结束后将多余的抗体移出，然后将生物素标记的抗体用于检测。在与底物如ODB-片剂(Dako)进行streptavidin-POD催化的颜色反应之后，在490nm.下读数。
例12筛选抑制剂的竞争性检测将例7中所述的重组标记Saratin(组胺酸标记)与未经标记的天然Saratin在与胶原蛋白才结合上进行对比。包被有经过酸化处理的Horm胶原蛋白(Nycomed)已经由例11中的方法制备得到。利用兔抗Saratin抗体进行检测。标记的和未标记的Saratin显示出相同的结合特性。另外通过biotinylation(Pierce，biotinylation kit)对未标记的Saratin进行修饰，并且与未修饰的Saratin进行比较。二者与胶原蛋白的结合特性相同。进一步的实验是将生物素化Saratin与未修饰Saratin、肽段、源自唾液的Saratin、完全唾液及直接作用于Saratin的抗体进行交叉竞争。利用抗生蛋白链菌素-POD共轭物和ODB-底物反应来检测生物素化Saratin的结合，通过估计生物素化Saratin的结合来检测多种竞争物与胶原蛋白的结合。含有生物素化Saratin的检测法一般用于估计唾液中Saratin的浓度(750ug/1)、绘制直接作用于Saratin的抗原决定簇的图谱、评价生物活性Saratin、变异Saratin。为了探究检测方法的潜在能力，应用了利用特异Saratin肽段产生的阻断和非阻断抗-Saratin抗体。
例13酵母表达载体及其表达Pichia多拷贝表达体系(invitrogen)是用于酵母表达的典型例子。酵母表达载体的构建如图8所示。为了产生Saratin的表达载体，可应用PCR扩增技术来生产与同一适当载体(pPIC9K)的连接相适应的限制性末端(5’-EcoR1和3’-Not 1)。随后是5’-引物09和3’-引物10。
在转化Pichia球芽之前，先将表达载体与Sal.1线性化。对含His+Mut+突变体的菌落进行筛选以保证Saratin基因的整合。典型的生长条件是28-30℃，培养至可见光密度是OD2-6。将离心过的细胞重新悬浮在培养基中，添加乙醇至浓度为0.5％，延长时间保持这样的条件，一般为24小时，然后对表达进行诱导。在经历一般为6天的发酵之后，将产物从上清液中回收，并进行SDS-PAGE和ELISA分析。
序列表<110>Merck Patent GmbH<120>用于防止血小板粘附的蛋白<130>Saratin序列<140><141><160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>375<212>DNA<213>Hirudo medicinalis<214>医用水蛭<220><221>CDS<222>(64)..(372)<400>1atgaagtatt tcttgatttc cttcctttgc ctcgcaagct tgctgatctc aactacttct 60tca gaa gaa cgt gaa gat tgt tgg acg ttt tac gcg aac aga aaa tat108Glu Glu Arg Glu Asp Cys Trp Thr Phe Tyr Ala Asn Arg Lys Tyr1 5 10 15aca gac ttc gat aaa tct ttt aag aag tcc tct gat ctt gac gaa tgc156Thr Asp Phe Asp Lys Ser Phe Lys Lys Ser Ser Asp Leu Asp Glu Cys20 25 30aaa aaa aca tgt ttc aag acg gag tac tgc tac atc gtt ttt gaa gac204Lys Lys Thr Cys Phe Lys Thr Glu Tyr Cys Tyr Ile Val Phe Glu Asp35 40 45acg gtc aac aag gaa tgt tac tac aat gtc gtt gat ggt gaa gag tta252Thr Val Asn Lys Glu Cys Tyr Tyr Asn Val Val Asp Gly Glu Glu Leu50 55 60gac caa gaa aaa ttt gtt gtc gac gaa aac ttc acg gaa aat tat ttg300Asp Gln Glu Lys Phe Val Val Asp Glu Asn Phe Thr Glu Asn Tyr Leu65 70 75aca gac tgc gag ggt aaa gat gca ggt aat gcg gca ggt aca ggt gac348Thr Asp Cys Glu Gly Lys Asp Ala Gly Asn Ala Ala Gly Thr Gly Asp80 85 90 95gag tca gat gaa gtt gat gaa gat taa 375Glu Ser Asp Glu Val Asp Glu Asp100<210>2<211>103<212>PRT<213>Hirudo medicinalis<214>医用水蛭<400>2Glu Glu Arg Glu Asp Cys Trp Thr Phe Tyr Ala Asn Arg Lys Tyr Thr1 5 10 15Asp Phe Asp Lys Ser Phe Lys Lys Ser Ser Asp Leu Asp Glu Cys Lys20 25 30Lys Thr Cys Phe Lys Thr Glu Tyr Cys Tyr Ile Val Phe Glu Asp Thr35 40 45Val Asn Lys Glu Cys Tyr Tyr Asn Val Val Asp Gly Glu Glu Leu Asp50 55 60Gln Glu Lys Phe Val Val Asp Glu Asn Phe Thr Glu Asn Tyr Leu Thr65 70 75 80Asp Cys Glu Gly Lys Asp Ala Gly Asn Ala Ala Gly Thr Gly Asp Glu85 90 95Ser Asp Glu Val Asp Glu Asp100<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<214>医用水蛭<220><223>人工序列描述简并引物01<400>3gargarmgng argaytgttg gac23<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<214>医用水蛭<220><223>人工序列描述简并引物02<400>4gargarmgng argaytgctg gac23<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<214>医用水蛭<220><223>人工序列描述引物03<400>5gcaccgatgg aagaacgtga agac 24<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<214>医用水蛭<220><223>人工序列描述引物04<400>6tagcgctttt gacgtcgtcg tca23<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<214>医用水蛭<220><223>人工序列描述引物05<400>7gaagaatgca aggatgagga ttattg 26<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<214>医用水蛭<220><223>人工序列描述引物06<400>8aagcttctag tcttcgtcaa cttcg 25<210>9<211>94<212>DNA<213>人工序列<214>医用水蛭<220><223>人工序列描述引物07<400>9cggatccatg aaattcttag tcaacgttgc ccttgttttt atggtcgtat acatttctta60catctatgcg gaagaacgtg aagattgttg gact94<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<214>医用水蛭<220><223>人工序列描述引物08<400>10ggtacctcac atatcttcat caac 24<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<214>医用水蛭<220><223>人工序列描述引物09<400>11gcatgcggcc gcctaatctt catcaacttc 30<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<214>医用水蛭<220><223>人工序列描述引物10<400>12gcatgaattc gaagaacgtg aagattg2权利要求
1.从医用水蛭中分离到的一种分子量为12000±1KD的多肽，它具有可作为胶原蛋白依赖性血小板粘附的抑制剂的生物活性。
2.权利要求1中的多肽，其等电点为pH3.7±0.5。
3.权利要求1或2中的多肽，它含有6个可形成二硫键的半胱氨酸。
4.权利要求1中的多肽，它含有SEQ.ID.NO.1的氨基酸序列。
5.含有权利要求4中的氨基酸序列的多肽，它与SEQ.ID.NO.1的氨基酸序列在全部长度上有80％的同一性。
6.编码权利要求1-5中的多肽的分离多核苷酸。
7.含有SEQ.ID.NO.2 DNA序列或含有与该DNA序列互补的的DNA序列的分离多核苷酸，此处所指的该核苷酸可编码权利要求1-5之一中的多肽。
8.权利要求7中的多核苷酸，此处该核苷酸含有的DNA序列与SEQ.ID.NO.1在全部长度上至少有80％的同一性。
9.含有权利要求6-8的DNA序列的表达载体。
10.含有权利要求9的表达载体的宿主细胞。
11.含有权利要求10的宿主细胞的表达体系。
12.制备权利要求1-5之任一中的多肽的方法，它包含权利要求10的宿主细胞，也包括在可充分制备该多肽并从培养上清液或细胞残留中回收该多肽的条件下培养该宿主。
13.权利要求1-5之任一中的多肽的免疫特异性抗体。
14.一种药用制剂，它含有权利要求1-5之任一中的多肽及药物学上可接受的载体或赋形剂。
15.权利要求14的可用于血栓栓塞疾病治疗的药物活性因子。
16.权利要求14或15中的药物制剂，它含有额外添加的药物，此处的额外添加药物选自阿司匹林、肝素或链激酶，或其组合。
17.权利要求1-5之一中的多肽在制备可用于治疗血栓栓塞疾病中的应用。
18.权利要求1-5之一中的多肽在包被人造表面中的应用。
19.权利要求1-5之一中的多肽来修饰眼内晶状体，从而缓解晶状体物质的血栓产生中的应用。
20.权利要求1-5之一中的多肽在与晶状体表面接触中的应用。
21.权利要求1-5之一中的多肽在共价交联以修饰该晶状体物质中的应用。
22.权利要求13中的抗体和权利要求1-5之一中的多肽在检测源自权利要求12或待治疗对象的样品中的应用。
23.通过观察结合或对功能性反应的刺激或抑制来鉴定化合物的方法，而这样的化合物可抑制(拮抗)或激动权利要求1-5中的多肽。
24.利用权利要求23中的方法鉴定的一种激动剂。
25.利用权利要求23中的方法鉴定的一种拮抗剂。
全文摘要
本发明描述了一种从医用水蛭的唾液中分离的天然蛋白,这种蛋白可与胶原蛋白强烈结合,从而可作为与胶原蛋白粘附的血小板的抑制剂。此蛋白的分子量约为12000,具有酸性等电点,并且含有六个半胱氨酸。对此蛋白进行了测序,并且从医用水蛭的cDNA文库中克隆到了它的基因。通过重组技术制备这种蛋白的方法已经公开。此重组体和天然蛋白是依赖胶原蛋白的血小板粘附的有效抑制剂,因此对于治疗循环系统疾病和顽固疾病相关的病况的治疗很有效。进一步,此蛋白可有效的包被天然于人工胶原蛋白的表面,从而防止细胞粘附和细胞的活化。
文档编号C12N15/12GK1344318SQ00805211
公开日2002年4月10日 申请日期2000年3月10日 优先权日1999年3月18日
发明者W·斯特里特马特, D·居索, U·霍夫曼, J·赫姆贝尔格, Z·福特夫, B·舍伊布勒 申请人:默克专利股份公司