专利名称：脂肪酶变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及适于在洗涤剂组合物中使用的脂肪酶变体。更特定地，本发明涉及来自Humicola lanuginosa菌株DSM4109的野生型脂肪酶的显示一次洗净(first-wash)效应的变体。
背景技术：
数年来，脂肪酶作为洗涤剂用酶用于除去服装和其他织物上的脂类或脂肪污渍，具体地，一种得自于Humicola lanuginosa(EP258 068和EP305216)的脂肪酶以商品名立扑莱斯(Lipolase)(Novo Nordisk A/S产品)销售。
WO92/05249，WO94/25577，WO95/2261 5，WO97/04079和WO97/07202披露了H.lanuginosa脂肪酶的具有改进的洗涤特性的变体。因此，WO97/04079披露了在N-末端和/或C-末端带有附加肽段(延长物)的变体。WO97/07202披露了具有“一次洗净性能”的脂肪酶变体，它能够在一轮清洗中从被猪油污染的布样上除去大量的猪油。
总有需要在多种商业洗涤剂中提供具有改进的清洗特性的新脂肪酶。本发明涉及这类新的脂肪酶。
发明概述发明人发现立扑莱斯(野生型Humicola lanuginosa脂肪酶)的某些变体在洗涤剂溶液中会表现出极佳的一次洗净效果。此种脂肪酶可以进一步提供其它好处，例如保持白色和去黑。
发明人发现此种变体在三维结构的靠近N-末端含有一个或多个带正电的氨基酸的取代。此种变体应该进一步在C-末端含有一个附加肽段，和/或者在位置90-101和210符合对带电性氨基酸的限定。
因此，本发明提供了一种脂肪酶，该多肽具有以下氨基酸序列a)具有与得自Humicola lanuginosa菌株DSM4109的野生型脂肪酶至少90％的同一性；
b)与该野生型脂肪酶相比，其在三维结构表面E1或Q249的15之内，一个电中性或带负电的氨基酸为一个带正电的氨基酸所取代；且c)在C-末端包括一个附加肽段；且/或d)符合下列限定条件i)在该野生型脂肪酶的E210位置含有一个带负电的氨基酸；ii)在对应于该野生型脂肪酶位置90-101的区域含有一个带负电的氨基酸；且iii)在对应于该野生型脂肪酶N94的位置含有一个中性或带负荷电氨基酸且/或在对应于该野生型脂肪酶的位置90-101的区域带有负或中性净电荷。
发明详述Humicola lanuginosa脂肪酶在本发明中脂肪酶参照是得自Humicola lanuginosa菌株DSM4109的野生型脂肪酶。其在EP258 068和EP305 216中有描述，并且有在US5,869,438中SEQ ID NO2之位置1-269所示的氨基酸序列。在此说明书中，脂肪酶参照同样被称为立扑莱斯。
用带正电的氨基酸进行的取代本发明的脂肪酶中，在E1或Q249附近包含一个或多个(例如2-4个，尤其2个)由带正电的氨基酸(优选R)对电中性或带负电荷的氨基酸的取代。
取代位于三维结构表面，在E1或Q249的15距离内，例如在位置1-11，90，95，169，171-175，192-211，213-226，228-258，260-262中的任一个。
取代可以在E1或Q249的10距离内，例如在位置1-7，10，175，195，197-202，204-206，209，215，219-224，230-239，242-254中的任一个。
取代可以在E1的15距离内，例如在位置1-11，169，171，192-199，217-225，228-240，243-247，249，261-262中的任一个。
取代最优选在E1的10距离内，例如在位置1-7，10，219-224和230-239中的任一个。
因此，一些优选的取代是S3R，S224R，P229R，T231R，N233R，D234R和T244R。
C-末端的附加肽段脂肪酶可以含有一个连接在C-末端L269的附加肽段。此附加肽段改进了所述酶在多种洗涤剂中的一次洗净效果。
附加肽段优选由1-5个氨基酸，例如2，3或4个氨基酸组成。附加肽段的氨基酸将编号为270，271等。
附加肽段可以由电中性(例如疏水性)氨基酸组成，例如PGL或PG。在备选实施方案中，脂肪酶的附加肽段由中性(例如疏水性)氨基酸和氨基酸C组成，并且脂肪酶在合适的位置含有以C对一个氨基酸的取代，这样可以和附加肽段的C形成二硫键。例如270C连接到G23C或T37C271C连接到K24C，T37C，N26C或R81C272C连接到D27C，T35C，E56C，T64C或R81C位置90-101和210的氨基酸本发明的脂肪酶优选符合在位置90-101和210对带电性氨基酸的限定。符合电荷限定的脂肪酶在高阴离子含量的洗涤剂中特别有效。
因此，氨基酸210可以是带负电的。E210可以保持不变或者可以进行取代E210D/C/Y，尤其E210D。
脂肪酶可以在位置90-101(尤其94-101)中任一处含有带负电的氨基酸，例如在位置D96和/或E99。
此外，脂肪酶可以在位置N94含有中性或带负电的氨基酸，即N94(中性或负电性)，例如N94N/D/E。
同样，脂肪酶可以在90-101区域(尤其94-101)有净负电荷或为中性，即带负电的氨基酸数等于或多于带正电的氨基酸数。因此该区域与来自于立扑莱斯的区域可以保持不变，它有两个带负电氨基酸(D96和E99)和一个带正电氨基酸(K98)，并在位置94(N94)有一个中性氨基酸，或者此区域可由一个或多个取代修饰。
可选地，三个氨基酸N94，N96和E99中的两个可以带有负电或不改变的电性。这样，所有三个氨基酸可以是不改变的或由一个保守取代或负电性取代改变，即N94(中性或负电性)，D(负电性)和E99(负电性)。例如N94D/E和D96E。同样，可以取代此三个中的一个来提高荷电量，即N94(正电性)，D96(中性或负电性)或E99(中性或负电性)。例如N94K/R，D96I/L/N/S/W或E99N/Q/K/R/H。
用一个带负电的氨基酸取代中性的氨基酸(N94D/E)可以改进在阴离子型洗涤剂中的表现。用一个带正电的氨基酸取代中性的氨基酸(N94K/R)可以提供一种脂肪酶变体，它在阴离子型洗涤剂和阴离子/非离子型洗涤剂(在其所有表面活性剂中40-70％为阴离子型的洗涤剂)中都有良好表现。
在其他位置的氨基酸本发明人发现取代Q249R/K/H可以改进在阴离子型洗涤剂和阴离子/非离子型洗涤剂中的表现，中性或负电性氨基酸取代R209(例如R209P/S)可以改进在阴离子型洗涤剂中的表现。可选地，脂肪酶可以包含取代G91A。
可选地，脂肪酶可以包含一个或多个额外的氨基酸取代。这样的取代可以，例如根据本领域已知的原则进行，例如在WO92/05249，WO94/25577，WO95/22615，WO97/04079和WO97/07202中所述的取代。
取代的组合有良好一次洗净表现的脂肪酶变体可以由如下对立扑莱斯的修饰得到。括号中的取代是可选的。
对氨基酸修饰的命名法在此定义突变的命名法基本上与WO92/05249所述相同。因此，T231R指在231位用R取代T。PGL或270P+271G+272L指连接到C-末端(L269)的附加肽段PGL。
氨基酸分组在此说明书中，依照氨基酸在pH10(本发明洗涤剂的常用pH值)下的带电性将它们分为带负电荷的，带正电荷的或电中性的氨基酸。故带负电的氨基酸是E，D，C(半胱氨酸)和Y，尤其E和D。带正电的氨基酸是R，K和H，尤其R和K。中性氨基酸是G，A，V，L，I，P，F，W，S，T，M，N，Q和C(当成为二硫桥的一部分时)。用同一组(带负电荷，带正电荷或电中性)中的另一氨基酸进行取代称为保守取代。
中性氨基酸可分为疏水性(G，A，V，L，I，P，F，W和C(作为二硫键组成部分))和亲水性(S，T，M，N，Q)。
氨基酸同一性本发明的脂肪酶变体与立扑莱斯有至少90％(优选大于95％或大于98％)的氨基酸同一性。
可借助本领域所知的计算机程序进行同一性程度的测定，例如在GCG软件包(Wisconsin软件包程序手册，第8版，1994年8月，遗传学计算机组，575Science Drive，Madison，Wisconsin，美国，USA53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物学杂志，48，443-45)中提供的GAP程序，GAP采用下面的设置进行多肽序列的比较GAP creation penalty(缺口产生罚分)为3.0以及GAP extension penalty(缺口延伸罚分)为0.1。
脂肪酶的DNA序列，表达载体，宿主细胞，及其生产本发明提供编码本发明脂肪酶的DNA序列，载有此DNA序列的表达载体，以及含有此DNA序列或此表达载体的转化的宿主细胞。这些都可以通过本领域所知的方法得到。
本发明同样提供生产脂肪酶的方法，其通过在有益于脂肪酶产生的培养条件下培养转化细胞并从所得培养液中回收所述脂肪酶。该方法可以依照本领域所知的方法进行。
洗涤剂添加剂依照本发明，脂肪酶通常可作为洗涤剂组合物中的添加剂使用。此添加剂可以方便地配制成不起尘颗粒，已稳定的液体，浆状或受保护的酶。添加剂可以按照本领域所知的方法制备。
洗涤剂组合物本发明的洗涤剂组合物可以配制成，例如手洗或机洗洗涤剂组合物，其包括洗衣添加剂组合物，以及适于对污染的织物进行预处理的组合物，漂洗添加型织物柔软剂的组合物，用于通常家庭中硬表面和碗碟清洗的组合物。
本发明的洗涤剂组合物包含本发明的脂肪酶和一种表面活性剂。此外，可选择含有助洗剂，另一种酶，抑泡剂，柔软剂，抗脱色剂和洗涤剂中常用的其它成分，例如污渍悬浮剂，污渍释放剂，增亮剂，研磨剂，杀菌剂，除亮剂，着色剂，和/或胶囊或非胶囊型香味剂。
本发明的洗涤剂组合物可以是液态，糊状，胶状，条状或粒状形式。pH(在使用浓度下的水溶液中所测)通常是中性或碱性，例如范围为7-11，尤其9-11。本发明的粒状组合物还可以是一种“紧密形式”，即比传统粒状洗涤剂有相对更高的密度，即500-950g/l。
本发明的脂肪酶，或掺入洗涤剂组合物的另一备选酶，在洗涤剂组合物中通常的含量水平为从0.00001％到2％酶蛋白(以组合物重量计)，优选为0.0001％到1％酶蛋白(以组合物重量计)，更优选为0.001％到0.5％酶蛋白(以组合物重量计)，更进一步优选为0.01％到0.2％酶蛋白(以组合物重量计)。
本发明的洗涤剂组合物中脂肪酶含量为每克洗涤剂10-50,000LU，优选20-5,000LU/g，例如100-1000LU/g。该洗涤剂可溶于水，得到的清洗液中脂解酶含量为每升清洗液25-15,000LU，尤其100-5000LU/1，例如300-2000LU/1。脂肪酶蛋白的量为每克洗涤剂中0.001-10mg或每升清洗液中0.001-100mg。
更具体地，本发明的脂肪酶可掺入以下所述洗涤剂组合物中WO97/04079，WO97/07202，WO97/41212，PCT/DK WO98/08939，WO97/43375。
表面活性剂系统表面活性剂系统可包含非离子型，阴离子型，阳离子型，两性电解质型，和/或两性离子型表面活性剂。如上所述，本发明的脂肪酶变体特别适于含有阴离子表面活性剂与非离子表面活性剂之组合的洗涤剂，其中阴离子表面活性剂占重量的70-100％，非离子表面活性剂占重量的0-30％，尤其含有80-100％的阴离子表面活性剂和0-20％的非离子表面活性剂。正如进一步所述，本发明的一些优选的脂肪酶同样适合于含40-70％阴离子表面活性剂和30-60％非离子表面活性剂的洗涤剂。
表面活性剂通常展总重量的0.1-60％，例如1％到40％，尤其10-40％，优选从约3％到约20％。一些表面活性剂的例子如下所述。
阴离子型表面活性剂优选阴离子型表面活性剂包括烷基硫酸盐，烷基乙氧基硫酸盐，线性烷基苯磺酸盐以及它们的混合物。
烷基硫酸盐表面活性剂是水溶性盐或酸，分子式ROSO3M，其中R优选是C10-C24烃基，优选烷基或带C10-C20烷基部分的羟烷基，更优选C12-C18烷基或羟烷基，此外M是H或阳离子，例如碱金属阳离子(例如钠，钾，锂)，或铵或取代型铵。
优选烷基苯磺酸盐，特别是线性(直链)烷基苯磺酸盐(LAS)，其中烷基优选包含10到18个碳原子。
适合的阴离子型表面活性剂包括烷基烷氧基硫酸盐，它是水溶性盐或酸，分子式RO(A)mSO3M，其中R是未取代的C10-C24烷基或带有C10-C24烷基部分的羟烷基，优选是C12-C20烷基或羟烷基，更优选C12-C18烷基或羟烷基，A是乙氧或丙氧基，m大于零，通常在约0.5到约6之间，更优选在约0.5到约3之间，M是H或阳离子，例如金属离子(例如钠，钾，锂，钙，镁等)，铵或取代型铵阳离子。烷基乙氧基硫酸盐与烷基丙氧基硫酸盐均在此予以考虑。取代型铵阳离子的具体实例包括甲基，二甲基，三甲基铵阳离子和季铵盐阳离子，比如四甲基铵和二甲基哌啶阳离子以及从烷基胺得到的那些，如乙胺，二乙胺，三乙胺，其混合物及类似物。
其它的阴离子表面活性剂包括皂盐(包括，例如钠，钾，铵和取代型铵盐，如单、二、和三乙醇胺盐)，C8-C22伯或仲烷基磺酸盐，C8-C24烯属磺酸酯，磺化多元羧酸(通过碱土金属柠檬酸盐热解产物的磺化制备)。
非离子型表面活性剂表面活性剂可包括烷基酚类的聚亚烷基氧化物(例如聚环氧乙烷)缩合物。烷基可在直链或支链中包括约6到约14个碳原子。每摩尔烷基酚中环氧乙烷的量等于约2到约25摩尔。
表面活性剂可以含有伯和仲脂肪醇与约1到约25摩尔环氧乙烷的缩合产物。脂肪醇的烷基链可以是直链或支链，通常包含约8到约22个碳原子。
此外，非离子型表面活性剂可包含烷基酚的聚环氧乙烷缩合物，伯和仲脂肪醇与从约1到约25摩尔环氧乙烷的缩合产物，烷基多糖，以及其混合物。最优选是有3到15个乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧基化物，和有2到10个乙氧基的C8-C18脂肪醇乙氧基化物(优选平均为C10)，以及其混合物。
优选的非离子型表面活性剂是脂肪醇乙氧基化物，醇酚乙氧基化物，多羟基脂肪酸酰胺，烷基多聚葡萄糖苷，以及它们的混合物。
实施例在阴离子洗涤剂中不同剂量的一次洗净效果制备本发明的下面5种变体并用3种染污的布条进行实验，亲本脂肪酶也包括在内以作比较
市售US洗涤剂有高含量的阴离子表面活性剂，将其加热使其中的酶失活，以1.4g/l的用量在Tergot-o-meterTM实验型清洗机上使用。用水硬度6°dH(Ca∶Mg 2∶1)，清洗条件为30℃下12分钟一轮，随后在滤纸上干燥过夜。脂肪酶变体添加剂量为6400和12800LU/l。分两次洗涤(相同的TOM)进行重复测定。
下面的三种织物染污实验是新制的400型棉布上的Lard/Sudan Red；聚酯/棉布上的wfk20-LS口红；棉布上的wfk10-LS口红。首轮洗涤后，检测460nm下的减退值(remission)来对污渍的去除进行评价，所得结果减去不含酶的空白的减退值，表示为ΔR。
结果表明，每一变体在每一剂量下对每一种染污的布条都表现出改进的一次洗净效果(ΔR值为5-13)，而亲本酶在同样的条件下基本没有效果(ΔR＝0±2)。
权利要求
1.一种脂肪酶，它是具有下述氨基酸序列的多肽a)具有与得自Humicola lanuginosa菌株DSM4109的野生型脂肪酶至少90％的同一性；b)与该野生型脂肪酶相比，其在三维结构表面距E1或Q249 15之内一个电中性或带负电的氨基酸为一个带正电的氨基酸所取代；且c)在C-末端包括一个附加肽段；且/或d)符合下列限定条件i)在该野生型脂肪酶的E210位置含有一个带负电的氨基酸；ii)在对应于该野生型脂肪酶90-101位的区域含有一个带负电的氨基酸；且iii)在对应于该野生型脂肪酶的N94位含有一个中性或带负电的氨基酸且/或在对应于该野生型脂肪酶90-101位的区域具有一个负或中性净电荷。
2.权利要求1的脂肪酶，其中该取代是在E1或Q249的10之内。
3.权利要求1或2的脂肪酶，其中该取代是在E1的15(优选10)之内。
4.前述的任一权利要求的脂肪酶，其含有2-4(优选2)个所述取代。
5.前述的任一权利要求的脂肪酶，其在E1的10之内一个电中性或带负电荷的氨基酸为R所取代。
6.前述的任一权利要求的脂肪酶，其中氨基酸S3，S224，P229，T231，N233，D234或T244为一个带正电荷的氨基酸，优选R所取代。
7.前述的任一权利要求的脂肪酶，其中附加肽段由1-5个氨基酸组成。
8.前述的任一权利要求的脂肪酶，其中附加肽段由电中性(优选疏水性)氨基酸，最优选PGL或PG组成。
9.权利要求1-7的脂肪酶，其中附加肽段由电中性(优选疏水性)氨基酸和C组成，并且该脂肪酶进一步含有用C对一个氨基酸的取代，这样可以与该附加肽段的C形成二硫键。
10.前述的任一权利要求的脂肪酶，其在该野生型脂肪酶的N94，D96和E99中任意两个位置的氨基酸带负电荷或电性不发生改变。
11.前述的任一权利要求的脂肪酶，其含有下述取代中的一个G91A，N94D/E/K/R，D96E/I/L/N/S/W，E99N/Q/K/R/H，N101S，R209P/S或Q249R/K/H。
12.前述的任一权利要求的脂肪酶，其含有下述取代组之一，并可选择与Q249R/K/H和/或K98X组合a)G91G/A/S/T+N94(中性或带负电)+D96D/E/C/Y+E99E/D/C/Y，b)G91G/A/S/T+N94(中性或带负电)+D96D/E/C/Y+E99N+N101S，c)G91G/A/S/T+N94R/K/H+D96D/E/C/Y+E99E/D/C/Y，d)G91G/A/S/T+N94(中性或带负电)+D96(中性或带正电)+E99E/D/C/Y，或e)G91G/A/S/T+N94(中性或带负电)+D96D/E/C/Y+E99(中性或带正电)。
13.权利要求1-11中任一项的脂肪酶，其含有下述取代组之一，并可选择与R209 (中性或带负电)组合a)E9 9R/H+Q249R/K/H，b)N94R/K/H+Q249R/K/H，或c)D96(中性或带正电)+Q249R/K/H。
14.一种洗涤剂组合物，其含有表面活性剂和权利要求1-11中任一项的脂肪酶。
15.前述权利要求的洗涤剂组合物，其中的表面活性剂含有阴离子表面活性剂，其量超过表面活性剂总重量的70％。
16.权利要求14的洗涤剂组合物，其中的表面活性剂含有占表面活性剂总重量之40-70％的阴离子表面活性剂和占表面活性剂总重量之30-60％的非离子型表面活性剂，所述脂肪酶为权利要求8或9的脂肪酶。
17.权利要求14-16中任一项的洗涤剂组合物，其中含有10-40％重量比的表面活性剂，优选含40-70％助洗剂，优选以0.5-5g/l溶于水时pH值为9-11。
18.一种DNA序列，其编码权利要求1-13中任一项的脂肪酶。
19.一种表达载体，其载有在先权利要求所述的DNA序列。
20.一种转化的宿主细胞，其含有权利要求18的DNA序列或权利要求19的表达载体。
21.权利要求1-13中任一项的脂肪酶的生产方法，该方法包括在益于产生所述脂肪酶的条件下培养权利要求20的转化的宿主细胞和从所得培养液中回收脂肪酶。
全文摘要
立扑莱斯(野生型Humicolalanuginosa脂肪酶)的特定变体在洗涤剂溶液中具有特别优良的一次洗净(first－wash)效果。在此类变体三维结构的靠近N－末端应该含有一个或多个带正电的氨基酸的取代。此类变体应该进一步在C－末端含有一附加肽段，和/或者应该符合在位置90－101和210对带电性氨基酸的特定限定。
文档编号C12N9/18GK1409760SQ00805950
公开日2003年4月9日 申请日期2000年3月30日 优先权日1999年3月31日
发明者杰斯珀·文德, 阿伦·斯文德森, 沙姆坎特·A·帕特卡, 金·V·安德森, 多特·A·哈尔基尔, 柯斯滕·博杰森 申请人:诺维信公司